Der Riss des vorderen Kreuzbandes ist die häufigste Lahmheitsursache der Hintergliedmaße beim Hund. In der Literatur werden verschiedene Operations-methoden zur Therapie des Kreuzbandrisses beschrieben. Ein dynamisches Verfah-ren stellt hierbei die TTA (Tibial Tuberosity Advancement) dar. Bei dieser Operation wird die Crista tibiae kranial verlagert, um einen Patellarsehnenwinkel (PTA) von 90° zum Tibiaplateau zu erreichen. In in vitro Untersuchungen konnte damit eine Aufhebung der kranio-kaudalen Scherkräfte, welche bei einem kreuzbandinsuffizienten Kniegelenk vorliegen, erreicht und die Stabilität des Kniegelenkes nach TTA wieder hergestellt werden. Ungeachtet dessen bestehen Hinweise auf eine persistierende Instabilität in vivo. Anhand der fluoroskopischen Kinematografie erfolgte eine Bewegungsanalyse der Kniegelenke von Hunden in vivo nach klassischer TTA sowie TTA-2. Zudem wurden mögliche Einflussfaktoren hinsichtlich des Erfolges der TTA-Technik untersucht. Die Arbeit ist in zwei Studien unterteilt. In der 1. Studie erfolgte die retrospektive Untersuchung von 10 Hundekniegelenken nach traditioneller TTA. Im Gegensatz dazu bezog sich die prospektive Studie 2 auf Kniegelenke nach einer TTA-2 Operation (n = 15). Die Hunde wurden orthopädisch untersucht und wiesen praeoperativ einen kompletten kranialen Kreuzbandriss auf. In der Arthroskopie bestätigte sich der komplette Riss und es erfolgte eine Untersuchung der Menisken, gegebenenfalls mit anschließender Meniskuschirurgie. In beiden Studien wurden die Hunde unilateral und uniplanar fluoroskopisch-kinematografisch untersucht, während sie im Schritt auf einem Laufband geführt wurden. Je Patient erfolgte eine Ganganalyse prae- und eine weitere 6-8 Wochen post operationem. Die Röntgenvideoaufnahmen wurden visuell von drei verschiedenen Untersuchern auf das Vorliegen einer kranio-kaudalen Translation beurteilt. Weiterhin wurden von allen Tieren der prae- und postoperative PTA sowie der Extensionswinkel bestimmt. Da ein aus der Literatur bekannter möglicher Einflussfaktor eine Unterkorrektur (PTA > 90°, zu kleine Cage-Größe) ist, wurde in der Studie 2 bei der Operationsplanung auf das Erreichen eines PTA ≤ 90° geachtet. In Studie 1 lag das mittlere Alter der Patienten bei 4,7 Jahren und das Gewicht bei 27,3 kg. Bei der arthroskopischen Untersuchung wiesen vier Gelenke Meniskusläsionen auf. Die postoperative Ganganalyse zeigte bei 90 % (9 von 10) eine persistierende Instabilität nach TTA, wobei der mittlere PTA 92,4° betrug. In der Studie 2 hatten die Tiere ein mittleres Alter von 7,0 Jahren und ein Gewicht von 31,2 kg. Bei der Mehrzahl der Patienten (n = 11) konnte ein Meniskusschaden diagnostiziert werden, wobei hauptsächlich mediale Korbhenkelrisse eine Rolle spielten. Die fluoroskopische Kinematografie zeigte bei 73,3 % der Patienten eine bestehende Instabilität nach TTA-2. Der mittlere PTA lag bei 88,5°. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der in vitro Untersuchungen ist die überwiegende Anzahl der Kniegelenke nach Versorgung eines kranialen Kreuzbandrisses mit TTA bzw. TTA-2 persistierend instabil. Ungeachtet dessen wiesen alle Patienten eine klinische Verbesserung der Lahmheit auf. Während die Er-gebnisse der Studie 1 noch eine Unterkorrektur (postoperativer PTA > 90°) als mögliche Ursache für die Kniegelenksinstabilität nahelegen, konnte dies im Rahmen der Studie 2 wiederlegt werden. Inwieweit die Menisken als stabilisierender Faktor eine Rolle spielen, kann anhand der vorliegenden Arbeit nicht eindeutig geklärt werden. / Cranial cruciate ligament ruptures are the most common cause of hind limb lameness in dogs. Various surgical therapeutical methods are described in the literature to successful cure the cranial cruciate ligament rupture. Amongst those the dynamic technique TTA (tibial tuberosity advancement) is described. During this procedure, the Crista tibiae is shifted cranially to produce a patellar tendon angle (PTA) of 90°. It has been shown during in vitro studies that cranio-caudal shear forces that occur after cranial cruciate ligament rupture are clearly neutralized. This results in a completely stable stifle after TTA. However, evidence for persistent instabilities after TTA exist in vivo. Fluoroscopic gait analysis of the canine stifle in vivo after treatment with classical TTA and TTA-2 was performed. Furthermore, potential factors influencing a successful outcome of the TTA-technique were examined. This study is subdivided in two parts. During the 1st study a retrospective analysis of 10 canine stifles after classical TTA was undertaken, while the 2nd study was performed prospectively on stifles treated with a TTA-2 (n = 15). The dogs were examined orthopedically prior to surgery and suffered from a complete cranial cruciate ligament rupture. This was confirmed by arthroscopy which was further used to evaluate the meniscal status and to perform a meniscal surgery, if necessary. Fluoroscopic-kinematographic gait analyses were carried out prior to and 6-8 weeks after TTA by unilateral and uniplanar recording on all dogs while they were walking on a treadmill. The video sequences were analysed regarding the presence or absence of cranio-caudal movement by three independent investigators. Moreover, the pre- and post-surgical PTA and stifle angle were recorded. According to the literature undercorrected stifles (PTA > 90°, inappropriate small cage size) were identified as a possible cause of post-surgical instability. Therefore, special emphasis paid on surgical planning during study 2 to achieve a PTA ≤ 90° by TTA-2. The mean age of the patients in the 1st study was 4.7 years and their mean body weight 27.3 kg. Four joints showed meniscal lesions during the arthroscopic examination. During fluoroscopic gait analysis a persistent instability after TTA was present in 90 % (9 of 10) of the stifles. The median PTA was 92.4°. In the 2nd study the mean body weight was 31.2 kg and the mean age 7.0 years. Meniscal injuries were diagnosed in the majority of the patients (n = 11). Most of them were suffering from medial bucket handle tears. After performing TTA-2 73.3 % of the stifles showed a persistent instability during the fluoroscopic gait analysis. The mean PTA was 88.5°. Contrary to the results of in vitro studies, the majority of stifles after treatment of a cranial cruciate ligament rupture with a TTA or TTA-2 remain to be persistently instable. Nevertheless, all dogs clinically improved regarding the degree of lameness. While the results of the 1st study suggest an undercorrection (post-surgical PTA > 90°) as a possible cause of stifle instability, this could not be proven during the 2nd study. The role of the menisci as a stabilizer of the canine stifle could not be finally elucidated by the present work.

Zielstellung: Ziel dieser kumulativen Dissertationsarbeit war die vergleichende Untersuchung der Wirtsantwort in verschiedenen Mauslinien nach Infektion mit Streptobacillus (S.) moniliformis und Rodentibacter (R.) pneumotropicus mit Anzeigeparametern für die Klinik, die Pathologie und die Immunantwort. Es sollten neue erregerspezifische enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) evaluiert und durch die Bestimmung der Immunglobulin G (IgG)-Subklassen mausstammspezifische Unterschiede in der Immunantwort aufgezeigt werden. Darüber hinaus waren Sentinelsysteme zu bewerten. Material und Methoden: Es wurden BALB/c und C57BL/6-Mäuse intranasal mit S. moniliformis- oder R. pneumotropicus infiziert und mit Kontaktsentinels vergesellschaftet. Zusätzlich wurde benutzte Einstreu der Infektionskäfige auf Käfige mit nichtinfizierten CD1-Mäusen (Einstreu-Sentinels) übertragen. Die Infektionsgruppen wurden über 4 Wochen, die Sentinels mindestens 7 Wochen alle 12 Stunden klinisch untersucht und die Verläufe dokumentiert. Am Ende der Experimente bzw. bei Erreichen spezifischer Abbruchkriterien wurden die Mäuse tierschutzgerecht euthanasiert und definierte Organproben für pathohistologische und bakteriologische Untersuchungen gewonnen. Die Erreger wurden dabei massenspektrometrisch sowie mittels polymerase chain reaction (PCR) differenziert und in Proben des Respirationstraktes quantitativ erfasst. Erregerspezifische Antikörper wurden in tracheonasaler Spülflüssigkeit und im Serum in eigens etablierten ELISA‘s auf Basis von Ganzzellextrakten bestimmt. Weiterhin erfolgte die Messung des Verhältnisses der IgG-Subtypen IgG1 und IgG2 im ELISA. Ergebnisse: Der Infektionsversuch mit S. moniliformis bestätigte mit einer Mortalität von 75% die bekannte hohe Infektionsanfälligkeit der C57BL/6-Mäuse im Gegensatz zu BALB/c, die keine Krankheitsanzeichen entwickelten. Die wichtigsten pathologischen Manifestationen waren eitrig-nekrotisierende Lymphadenitiden und Pneumonien in Verbindung mit der Reisolation des Infektionsstammes. Mithilfe des etablierten ELISA‘s gelang der Nachweis erregerspezifischer IgG-Antikörper im Serum der Tiere beider Linien. Bei den Kontaktsentinels konnte, bis auf eine Ausnahme, weder kulturell, noch serologisch eine Infektion nachgewiesen werden. Gleiches gilt für alle Einstreu-Sentinels. Molekularbiologisch wurde aber Erreger-DNA in den Lungen der Sentinels festgestellt. Die Infektion mit einem R. pneumotropicus Stamm, welcher genotypisch positiv für alle drei bekannten RTX-Toxine dieses Erregers war, führte zu einer unerwartet hohen Morbidität und Mortalität in beiden Mauslinien. In frühzeitig euthanasierten Tieren beider Linien konnten katarrhalisch-eitrige bis nekrotisierende Bronchopneumonien sowie eine Dissemination des Belastungsstammes in zahlreiche innere Organe nachgewiesen werden. In überlebenden Tieren beider Linien wurde eine deutliche Kolonisation respiratorischer Schleimhäute mit dem Belastungsstamm trotz z.T. hoher mukosaler IgA-Spiegel und Serokonversion im Blut nachgewiesen. Überlebende C57BL/6 Mäuse zeigten eine signifikant niedrigere Bakterienlast in inneren Organen als BALB/c Mäuse. In allen Kontaktsentinels, aber nicht in einem einzigen Einstreu-Sentinel, konnte kulturell und indirekt serologisch eine Infektion mit R. pneumotropicus nachgewiesen werden. Die Bestimmung der IgG-Subklassen in den Seren der C57BL/6-Mäuse beider Infektionsstudien ergab eine Verschiebung des Verhältnisses IgG2/IgG1 von unter 0,8 vor zu über 1,6 nach Infektion. Dies weist auf eine T-Helferzell (Th) 1-dominierte Immunantwort hin. BALB/c-Mäuse behielten dagegen ein Verhältnis unter 0,8 auch nach der Infektion bei, sodass auf eine Th2- Antwort zu schließen war. Schlussfolgerungen: Sowohl für S. moniliformis als auch für R. pneumotropicus konnten Tiermodelle mit diversen Anzeigeparametern etabliert werden, welche für Folgestudien zur Pathogenese oder Immunprophylaxe genutzt werden können. Für beide Erreger wurden neue sensitive und spezifische ELISA-Protokolle in die Diagnostik eingeführt. Kontaktsentinels, aber nicht Einstreu-Sentinels, sind gut geeignet, um R. pneumotropicus-Infektionen nachzuweisen. Die beobachtete stammspezifische Klinik, Pathologie und Immunantwort der C57BL/6-Mäuse nach experimenteller S. moniliformis-Infektion sprach für eine pathologische Th1-Immunantwort. Im Gegensatz dazu war im R. pneumotropicus – Infektionsversuch die Th1-Immunantwort der C57BL/6-Mäuse mit einer effektiveren Reduktion des Erregers in inneren Organen assoziiert. Die unerwartet hohe Morbidität und Mortalität im R. pneumotropicus –Infektionsversuch weist auf eine besonders hohe Virulenz des eingesetzten Stammes hin, sodass in dieser Arbeit erstmalig ein septikämischer Verlauf in Wildtyp-Mäusen nach intranasaler R. pneumotropicus-Infektion nachgewiesen werden konnte.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung / Objective: Aim of this cumulative doctoral thesis was the comparative analysis of the host response in different mice strains infected with Streptobacillus (S.) moniliformis and Rodentibacter (R.) pneumotropicus with readout parameters for clinics, pathology and immune response. New pathogen specific enzyme linked immunosorbent assay’s (ELISA) were evaluated. Differentiation of immunoglobulin (Ig) G subclasses was conducted to reveal differences in the immune response between the two mice strains. Furthermore, sentinel systems were assessed. Materials and methods: BALB/c and C57BL/6 mice were infected intranasally with S. moniliformis or R. pneumotropicus and housed together with contact sentinels. Soiled bedding from infection cages was transmitted to cages with uninfected CD1 mice (bedding sentinels). Infection groups were observed for 4 weeks, sentinels for at least 7 weeks and the clinical course was documented. At the end of the experiments or when predefined termination criteria were reached, animals were humanely killed. Predefined organ samples were collected for pathohistological and bacteriological screenings. Pathogens were differentiated via mass spectrometry and via polymerase chain reaction (PCR). The specific bacterial load was quantified in samples of the respiratory tract. Pathogen-specific antibodies were detected in tracheonasal lavages and sera using newly established ELISAs based on whole cell extracts. Determination of the ratios of the IgG subtypes (IgG1 to IgG2) was conducted using ELISAs. Results: The S. moniliformis experiment confirmed the known high susceptibility of C57BL/6 mice with a mortality of 75%. This was in contrast to BALB/c, which developed no signs of illness. The major pathologies were purulent-necrotizing inflammations of the lymph nodes and the lung associated with detection of the challenge strain. Specific IgG-antibodies were detected in sera of both mice strains by the newly established ELISAs. In contact and bedding sentinels the infection was not detected by culture or indirectly by serology, except for one contact sentinel. However, pathogen DNA was detectable in the lungs of these animals via PCR. The infection with the R. pneumotropicus strain, which is genotypically positive for all 3 known RTX toxins of this pathogen, leaded to an unexpected high morbidity and mortality in both mice strains. In early losses a catharal-purulent to necrotizing bronchopneumonia as well as dissemination of the challenge strain in various inner organs was recorded. Efficient colonization of the respiratory mucosa through the challenge strain was detected in survivors of both lines despite high mucosal IgA levels and seroconversion in the blood. Surviving C57BL/6 mice showed a significant lower bacterial burden in inner organs than BALB/c. All contact sentinels were culturally and serologically positive for R. pneumotropicus infection in contrast to all bedding sentinels. Differentiation of IgG subclasses in sera of C57BL/6 mice of both experiments revealed a shift of the IgG2/IgG1 ratio from 0.8 prior to infection to 1.6 post infection suggesting a T helper (Th) 1-prone immune response. BALB/c mice remained under 0.8 after infection indicating a Th2-prone immune response. Conclusions: New animal models with various readout parameters were established for both S. moniliformis and R. pneumotropicus. These models can be used in future studies on pathogenesis and immunoprophylaxis. Sensitive und specific ELISA-protocols were established for both pathogens. Contact sentinels but not bedding sentinels are appropriate for detection of R. pneumotropicus-infections. The observed distinct clinic, pathology and immune response of C57BL/6 mice experimentally infected with S. moniliformis indicated on the one hand a pathological Th1 immune response. On the other hand, the Th1 response of C57BL/6 mice to R. pneumotropicus infection was associated with a more efficient clearance of the challenge strain in internal organs. The unprecedented high morbidity and mortality in the R. pneumotropicus experiment indicates high virulence of this strain. Accordingly, this work revealed for the first time septicaemia in wildtype mice after intranasal R. pneumotropicus-infection.:Inhaltsverzeichnis (I) Abkürzungsverzeichnis (III) 1 Einleitung (1) 2 Literatur (3) 2.1 Streptobacillus moniliformis (3) 2.1.1 Allgemeine Charakteristika (3) 2.1.2 Differenzierung von Streptobacillus spp.(4) 2.1.3 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Streptobacillus moniliformis - Infektion (5) 2.1.4 Epidemiologie der durch Streptobacillus moniliformis hervorgerufenen Zoonose (6) 2.1.5 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion bei Nagetieren (8) 2.1.6 Klinik und Pathologie der Streptobacillus moniliformis-Infektion in Menschen und anderen Nebenwirten (9) 2.1.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (10) 2.1.8 Prävalenz in Nagern (11) 2.1.9 Sanierung Streptobacillus moniliformis infizierter Nagetierbestände und Prävention (12) 2.2 Rodentibacter (R.) pneumotropicus und heylii (Pasteurella (P.) pneumotropica Biotyp Jawetz und Heyl) (14) 2.2.1 Allgemeine Charakteristika (14) 2.2.2 Ursprüngliche Einteilung in Biotypen und Reklassifikation zu Rodentibacter spp. (14) 2.2.3 Differenzierung von Rodentibacter spp. (15) 2.2.4 Serologische Methoden zum indirekten Nachweis einer Rodentibacter- Infektion (15) 2.2.5 Übertragung (15) 2.2.6 Klinik und Pathologien der Rodentibacter-Infektion in Nagern (16) 2.2.7 Pathogenese und Virulenzfaktoren (18) 2.2.8 Prävalenz (19) 2.2.9 Sanierung Rodentibacter pneumotropicus infizierter Nagetierbestände und Prävention (20) 2.3 Mäuse als Versuchstiere (22) 2.3.1 Inzucht-Stämme (22) 2.3.1.1 Merkmale, Verwendung und Historie der BALB/c-Wildtypmäuse (22) 2.3.1.2 Merkmale, Verwendung und Historie der C57BL/6-Wildtypmäuse (23) 2.3.1.3 Unterschiede der Immunreaktionen in C57BL/6- und der BALB/c- Mäusen (23) 2.3.2 Auszucht-Stämme (24) 2.3.2.1 Merkmale, Verwendung und Historie der CD1-Wildtypmäuse (24) 2.4 Gesundheitsmonitoring in Labortierhaltungen (25) 2.4.1 Empfehlungen der Federation of Laboratory Animal Science Associations (FELASA) (25) 2.4.2 Sentinelsysteme für das Gesundheitsmonitoring in Labormausbeständen (26) 3 Publikationen (28) 3.1 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Eisenberg T, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis. Microbes and Infection. 2018;20(2):101-110 (28) 3.2 Fornefett J, Krause J, Klose K, Fingas F, Hassert R, Benga L, Grunwald T, Müller U, Schrödl W, Baums CG. Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain. BMC Microbiology. 2018;18(1):45 (39) 4 Übergreifende Diskussion (51) 5 Zusammenfassung (59) 6 Summary (61) 7 Literaturverzeichnis (63) 7.1 Fachliteratur (63) 7.2 Internet (76) 7.3 Gesetzestexte (78) Anhang (79) i Ergänzende Abbildungen (79) ii Ergänzendes Material zu 3.1 “Comparative analysis of clinics, pathologies and immune responses in BALB/c and C57BL/6J mice infected with Streptobacillus moniliformis” (81) iii Ergänzendes Material zu 3.2 “Comparative analysis of humoral immune responses and pathologies of BALB/c and C57BL/6 wildtype mice experimentally infected with a highly virulent Rodentibacter pneumotropicus (Pasteurella pneumotropica) strain” (83) Liste mit weiteren Veröffentlichungen Danksagung

Die equine Regenerationsmedizin versucht nach einer Sehnenverletzung (oberflächliche, tiefe Beugesehne: OBS, TBS) oder Bandverletzung (Fesselträger FT) die konsekutive Narbenbildung mit intraläsional applizierten potenziell regenerativen Therapeutika (prT) zu vermeiden. PrT sind mesenchymale stromale multipotente Progenitorzellen (MSC) aus unterschiedlichen Gewebequellen, sowie blutzellbasierende - meist Platelet Rich Plasma (PRP) - oder azelluläre Blutprodukte. Ein Langzeiterfolg ist noch nicht evident nachgewiesen; die Arbeit möchte dazu beitragen, die bestehende Lücke zu schließen. Die Arbeitsfrage lautet: Wie kann mit einer einzigen quantitativen Effektvariable bei Sportpferden, die nach einer natürlich entstandenen Erkrankung der OBS,TBS oder FT konservativ, mit kontrollierter Bewegung allein (KtrB) oder regenerativ (PrTB) behandelt werden, die ‚langfristige Gebrauchsfähigkeit’ (GF) valide gemessen und bisherige Studienergebnisse verglichen werden? Material: Inkludiert sind 51 in vivo Studien (1983-2016) entsprechend der Arbeitsfrage. Exkludiert sind in vivo Studien mit künstlich induzierten Erkrankungen, mit konventioneller oder chirurgischer Behandlung sowie in vitro Studien Methoden: Da die Studienergebnisse nicht direkt vergleichbar sind, wird ein evidenzbasiertes einfaches Evaluationsmodell mit der neuen quantitativen Effektgröße 'Gebrauchsfähigkeitsrate' GFR entworfen. Die metaanalytische gepoolte Reanalyse kann damit unabhängig von den Ergebnissen der Primärstudien die GF der Sportpferde neu bewerten. Als maßgebliche Einflussfaktoren auf GF werden u.a. definiert: Gewebestruktur, prT, sportliche Disziplin, Läsionsgrad, Altersklasse der Pferde, Prüfzeitdauer nach Rehabilitation zur Kontrolle des ‚Erfolgsmerkmals’ (EM) auf ein Rezidiv. Die Daten werden aus den Studien extrahiert und zu sog. Behandlungsgruppen (BehG) zusammengefasst. Nach Gewebestruktur (OBS-TBS, FT-Ursprung/-Körper/-Schenkel) und Behandlungsform (KtrB, PrTB) geordnete BehG werden soweit vergleichbar zu größeren BehG mit präziserem GFR gepoolt. Der Effektunterschied zwischen prT wird gegebenenfalls statistisch gesichert. Als EM ist definiert: 'Nach Rehabilitation kehren die Sportpferde zur Arbeit auf (mindestens) dem ursprünglichen Leistungsniveau zurück'. Die Erfolgsrate bzgl. EM ist E. In der Prüfzeitdauer nach Rehabilitation wird die Rezidivrate (R) ermittelt. E und R ergeben die Effektgröße GFR = E(1-R). Diese wird mittels 3 ganzzahliger Variablen A, B, C normiert: GFR = (N-A-B-C)/(N-A). A, B, C sind disjunkte Fallgruppen der N Patienten einer BehG. Die standardisierte Studiendauer ergibt sich aus der projektierten Rehabilitationsdauer (proj. Reha) und der ‚standardisierten Prüfzeit’ (P). Im Konsens mit den untersuchten Studien ist sie bei OBS-TBS 3 Jahre (1 Jahr proj. Reha + 2 Jahre P), beim FT 2,25 Jahre (0,75 Jahre proj. Reha + 1,5 Jahre P). Ergebnisse und Schlussfolgerung: Bei der OBS erscheint die Chance (OR, odds ratio) auf die zweijährige GF mit Amnion-MSC (2GFR = 94,1 %, n* = 34) 7-fach größer (OR = 7,2 [1,7-31,4]) sowohl vs. Knochenmark-MSC (2GFR = 68,8 %, n* = 145) als auch 9-fach größer (OR = 9,7 [2,1-45]) vs. PRP (2GFR = 60,4 %, n* = 51) sowie 11-fach größer (OR = 11,4 [2,5-52,1]) vs. KtrB (2GFR = 57,5 %, n* = 60). Erstmals kann bei diesen prT die Effektdifferenz dGFR > 25 % mittels Poweranalyse per Signifikanznachweis (Power >90 %; p < 0,025) durch die erforderliche Fallzahl statistisch gesichert werden. Allerdings stützt sich das Ergebnis für Amnion-MSC noch auf nur eine Studie. Bei TBS und FT fehlen Vergleichsgruppen noch. Da replizierbare wissenschaftliche Ergebnisse mit hoher interner und externer Evidenz nur mit standardisierten Parametern erzielt werden können, erscheint das GFR-Modell für zukünftige Studien von wesentlichem Interesse. / The equine regenerative medicine is seeking to avoid the subsequent scarring after a tendon (superficial and deep digital flexor tendon: SDFT, DDFT) or ligament (suspensory ligament: SL) injury by intralesionally applicated potential regenerative therapeutics (prT). PrT are mesenchymal stromal multipotential progenitor cells (MSC) from different sources of tissue, as well as products of blood, based on blood cells (PRP in most cases, platelet rich plasma) or acellular. Evidence of long-term treatment-success has not yet provided. This study wants to go towards closing the gap on this front. The leading question is: How can the 'long-term fit for use' (FfU) of sport horses, which are treated either conservatively with controlled exercise allone (CtrT) or regeneratively (PrTT) after suffering from naturally occuring tendinopathies of SDFT, DDFT or FT, be quantified in a valid way with a single effect variable? And how can the results of previous research studies be compared? Material: Includet are 51 in vivo studies (1983-2016) relating to the leading question. Excluded are in vivo studies with artificially induced lesions, with conventional or surgical treatment as well as in vitro studies. Methods: Findings of the studies are not directly comparable. As a consequence an evidence-based simple evaluation-model with the new quantitative effect size called ‘rate of fit for use’ (FFU) is developed. Based on this model the meta-analytical pooled re-analysis can re-assess FfU of the sport horses independently from findings of primary studies. The following influencing factors affecting FfU are defined: Structure of tissue, prT, sportive kind-of-use, degree of lesion, age class of horses, duration of monitoring after rehabilitation to controll the outcome (OC) for recurrence. The data are extracted from the studies and configured to so-called treatment groups (TGs). According to structure of tissue (SDFT, DDFT, SL-body, SL-origin, SL-branches) and kind of treatment (CtrT, PrTT) comparable TGs are pooled to bigger TGs with more precise FFU. If possible difference of effect between prTs is statistically assured. OC is defined as: 'After rehabilitation the sport horses return to work at (not less than) the initial level of performance'. Rate of OC is E. During duration of monitoring after rehabilitation the rate of recurrence (R) is checked. E and R are combined to FFU = E(1-R). In addition FFU is standardized in accord with the formula FFU = (N-A-B-C)/(N-A). A, B, C are integer variables representing disjunctive case groups of N, which is the total number of treated patients of a TG. The standardized duration of study results from the 'planned duration of rehabilitation' (planReha) and ‘standardized duration of monitoring’ (DoM). In consence with research studies it adds up to 3 years at SDFT-DDFT (1 year planReha +2 years DoM) and 2.25 years at SL (0.75 year planReha +1.5 years DoM). Results and conclusion: The chance (OR, odds ratio) with AM-MSC for biennial FfU (2FFU = 94.1 %, N-A = 34) appears to be more than at least 7-fold (OR = 7.2 [1.7-31.4]) as high as with BM-MSC (2FFU = 68.8 %, N-A = 145) as well as 9-fold (OR = 9.7 [2.1-45]) high as with PRP (2FFU = 60.4 %, N-A = 51) as well as 11-fold (OR = 11.4 [2.5-52.1]) high as with CtrT (2FFU = 57.5 %, N-A = 60). For the first time, power-analysis can statistically assure the difference of effect 25 % < dFFU (power > 90 %; p < 0.025) between these TGs through significant evidence based on the needed number of cases. However 2FFU with AM-MSC still relies on only 1 study. At DDFT and at LS comparison groups still are lacking. Because replicable scientific results with high internal and external evidence only can be approached based on standardized parameters, FFU-model seems to be essential for future studies.

Einleitung: Salmonellen und Yersinien haben als zweit- und dritthäufigste Verursacher bakterieller Gastroenteritiden in Deutschland und Europa im Jahr 2017 eine große Bedeutung als Lebensmittelinfektionserreger. Übertragen werden sie hauptsächlich durch den Verzehr roher, unzureichend gekühlter oder ungenügend erhitzter Schweinefleischerzeugnisse (Schweinemett, Hackepeter, kurz gereifte Rohwürste). Der Eintrag in die Lebensmittelkette erfolgt über symptomlose Trägertiere, die am Schlachthof in der Lebendund Fleischuntersuchung nicht als solche identifizierbar sind. Durch Kreuzkontaminationen kann es zur Verschleppung der Erreger auf die Schlachttierkörperoberflächen eigentlich gesunder Tiere kommen. Die vorherrschenden Hygienemaßnahmen am Schlachthof haben bisher nicht zu einer Verringerung des Auftretens dieser Bakterien geführt. Alternativ könnte gepulstes Licht (GL) als zusätzliches Dekontaminationsverfahren zum Einsatz kommen. Dessen antimikrobielle Wirksamkeit wurde bereits in zahlreichen Studien nachgewiesen. In der Literatur fehlten jedoch bislang Daten zur Inaktivierung von Salmonella ssp. auf Schwarte und Schweinelachs. Bezüglich Yersinia ssp. lagen noch gar keine Studien vor. Ziel der Untersuchungen: Ziel dieser Arbeit war es, die Inaktivierung beider Erreger auf oben genannten Matrices zu testen und, unter Berücksichtigung chemischer und sensorischer Attribute der Produkte sowie die Eignung des Verfahrens für die Praxis abzuschätzen. Material und Methoden: Für die Untersuchungen mit künstlich inokulierten Schwarte- und Schweinefleischproben wurden die humanpathogenen Bakterien S. Typhimurium und Y. enterocolitica (Biotyp 4) verwendet. Die antimikrobielle Wirkung von GL wurde bei Fluences zwischen 0,52 und 19,11 J/cm² geprüft. Farb- bzw. Temperaturveränderungen auf der Probenoberfläche wurden mit Hilfe eines Spektrophotometers (CM 600 d, Konica Minolta) respektive eines Infrarotthermometers (104 IR, Testo) ermittelt. Zur Beurteilung der Lipidoxidation wurde die TBARS-Methode angewandt und die Proben maximal 10 Tage bei 4° C gelagert. Veränderungen bezüglich des Geruchs wurden bei Fluences von 0.52, 4.96 und 12.81 J/cm² mittels eines Konsensprofils beurteilt. Ergebnisse: Auf Schwarte konnten innerhalb von Sekunden Reduktionen von 1,73-3,16 log (S.) und von 1,48-4,37 log (Y.), auf Schweinelachs hingegen 1,7 log-Stufen für beide Mikroorganismen erreicht werden. Moderate bis starke Behandlungsregime (≥7,36 J/cm²) führten zu einer deutlich wahrnehmbaren Farbveränderung (E*ab ≥ 3) von Schwarte, ab 9,66 J/cm² zu einem signifikanten Verlust des roten Farbanteils von Schweinelachs. Zur Bewertung einer forcierten Fettoxidation wurde Malondialdehyd (MDA) in den Proben quantitativ bestimmt. Keine der getesteten Einstellungen hatte eine Überschreitung des Grenzwertes von 0,5 μg/g, ab dem Testpersonen die Produkte als ranzig wahrnehmen, zur Folge. Eine Überprüfung des Geruches erfolgte anhand von drei getesteten Fluences, die eine niedrige (0,52 J/cm²), moderate (4,96 J/cm²) und starke (12,81 J/cm²) Behandlung repräsentieren sollten. Mit 0,52 J/cm² bestrahlte Schwarte wurde von den Panel-Mitgliedern als weniger nach Schwein und weniger fettig riechend bewertet und somit als angenehm empfunden, ansonsten wurden chemische Gerüche wahrgenommen. Schlussfolgerungen: Aus den erzielten Daten geht hervor, dass sich gepulstes Licht in niedrigen Dosen (≤0,52 J/cm²) zur Dekontamination von Schwarte eignet. Praktisch umsetzbar wäre dies am Schlachthof als geschlossene Behandlungskammer, unmittelbar nach der Eviszeration. Somit könnte der noch nicht geteilte Schlachtkörper oberflächlich behandelt werden, ohne das unter der Haut befindliche Fleisch zu erreichen und die oben genannten Veränderungen hervorzurufen. Notwendig ist hierbei die Gewährleistung des Arbeitsschutzes. In diesem Zusammenhang muss entstehendes Ozon unschädlich beseitigt werden und das Tragen einer UV-Schutzbrille in der unmittelbaren Umgebung des Gerätes angeordnet werden. Abschließend ist hervorzuheben, dass das GL als zusätzliche, unterstützende Maßnahme zur Bekämpfung von Lebensmittelinfektionserregern zu sehen ist und keine bestehenden Hygienemaßnahmen (gute Hygienepraxis) ersetzen darf. Aufgrund der geringeren Wirksamkeit auf Schweinelachs und den damit verbundenen geruchlichen Veränderungen ist eine Applikation auf Schweinefleisch ohne weiterführende Untersuchungen nicht zielführend.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72 / Introduction: Since Salmonella ssp. and pathogenic Yersinia ssp. were the second and third most frequent causes for bacterial gastroenteritis in Germany and throughout Europe in 2017 they are of high significance as foodborne infectious agents. They are mainly transmitted by consumption of raw, inadequately cooled or insufficiently heated pork meat products (ground pork, minced pork, shortly ripened raw sausages). Subclinically infected pigs, so-called “carriers”, cannot be detected during ante- and post-mortem inspection in the slaughterhouse. Cross-contamination can lead to bacterial dissemination onto actually S.- or Y.-free carcasses. Prevailing hygienic measures could not reduce bacterial prevalence in the abattoir so far. Thus, pulsed light (PL) may be used as an additional decontamination procedure. Its antimicrobial potential was proven in numerous studies. However, there are no data in the scientific literature about inactivation of Salmonella ssp. on pork skin and loin. Moreover, no experiments with Yersinia in connection with pulsed light have been performed until now. Aim of this study: Hence, the aim of this work was to investigate the inactivation of both microorganisms on above-mentioned matrices and to assess the suitability of the PL treatment for implementation in a slaughterhouse considering chemical and sensory alterations of the products. Materials and Methods: For experiments with artificially inoculated pork skin and loin samples human-pathogenic bacteria S. Typhimurium and Y. enterocolitica (Biotype 4) were used. The antimicrobial effect of PL was tested at fluences between 0.52 and 19.11 J/cm². Color and temperature changes on the sample surface were determined by means of a spectrophotometer (CM 600 d, Konica Minolta) or an infrared thermometer (104 IR, Testo). The TBARS method was used to assess lipid per-oxidation and the samples were stored at 4° C for a maximum of 10 days. Odor changes were appraised at fluences of 0.52, 4.96 and 12.81 J/cm² using consensus profiling. Results: On pork skin reductions of 1.73-3.16 log (S.) and of 1.48-4.37 log (Y.) were achieved within seconds. In contrast, on pork loin only 1.7 log of both microorganisms were maximally inactivated. Moderate to strong treatments (≥7.36 J/cm²) led to distinct color changes (E*ab ≥ 3) in pork skin, fluences above 9.66 J/cm² to a significant loss of red color in pork loin. For evaluation of possible accelerated lipid peroxidation malondialdehyde (MDA) was analyzed quantitatively in samples. None of the tested parameter combinations resulted in threshold value exceedance of 0.5 μg MDA/g which is the point where panel members start to perceive products as rancid. Odor appraisal was carried out using three fluences representing a mild (0.52 J/cm²), moderate (4.96 J/cm²) and strong (12.81 J/cm²) treatment. Pork skin treated with 0.52 J/cm² was assessed as less porky, less fatty and, thus, pleasant by panel members, apart from that chemical odors were perceived. Conclusions: From the available data it appears that pulsed light could be used in mild doses (≤0.52 J/cm²) for pork skin decontamination. Practically, a PL-unit could be designed as a closed chamber, implemented directly after the evisceration in the abattoir. This way, the not yet separated carcass could be treated superficially without reaching the meat surface preventing the above-mentioned alterations. Guarantee of safety at work also plays an important role. Emerging ozone must be evacuated safely and UV-protection glasses should be worn in direct proximity to the PL-system. Finally, one needs to consider, that PL should be regarded as an additional, supportive measure to control foodborne pathogens and not as a replacement for existing hygiene standards (good hygiene practice). An application on pork meat does not seem to be conducive because of its lower effect on pork loin and the associated odor changes.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ..............................................................................................III 1 EINLEITUNG ........................................................................................................... 1 2 LITERATURÜBERSICHT ........................................................................................ 3 2.1 Gepulstes Licht und gesetzliche Rahmenbedingungen ............................................. 3 2.2 Wirk- und Reparaturmechanismen, Resistenzbildung und Inaktivierungskinetik ....... 7 2.2.1 Photochemischer Effekt ................................................................................... 7 2.2.2 Photoreaktivierung ........................................................................................... 8 2.2.3 Photothermischer Effekt ................................................................................... 8 2.2.4 Physikalischer Effekt ........................................................................................ 9 2.2.5 Resistenzbildung .............................................................................................. 9 2.2.6 Inaktivierungskinetik ......................................................................................... 9 2.3 Einflussparameter ................................................................................................... 10 2.3.1 Mikroorganismus .............................................................................................10 2.3.2 Zeitpunkt der Bestrahlung ...............................................................................12 2.3.3 Matrix ..............................................................................................................12 2.4 Gepulstes Licht zur Inaktivierung von lebensmittelassoziierten Erregern in Fleischwaren .......................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung dieser Arbeit ......................................................................................... 17 3 VERÖFFENTLICHUNG ..........................................................................................18 3.1 Eigenanteil zur Veröffentlichung ............................................................................. 18 3.2 Publikation .............................................................................................................. 18 4 ÜBERGREIFENDE DISKUSSION ..........................................................................46 4.1 Eignung des Verfahrens „Gepulstes Licht“ zur Dekontamination von Schwarte und Schweinelachs ................................................................................................. 46 4.2 Vergleich von GL mit anderen Dekontaminationsverfahren .................................... 49 4.2.1 Chemische Dekontamination ...........................................................................49 4.2.2 Physikalische Dekontamination .......................................................................49 4.2.3 Biologische Dekontamination ..........................................................................50 4.3 Alternativer Einsatz von GL..................................................................................... 51 4.4 Schlussfolgerungen ................................................................................................ 51 5 ZUSAMMENFASSUNG ..........................................................................................53 6 SUMMARY .............................................................................................................55 7 LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................................57 ANHANG ..............................................................................................................................66 DANKSAGUNG ....................................................................................................................72

Einleitung Streptococcus (S.) suis verursacht bei Schweinen unter anderem Meningitis, Arthritis, Serositis und Endokarditis und ist eine der größten Herausforderungen für die Schweineindustrie. Von 29 beschriebenen Serotypen sind die Serotypen 2, 7 und 9 unter invasiven Isolaten weltweit besonders prävalent, vor allem in Europa. Bis heute gibt es keinen zugelassenen Impfstoff zur Prävention von S. suis-Erkrankungen in Europa, daher ist im Feld die Anwendung stallspezifischer Impfstoffe verbreitet. Diese bieten jedoch höchstens homologen Schutz und ihre Wirkung kann durch prädisponierende Faktoren wie eine Infektion mit dem porcine reproductive and respiratory syndrome Virus (PRRSV) beeinträchtigt werden. Daher hat sich die Forschung auf Antigene fokussiert, die potentiell heterologen Schutz vermitteln. Zielstellung Ziele der Studie waren die Charakterisierung vernachlässigter invasiver S. suis Pathotypen der wichtigen Serotypen 7 und 9 und die Etablierung neuer Infektionsmodelle im Schwein. Des Weiteren sollte die immunogene und protektive Wirkung des Immunoglobulin (Ig) M-degradierenden Enzyms von S. suis, IdeSsuis, im Serotyp 9 Infektionsversuch untersucht werden. Material und Methoden In dieser Arbeit wurden in vitro Versuche und experimentelle Infektionen im Schwein durchgeführt. Dazu gehörte die Geno- und Phänotypisierung von 22 S. suis Serotyp 7 Stämmen und vier Serotyp 9 Stämmen. Die Genotypisierung erfolgte mittels multiplex (MP) Polymerase-Kettenreaktion (PCR), einer PCR zur Differenzierung verschiedener Genvarianten des muramidase-release protein (MRP) sowie mittels multilocus sequence typing (MLST). Zur Phänotypisierung der S. suis Stämme wurden bactericidal assays eingesetzt, die als Bakteriämiemodell fungierten. Auf diese Weise konnten die Empfänglichkeit gegenüber S. suis Stämmen sowie deren Virulenz beurteilt werden. Durch Zugabe von rekombinantem (r) IdeSsuis wurde die Rolle adaptiven IgMs in der Begrenzung der Bakteriämie untersucht. Anhand von Western Blot Analysen erfolgte die Untersuchung der Expression und Funktionalität von IdeSsuis sowie die Expression von MRP in S. suis Serotyp 7 Stämmen. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) kamen zum Einsatz, um die Entwicklung von IgM und IgG Spiegeln in Ferkeln im zeitlichen Verlauf und die IgG Spiegel nach rIdeSsuis Immunisierung zu messen. Durch rIdeSsuis Immunisierung induzierte Antigen-spezifische T-Helferzellen (Th-Zellen) wurden mithilfe der Durchflusszytometrie untersucht. Schließlich erfolgte die Durchführung zweier S. suis Serotyp 7 Etablierungsversuche mit je 18 bzw. 5 Ferkeln sowie zwei S. suis Serotyp 9 Impf- und Infektionsversuche mit je 18 Ferkeln. Sektionsproben wurden histologisch untersucht. In einem Fall wurde eine Endokarditis mittels fluorescence in situ hybridization (FISH) charakterisiert. Ergebnisse Die meisten untersuchten Serotyp 7 Stämme gehörten dem Sequenztyp (ST) 29 an, einem emerging pathotype in Europa. Trotz der engen phylogenetischen Verwandtschaft, war mrp in den Stämmen sehr variabel. Phänotypisch bildeten alle Stämme gleichermaßen eine kleine MRP Variante, MRPs. Für vier ausgewählte Serotyp 7 Stämme wurde die Expression von IdeSsuis gezeigt, jedoch mit Unterschieden in Größe und Funktionalität. Bactericidal assays dieser vier Stämme zeigten starke Proliferation im Blut von Absatzferkeln, aber Abtöten im Blut von Läuferschweinen aus zwei Herden mit unterschiedlichem S. suis Status. Dieses Überlebensmuster unterschied sich deutlich von dem eines Serotyp 9 Stammes. Durch Zugabe von rIdeSsuis, konnte gezeigt werden, dass das Abtöten der Serotyp 7 Stämme im Blut von Läuferschweinen des infizierten Bestandes IgM-vermittelt war. Unabhängig von der Herkunft entwickelten sich die IgM Spiegel in den Ferkeln im zeitlichen Verlauf fast synchron. Schließlich konnte die Virulenz eines Serotyp 7 Stammes in einem intravenösen Infektionsversuch mit 5 Ferkeln gezeigt werden. Alle Tiere entwickelten schwere Symptome einer S. suis Erkrankung. In einem Impf- und Infektionsversuch mit einem hoch virulenten Serotyp 9 Stamm wurde die immunogene und protektive Wirkung einer rIdeSsuis Immunisierung untersucht. Neun Ferkel wurden mit rIdeSsuis oder einem Placebo prime-boost-boost immunisiert und zwei Wochen später infiziert. Neunzig Prozent der Placebotiere entwickelten schwere Symptome einer S. suis Erkrankung und starben oder mussten aus Tierschutzgründen euthanasiert werden. Alle geimpften Tiere überlebten den Versuch, fielen jedoch mit Fieber und Lahmheiten auf. Es konnte also gezeigt werden, dass eine rIdeSsuis Immunisierung vor Mortalität, nicht aber Morbidität durch den Infektionsstamm schützt. Alle immunisierten Ferkel serokonvertierten und Antigen-spezifische Th-Zellen wurden nachgewiesen. Weder die IgG Antwort noch die Th-Zell Antwort wurde jedoch durch die Infektion verstärkt. In einem weiteren Impf- und Infektionsversuch mit einem anderen Serotyp 9 Stamm fiel ein Tier am 11. Tag nach der Infektion mit Zeichen einer akuten Leptomeningitis auf, nachdem es zuvor klinisch völlig unauffällig war. In der Sektion des Tieres wurde eine Endokarditis der Mitralklappe diagnostiziert, die mit Biofilm-Bildung assoziiert war, was mithilfe von Histologie und FISH gezeigt werden konnte. Zusätzlich wurde eine fibrinopurulente Leptomeningitis diagnostiziert. Das Ferkel hatte Antikörper gegen rIdeSsuis und tötete den Infektionsstamm ex vivo im Blut ab. Schlussfolgerungen In dieser Arbeit habe ich zwei wichtige S. suis Pathotypen charakterisiert: S. suis Serotyp 7 Stämme des ST29 und einen hoch virulenten Serotyp 9 Stamm vom ST94. Die Serotyp 7 Stämme stellten einen besonderen Pathotypen dar, bei dessen Bekämpfung IgM eine wichtige Rolle spielt. Bei einer Serotyp 9 Infektion konnten trotz des Abtötens der Bakterien im Blut und opsonisierender Antikörper Biofilmbildung und eine folgende akute Leptomeningitis nicht verhindert werden. Letztlich wurde Schutz vor einem hoch virulenten Serotyp 9 Stamm durch rIdeSsuis Immunisierung und damit zum ersten Mal für ein Antigen Protektion vor den wichtigen Serotypen 2 und 9 aufgezeigt. Dies ist ein vielversprechendes Ergebnis hinsichtlich der Entwicklung eines Impfstoffes gegen S. suis. / Introduction Streptococcus (S.) suis causes meningitis, arthritis, serositis and endocarditis and is one of the biggest challenges for the swine industry. Of 29 described serotypes, the serotypes 2, 7 and 9 are highly prevalent amongst invasive S. suis isolates worldwide, especially in European countries. To date, no commercially produced vaccine is available in Europe for prevention of S. suis disease, thus the use of autogenous vaccines in the field is common. However, bacterins may at most confer homologous protection and their efficacy may be influenced by predisposing factors such as an infection with the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Research has therefore focused on subunit vaccines with the potential to elicit cross-protection against various serotypes. Aim of the study The objective of this study was to characterize neglected invasive S. suis pathotypes of the important serotypes 7 and 9 and to establish infection models in the main host of S. suis, the pig. A further aim was to investigate immunogenicities and protective efficacies of the immunoglobulin (Ig) M-degrading enzyme of S. suis, IdeSsuis, in a serotype 9 challenge experiment. Materials and methods In vitro experiments and experimental challenges in swine were conducted as part of this thesis. This included the geno- and phenotyping of 22 S. suis serotype 7 strains and four serotype 9 strains. Genotyping was conducted using a multiplex (MP) polymerase chain reaction (PCR), a PCR for differentiation of variants of the muramidase-released protein (MRP) gene and multilocus sequence typing (MLST). For phenotyping of the S. suis strains, bactericidal assays were carried out which served as a model for bacteraemia. This way, susceptibility to S. suis strains and virulence of different strains was assessed. Further, through addition of recombinant (r) IdeSsuis, the role of adaptive IgM in limiting bacteraemia was elucidated. Western blot analyses were conducted to investigate expression and functionality of IdeSsuis as well as expression of MRP in S. suis serotype 7 strains. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA) were used to determine the development of IgM and IgG levels in piglets over time and to assess IgG levels following rIdeSsuis immunization. Antigen-reactive T-helper (h) cells induced by rIdeSsuis immunization were investigated using flow cytometry. Finally, two experiments to establish a serotype 7 infection model with 18 and 5 piglets each and two vaccination and challenge experiments using different S. suis serotype 9 strains (n=18 piglets/ experiment) were conducted. Samples of dissected animals were examined histologically. In one case, an endocarditis was analysed using fluorescence in situ hybridization (FISH). Results Most of the investigated serotype 7 strains belonged to sequence type (ST) 29 which was thus shown to be an emerging pathotype in Europe. Despite the close phylogenetic relation of the strains, mrp was highly variable. Phenotypically, all strains expressed a small variant of MRP, MRPs. Four selected serotype 7 strains were shown to express IdeSsuis with differences in size and functionality. Bactericidal assays of these four strains revealed high proliferation in blood of weaning piglets but killing in blood of growing piglets of two herds which differed in their S. suis infection status. This survival pattern was distinct from a serotype 9 strain. Addition of rIdeSsuis revealed that killing of the serotype 7 strains in blood of growing piglets of the infected herd was IgM-mediated. Independent of the originating herd, IgM levels of the piglets rose almost synchronous over time. Finally, the virulence of a serotype 7 strain was proven in an intravenous challenge experiment with five pigs which all developed severe clinical signs of S. suis disease. In a vaccination and challenge experiment using a highly virulent serotype 9 strain, immunogenicities and protective efficacies of rIdeSsuis immunization were investigated. Nine piglets were prime-boost-boost vaccinated with rIdeSsuis or placebo-treated and challenged two weeks later. Ninety per cent of the placebo-treated piglets developed severe clinical signs of S. suis disease and died or had to be euthanized due to animal welfare reasons. All vaccinated piglets survived the experiment, however elevated body temperatures and lameness were also noted in this group. Accordingly, rIdeSsuis vaccination protected from mortality but not morbidity caused by the challenge strain. Seroconversion of the immunized piglets and antigen-reactive Th cells were detected. Neither the IgG response nor the Th cell response was boosted through the challenge. In a further vaccination and challenge experiment with a different serotype 9 strain, one animal was clinically unobtrusive following infection and then developed an acute leptomeningitis on the 11th day post infection and had to be euthanized. Dissection of the animal revealed an endocarditis on the mitral valve which was proven to be associated with biofilm formation by histology and FISH. In addition, a fibrinosuppurative leptomeningitis was diagnosed. The piglet had specific antibodies against rIdeSsuis and mediated killing of the challenge strain in a bactericidal assay. Conclusions In this thesis, I characterized two important pathotypes: S. suis serotype 7 strains of ST29 and a highly virulent serotype 9 strain of ST94. The serotype 7 strains represent a distinct pathotype and IgM plays a significant role in their control. Following a serotype 9 infection, biofilm formation and a subsequent acute leptomeningitis could not be prevented despite blood bactericidal activity and opsonizing antibodies. Finally, protection against challenge with a highly virulent serotype 9 strain through rIdeSsuis immunization was demonstrated. Thereby, for the first time an antigen was shown to confer cross-protection against the important serotypes 2 and 9, which is highly encouraging regarding the development of a vaccine against S. suis.

Einleitung: In der Tiermedizin sind nahezu 800 erblich bedingte Erkrankungen bekannt. Praktisch alle Hunderassen leiden unter solch einer Erkrankung. Für die Ausprägung der Brachyzephalie gibt es derzeit keinen eindeutigen Hinweis auf eine zugrundeliegende Genveränderung. In der Humanmedizin ist die kongenitale Brachyzephalie Folge einer Kraniosynostose (vorzeitigen Verknöcherung einer oder mehrerer Schädelnähte). Für die verschiedenen syndromalen Kraniosynostosen sind die verantwortlichen Gendefekte bereits definiert. In der Tiermedizin können in Analogie entsprechende Kandidatengene postuliert werden. Ob Veränderungen in diesen Kandidatengenen tatsächlich zu einer vergleichbaren klinischen Ausprägung der kaninen Brachyzephalie führen, wurde für das FGFR2-Gen in dieser Arbeit untersucht. Ziel: Ziel dieser Arbeit war es die Hypothese zu prüfen, dass Veränderungen in Genen, die bekannterweise bereits in der Humanmedizin in Zusammenhang mit genetisch bedingter Brachyzephalie stehen, auch für die kanine Brachyzephalie als Kandidatengene fungieren können. Tiere und Methoden: Für die Untersuchungen wurden EDTA-Blutproben und Maulschleimhautabstriche verwendet. Insgesamt wurde eine Gruppe von 106 Tieren untersucht, davon waren 51 Tiere vom Phänotyp normozephal und umfassten 33 verschiedene Rassen. 55 Tiere entsprachen dem brachyzephalen Phänotyp, gehörten zu den Rassen FB, Mops, EB, BT und OEB und wurden in der Klinik für Kleintiere der Universität Leipzig zur Behandlung eines BAS vorstellig. Die Proben wurden am Institut für angewandte Humangenetik und Onkogenetik durch die Autorin weiterverarbeitet. Die Auswahl eines geeigneten Kandidatengens erfolgte durch den Vergleich des humanen und kaninen Phänotyps und der klinischen Merkmale von an Kraniosynostose-Syndromen erkrankten Menschen mit brachyzephalen Hunden sowie anhand von Literaturrecherche. Die DNA wurde isoliert, amplifiziert und nach Erstellung der für das Kandidatengen spezifischen Primer, sequenziert und analysiert. Ergebnisse: Sowohl der phänotypisch-klinische Vergleich zwischen humaner und kaniner Brachyzephalie als auch die Literaturrecherche ergaben, dass das FGFR2-Gen ein ideales Kandidatengen darstellt. Die Erstellung spezifischer Primer für den proteincodierenden Bereich dieses Gens war erfolgreich. Die Sequenzanalyse identifizierte 3 Lokalisationen auf 2 der 17 sequenzierten Exon-Abschnitte des kaninen FGFR2-Gens, die eine Sequenzabweichung aufwiesen. Sie wurden im Folgenden als Varianten VarE2, VarE7 und VarE7AB bezeichnet. Es gab einen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen dem Auftreten aller 3 Varianten und der Gruppe „Rasse Brachyzephal“ (Chi2-Wert > 3,841, p-Wert < 0,05), jedoch keinen Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Varianten und der Normozephalen-Gruppe. Ein Zusammenhang der VarE2 und der Patientengruppe (Normo-/Brachyzephal) konnte ebenfalls ausgeschlossen werden, somit auch der Zusammenhang dieser Variante mit dem Auftreten des brachyzephalen Phänotyps. Die VarE7 trat bei 53 % (29/55) der Brachyzephalen-Gruppe auf. Innerhalb der Gruppe wies die FB mit 90 % (19/21) den höchsten Wert auf, diesem stand der Mops mit einem Auftreten der Variante von nur 22 % (4/18) gegenüber. Die Normozephalen-Gruppe wies, bezogen auf VarE7, lediglich einen Anteil von 28 % (14/50) auf, wobei innerhalb der Gruppe das Auftreten von 40 % nicht überschritten wurde. Die VarE7AB trat bei 47 % der Brachyzephalen-Gruppe auf, dabei hielt die Rasse Mops den höchsten Anteil von 78 % (14/18). Im Vergleich dazu tauchte diese Variante innerhalb der Normozephalen-Gruppe mit einem vergleichsweise hohen Anteil von 74 % (37/50) auf, wobei das Auftreten innerhalb dieser Gruppe einen relativ gleichmäßig hohen Anteil von 60 - 88% aufwies. Schlussfolgerungen: Ein klinisch-morphologischer Vergleich zwischen humanen und kaninen Kraniosynostose-Syndromen ist möglich. Ob Mutationen in Kandidatengenen (z.B. FGFR2) des Menschen auch in den analogen Genen beim Hund nachgewiesen werden können, wurde in dieser Arbeit geprüft. Erstmals wurde die Sequenz des kaninen FGFR2-Gens auf Sequenzabweichungen hin analysiert. Die dabei detektierte Variante VarE7 zeigte einen statistisch signifikanten Zusammenhang mit dem Auftreten des Phänotyps 'Brachyzephalie' bei der Französischen Bulldogge. Eine weitere Variante, Var7AB, konnte als statistisch signifikant im Zusammenhang mit dem Auftreten des Phänotyps 'Brachyzephalie' bei der Rasse Mops identifiziert werden. Dieser Zusammenhang war allerdings nicht eindeutig verifizierbar. Weitere Studien, insbesondere Funktionsstudien, sind notwendig, um die Auswirkungen der Varianten im FGFR2-Gen auf den Phänotyp zu prüfen.

Charakterisierung neuraler Vorläuferzellen im pränatalen Neokortex des Nördlichen Spitzhörnchens (Tupaia belangeri) Einleitung: Im Verlauf der Evolution entwickelte sich der Neokortex zum komplexesten Anteil des Säugetiergehirns. Ausdifferenzierungen und eine immense Expansion des Neo-kortex, vor allem in der Primatenabstammungslinie, waren die Folge. Der größte Teil der neokortikalen Neurone wird während der Embryonal- und Fetalphase gebildet und stammt von sogenannten neuralen Stamm- und Progenitorzellen (NPCs) ab. Diese entstehen in zwei unterschiedlichen Keimschichten, der Ventrikulärzone (VZ) und der Subventrikulärzone (SVZ). Vorangegangene Studien zeigten, dass sich die Dicke der SVZ als auch das Vorhan-densein und die Häufigkeit bestimmter NPCs, besonders die der basalen radialen Gliazelle (bRG), zwischen lissenzephalen Nagetieren und gyrenzephalen Primaten erheblich unter-scheidet. Bislang werden überwiegend Nagetiere in Untersuchungen zu gehirnassoziierten Fragestellungen eingesetzt, wohlwissentlich dass es deutliche Unterschiede in der neokorti-kalen Entwicklung (d.h. in der Abundanz und Verteilung der unterschiedlichen NPCs) zwi-schen Mensch und Nagetier gibt. Die Etablierung eines Tiermodells, das eine ähnliche NPC- Ausstattung wie der Mensch besitzt, ist für das bessere Verständnis der humanen Neokorte-xentwicklung sowie neokortikaler Entwicklungsstörungen und Erkrankungen essenziell. Das nördliche Spitzhörnchen (Tupaia belangeri) ist ein rattengroßes Tier mit einem hohen Ge-hirn-Körpermasse-Verhältnis und steht phylogenetisch zwischen den Nagetieren und den Primaten. Ziel der Untersuchung: Ziel dieser Arbeit war es, die Präsenz, die Abundanz und die Ver-teilung der bRGs und anderer NPCs in den Keimzonen (VZ und SVZ) des sich entwickeln-den Neokortex des Tupaia belangeri zu erfassen. Die erhobenen Daten wurden mit vorhan-denen Daten von Makaken, Frettchen, Ratte und Maus verglichen, um zu erfahren, ob Schlüsselmerkmale der Neokortexentwicklung größere Gemeinsamkeiten zu gyrenzepha-len Primaten oder lissenzephalen Nagetieren zeigen. Tiere, Material und Methoden: Die Tupaiagehirne stammen von Tieren aus dem Institut für Biologie der Universität Leipzig, Fakultät für Biowissenschaften, Pharmazie und Psycho-logie und dem Institut für Zoologie der Tierärztlichen Hochschule Hannover. Das Alter der Proben bewegte sich von Embryonaltag 32 (n=2), 37 (n=2), 45 (n=2) bis hin zu Postnataltag (P) 1 (n=2). Die exakte Bestimmung des Alters der Tiere erfolgte über eine Scheitel-Steißlängen-Wachstumskurve. Die Gehirne wurden entnommen, fixiert und das gesamte Telenzephalon wurde von rostral nach kaudal in Einzelschnitte von 30 µm Dicke geschnitten und immunhistochemisch gefärbt. Dabei wurden fluoreszenmarkierte sekundäre Antikörper verwendet. Die visuelle Darstellung erfolgte mittels eines konfokalen Lasermikroskops (Leica SP8). Die Aufnahmen wurden mittels Fiji und Adobe Photoshop Software prozessiert. Die Quantifizierung der Zellen erfolgte mittels Fiji Software (Multiclass Cell Counter plug in). Die statistische Auswertung erfolgte durch R Software. Im Rahmen einer Ranganalyse wurden nichttransformierte Werte verschiedener neokortikaler Parameter unterschiedlicher Spezies verglichen und mit dem Kruskal-Wallis-Test mit anschließendem Conover post-hoc-Test auf eine statistische Signifikanz (p <0.05) geprüft. Darüber hinaus wurde nach Standardisierung mittels z-Score eine Hauptkomponentenanalyse, euklidische Distanzberechnung und hierar-chisches Clustern durchgeführt. Ergebnisse: Drei grundlegende Erkenntnisse stellen sich dar. Der sich entwickelnde Neo-kortex des Tupaia belangeri verfügt über (i) eine relativ große SVZ, (ii) eine hohe Abundanz von Pax6+ NPCs in der SVZ sowie über (iii) einen hohen Prozentsatz von bRGs zum Zeit-punkt der Bildung der oberen Kortexschichten. Durch die statistische Auswertung stellte sich heraus, dass bestimmte Schlüsselmerkmale in der Neokortexentstehung des Tupaia (d.h. Entwicklung der Keimzonen, Verteilung und Abundanz von unterschiedlichen NPCs) größe-re Ähnlichkeiten zu denen der gyrenzephalen Primaten als zu denen der lissenzephalen Na-getiere aufweisen. Beim Rangvergleich der untersuchten Parameter wurde eine statistische Signifikanz (siehe Tiere, Material und Methoden mit p <0.05) festgestellt. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass große Ähnlichkeiten zwischen den NPC Populationen im sich entwickelnden Neokortex von gyrenzephalen Primaten und Tupaia belangeri bestehen. Somit wird mit dem Tupaia belangeri der biomedizinischen For-schung und translationalen Medizin für die Untersuchung von entwicklungsbedingten Fehl-bildungen und Erkrankungen des Neokortex ein besonders geeignetes Tiermodell - als Al-ternative zu Maus, Ratte, Frettchen und Primaten - zur Verfügung gestellt. Darüber hinaus bieten die gewonnenen Ergebnisse weitreichende Einsichten in die Evolution des Gehirns und die Phylogenese der NPCs der Säugetiere und sind somit für die Grundlagenforschung von großer Bedeutung.

Einleitung: Aufgrund der Heuknappheit der letzten Jahre werden zunehmend auch extensiv bewirtschaftete Wiesen für die Heuproduktion genutzt. Teil der artenreichen Wiesen ist jedoch auch das Vorkommen von potentiell toxischen Pflanzen wie die Herbst-Zeitlose. Inwieweit Pferde getrocknete Herbst-Zeitlose im Heu erkennen und meiden, ist unzureichend erforscht. Erfahrungsberichte von Landwirten sowie Fallberichte kommen zu widersprüchlichen Ergebnissen. Ziele der Untersuchungen: Das Ziel der vorliegenden Untersuchung bestand in der Beschreibung des Selektionsverhaltens von Pferden bei Vorlage von Heu, welches mit Herbst-Zeitlosen kontaminiert war. Tiere, Material und Methoden: Die Studie (TVV-Nummer 17/19) wurde mit sechs klinisch gesunden, adulten (Alter: 11 – 17 Jahre) Warmblutwallachen (durchschnittliches Körpergewicht (KGW) ± Standardabweichung (SD): 674 ± 85 kg) durchgeführt. Die Pferde wurden in Einzelboxen auf Stroh mit täglichem Zugang zu einem Paddock gehalten. Heu wurde, mit Ausnahme der Aufenthaltszeit auf dem Paddock, ad libitum zur Verfügung gestellt und durch 50 g eines kommerziellen Mineralfuttermittels (Hoeveler, Reformin Plus©) ergänzt. Leitungswasser war zu jeder Zeit frei verfügbar. Jedes Pferd erhielt zu unterschiedlichen Tageszeiten über eine Stunde Heu, welches mit 1 oder 2 % getrockneten Herbst-Zeitlosen kontaminiert war. Das Selektionsverhalten der Tiere wurde individuell beobachtet, protokolliert und ausgewählte Beobachtungsperioden mittels Videoaufnahmen aufgezeichnet. Um Intoxikationen zu vermeiden, wurden Abbruchkriterien definiert. Nahm ein Pferd zwei Herbst-Zeitlose auf, wurde die Beobachtungsperiode abgebrochen und das kontaminierte Heu entfernt. Die Beobachtungsperiode wurde an einem anderen Tag und zu einer anderen Tageszeit wiederholt. Musste die Beobachtungsperiode erneut abgebrochen werden, wurde das entsprechende Pferd aus dem Versuch ausgeschlossen. Alle Pferde wurden zu Beginn des Versuchs und anschließend alle zwei bis drei Tage allgemein klinisch untersucht (Herz- und Atemfrequenz, Beschaffenheit der Schleimhäute, Darmgeräusche, innere Körpertemperatur, Pulsation der Gliedmaßen). Ein Blutbild sowie biochemische Blutuntersuchungen aller Pferde wurden zu Beginn und am Ende der Studie durchgeführt. Sowohl das gefütterte Heu als auch die Herbst-Zeitlosen wurden auf die Menge ihrer Rohnährstoffe und Anteile der Faserfraktionen untersucht. Eine Messung der Colchicingehalte in den getrockneten Herbst-Zeitlosen wurde durchgeführt (Flüssigkeitschromatographie/Tandem-Massenspektrometrie). Die Ergebnisse der genannten Analysen wurden mithilfe von Microsoft Excel 2016® deskriptiv und mittels SPSS 27® statistisch ausgewertet. Ergebnisse: Keines der Pferde mied die Herbst-Zeitlose im Heu. Vier von sechs Pferden zeigten sogar eine Präferenz für die Pflanze und nahmen sie gezielt ohne umliegendes Heu auf. Lediglich ein Pferd mied die Herbst-Zeitlose während der ersten sechs Beobachtungsperioden. Innerhalb der siebten Beobachtungsperiode nahm es Anteile der Herbst-Zeitlose auf. Die Parameter der klinischen Untersuchung und die Blutwerte lagen zu jeder Zeit im physiologischen Normbereich. Bei der Messung der Rohnährstoffe konnten in der Herbst-Zeitlosen höhere Rohprotein- (CP: 12,5 ± 0,717 %) und Rohfettgehalte (CFAT: 3,86 ± 0,254 %), sowie ein höherer Anteil an stickstofffreien Extraktstoffen (NFE: 52,3 ± 1,24 %) als im Heu (CP: 7,84 ± 1,47 %; CFAT: 0,80 ± 0,237 %; NFE: 41,4 ± 1,99 %) nachgewiesen werden. Die Faserfraktion der Herbst-Zeitlosen (CF: 17,3 ± 0,837 %) stellte sich geringer als im Heu (CF: 34,5 ± 1,85 %) dar. Es wurde ein durchschnittlicher Colchicingehalt von 331 µg/g Trockensubstanz in der getrockneten Herbst-Zeitlosen gemessen. Schlussfolgerungen: Aufgrund der unselektiven, teils gezielten Aufnahme der Herbst-Zeitlosen durch die Pferde der vorliegenden Studie, sowie das stark gehäufte, nestartige Vorkommen der Herbst-Zeitlosen im Heu, können Vergiftungen durch kontaminiertes Heu nicht ausgeschlossen werden. Daher sollten Wiesen, auf welchen Herbst-Zeitlose wachsen, von der Heugewinnung ausgeschlossen werden.

Einige Krankheitserreger, die für hohe wirtschaftliche Verluste in der Schweineindustrie sorgen, können über mehrere Kilometer über die Luft übertragen werden. Staub und daran gebundene Mikroorganismen können sowohl bei Tieren, als auch bei Menschen, die in der Landwirtschaft arbeiten, zu gesundheitlichen Beeinträchtigungen führen. Um den aerogenen Erregereintrag und die Belastung der Gesundheit durch Stallstaub zu reduzieren, können Filtertechniken, wie Umluftfiltration, zum Einsatz kommen. In mehreren Studien konnte beim Einsatz von Umluftfiltration im Schweinestall ein positiver Einfluss auf die Lungengesundheit der Tiere verzeichnet werden. Auf diesen Erkenntnissen aufbauend, war es Gegenstand dieser Arbeit die positiven Effekte der Umluftfiltration mit der keimtötenden Wirkung von UVC-Strahlen zu kombinieren und somit den Keimgehalt der Stallluft zu reduzieren. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Effizienz von UVC-kombinierter Umluftfiltration hinsichtlich der Reduktionsrate luftgetragener Mikroorganismen im Labormaßstab zu untersuchen. Im zweiten Teil der Studie wurde ein UVC-Umluftfiltermodul in einen kleinen Stall integriert, um dessen Einfluss auf die Qualität der Stallluft bzw. auf die Staub- und Bakterienmenge im Vergleich zu einem Referenzstall zu überprüfen. Für Testdurchläufe im Labormaßstab wurden Aerosole mit Staphylococcus aureus, Ac-tinobacillus pleuropneumoniae, dem Virus des seuchenhaften Spätaborts (PRRSV) und dem Porcinen Parvovirus (PPV) erzeugt. In einem Luftfilterprüfstand wurden mit jedem Erreger je fünf unabhängige Testläufe mit und ohne UVC-Bestrahlung durchgeführt. Bei einigen Test-durchläufen wurde die relative Luftfeuchtigkeit (rLF) verändert, um den Einfluss einer erhöh-ten rLF auf die UVC-Wirksamkeit zu bewerten. Die Reduktionsrate entsprach der Differenz der infektiösen Partikel gemessen vor dem Luftfilter und hinter dem Luftfilter. Um das Überleben von Krankheitserregern im Filtermaterial zu untersuchen, wurden die Filter in ge-trennten Plastiktüten aufbewahrt. Nach bestimmten Zeitintervallen wurden Filterproben ent-nommen, gepoolt und inkubiert. Es folgte eine Virustitration bzw. eine Zählung der Bakterien. Die Feldstudie fand in einem kleinen Instituts-eigenen Stall statt, der aus zwei getrennten Stallabteilen bestand. Es wurden wöchentlich Luftmessungen über einen Zeitraum von 13 Wochen bzw. 16 Wochen in jedem Stallabteil durchgeführt. Die Staub- und Bakterienmenge der Stallluft wurde an drei verschiedenen Probennahmestellen gemessen. Zusätzlich wurden Luft-Proben direkt vor und hinter dem UVC-Modul entnommen. Weiterhin wurde die Ammoniak- und CO2-Konzentration, sowie Temperatur und rLF aufgezeichnet. Die Reduktionsraten der Staub- und Bakterienmenge der Stallluft wurde durch Berechnung der Werteverhältnisse (Ratios) der Messwerte aus Stall 1 (UVC-Modul) verglichen zu Stall 2 (Referenzstall) bestimmt. Ratios kleiner als eins entsprachen einer relativen Verringerung der Bakterienzahl bzw. Staubmenge. Durch logarithmische Transformierung der Ratios wurden annähernd normalverteilte Werte gewährleistet. Unter Verwendung eines t-Tests mit einer Probe auf einem Signifikanzniveau von 5 % wurden Nullhypothesen von unveränderten mittleren Bakterien- bzw. Staubwerten geprüft. Zusätzlich wurden 95 %ige Konfidenzintervalle für die geschätzten Stichprobenmittelwerte berechnet. Bei Tests im Labormaßstab führte das UVC-kombinierte Filtersystem zu einer Reduzierung der viralen und bakteriellen Partikel um mehr als 99 %. Die rLF hatte keinen Einfluss auf die UVC-Effizienz. Die Lebensfähigkeit der Pathogene im Filtermaterial variierte in Abhängigkeit vom verwendeten Pathogen und der rLF, wobei sich S. aureus und PPV am resistentesten darstellten. In der Feldstudie erreichten wir in der Stallluft von Stall 1 (mit dem UVC-Modul) eine signifikant niedrigere Bakterienmenge im Vergleich zum Referenzstall (Stall 2). Die Bakterienkonzentration der Stallluft konnte durchschnittlich auf 37 % reduziert werden, während die Staubmenge in viel geringerem Maße (auf 78 %) verringert werden konnte. Messungen unmittelbar vor und hinter dem UVC-Modul ergaben in der Stallluft eine Reduktion von 99,4 % für Bakterien und von 95,0 % für Staub. Wir konnten die Wirksamkeit von UVC-Strahlung zur Luftdesinfektion im Labormaßstab mit einer Reduktionseffizienz von >99 % für ausgewählte Viren und Bakterien erfolgreich demonstrieren. Darüber hinaus erwies sich die Kombination von UVC-Strahlung und Umluftfiltration als erfolgreich bei der Reduzierung der Bakterien- und Staubmenge der Stallluft in einem kleinen Schweinbestand. Der Einsatz dieser Technologie könnte die allgemeine Stallluftqualität in Nutztierställen verbessern.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Ausgewählte Pathogene in der Schweinehaltung 2.1.1 Viren 2.1.1.1 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) 2.1.1.2 Ungulate protoparvovirus 1 (Porcines Parvovirus, PPV) 2.1.2 Bakterien 2.1.2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.1.2.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 2.2 UVC-Strahlung 2.2.1 Allgemeines 2.2.2 Luftdesinfektion mit UVC-Strahlung 2.3 Luftfiltration 2.3.1 Grundlagen der Filtration 2.3.2 Filterklassen 2.3.3 Luftfiltration in der Tierhaltung 2.4 Stallklima 2.4.1 Zusammensetzung der Stallluft 2.4.1.1 Organische Komponenten 2.4.1.1.1 Staub 2.4.1.1.2 Mikrobielle Zusammensetzung der Stallluft 2.4.1.2 Chemische und physikalische Komponenten 2.4.1.2.1 Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit (rLF), Luftgeschwindigkeit 2.4.1.2.2 Ammoniak (NH3) 2.4.1.2.3 Kohlendioxid (CO2) 3 Veröffentlichung 3.1 Eigenanteil 3.2 Fremdanteil 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary Literaturverzeichnis Danksagung / Some pathogens, which cause high economic losses in the swine industry, can be transmitted over several kilometres via the airborne route. Dust and microorganisms bound to dust can lead to serious health problems for animals, as well as for human beings working in the agricultural environment. In order to reduce airborne pathogen burden and to lower the negative health impact of stable dust, air filtration technologies such as recirculating air filtration can be used. In several studies, a positive impact on swine lung health was seen, when recirculating air filtration was implemented in the pig barn. Filtration of supply air can minimize the risk of introducing airborne pathogens to indoor air. Based on this knowledge, the aim of this study was to combine the positive effects of recirculating air filtration with the germicidal effect of UVC-irradiation, and thus to reduce germ content of stable air. The aim of the current study was, to assess the efficiency of UVC irradiation combined to air filtration in reducing airborne microorganisms at laboratory scale. In a second part, a UVC-combined recirculating air filtration module (UVC module) was implemented in a small animal facility in order to assess its improvement of air quality with regard to airborne bacteria and dust. Tests at laboratory scale were performed using aerosols of Staphylococcus aureus, Actinobacillus pleuropneumoniae, porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) and porcine parvovirus (PPV). Five independent test runs were performed in a test chamber with each pathogen, with and without UVC irradiation, respectively. Relative humidity (RH) was manipulated in some test runs to evaluate the influence of increased RH to UVC-efficacy. Reduction efficiencies were calculated by numbers of pathogens entering and leaving the test chamber. To investigate the survival of pathogens in the filter material, the filters were stored in separated plastic bags. Filter samples were taken after certain time intervals, pooled and incubated, followed by virus titration or counting of bacteria. Our field study occurred in a small pig facility consisting of two separated barns. Weekly air measurements were conducted over a period of 13 weeks (10 piglets) and 16 weeks (11 piglets) in each barn, respectively. Airborne dust and bacteria amount was sampled and calculated at three different sampling points. Furthermore, samples were taken right in front and behind the UVC-module. In addition, ammonia, CO2, temperature and RH were recorded. Relative reduction of airborne dust and bacteria amount was determined by calculating ratios of values in barn 1 (UVC-module) compared to barn 2 (reference). Ratios smaller than one correspond to a relative reduction of bacterial counts/dust amount. Ratios were log-transformed to guarantee approximately normally distributed values. Null hypotheses of unchanged mean bacterial or dust counts (i.e., mean ratios equal one) were tested using one sample t-tests on a significance level of 5 %. In addition, 95 % confidence intervals (CI) were calculated for the estimated sample means. UVC-combined air filtration in tests at laboratory scale resulted in a more than 99 % reduction of viral and bacterial particles. RH had no influence on UVC efficiency. Viability in the filter matter varied depending on the pathogen used and RH with S. aureus and PPV being most resistant. In the field study, airborne bacterial numbers were significantly lower in the barn equipped with the UVC module compared to the reference barn. On average, a reduction to 37 % of reference values could be achieved for bacteria, whereas the amount of total dust was reduced to a much lesser extent (i.e. to 78 % of reference values). Measures taken in front of and behind the UVC module revealed a reduction of 99.4 % for airborne bacteria and 95.0 % for total dust. We successfully demonstrated the effectiveness of air disinfection using UVC irradiation at laboratory scale with reduction efficiencies of >99 % for certain viruses and bacteria. Moreo-ver, combining UVC irradiation to recirculating air filtration proved to be successful in reduc-ing airborne bacteria and dust in a small animal facility. The implementation of such devices might improve the overall environmental quality in animal facilities.:1 Einleitung 2 Literaturübersicht 2.1 Ausgewählte Pathogene in der Schweinehaltung 2.1.1 Viren 2.1.1.1 Porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) 2.1.1.2 Ungulate protoparvovirus 1 (Porcines Parvovirus, PPV) 2.1.2 Bakterien 2.1.2.1 Actinobacillus pleuropneumoniae (APP) 2.1.2.2 Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) 2.2 UVC-Strahlung 2.2.1 Allgemeines 2.2.2 Luftdesinfektion mit UVC-Strahlung 2.3 Luftfiltration 2.3.1 Grundlagen der Filtration 2.3.2 Filterklassen 2.3.3 Luftfiltration in der Tierhaltung 2.4 Stallklima 2.4.1 Zusammensetzung der Stallluft 2.4.1.1 Organische Komponenten 2.4.1.1.1 Staub 2.4.1.1.2 Mikrobielle Zusammensetzung der Stallluft 2.4.1.2 Chemische und physikalische Komponenten 2.4.1.2.1 Temperatur, relative Luftfeuchtigkeit (rLF), Luftgeschwindigkeit 2.4.1.2.2 Ammoniak (NH3) 2.4.1.2.3 Kohlendioxid (CO2) 3 Veröffentlichung 3.1 Eigenanteil 3.2 Fremdanteil 4 Diskussion 5 Zusammenfassung 6 Summary Literaturverzeichnis Danksagung

Gliotoxin ist ein ubiquitär vorkommendes Mykotoxin und wird unter anderem von Aspergillus sp. gebildet. Das Gliotoxin ist toxisch und stellt für Mensch und Tier ein gesundheitliches Risiko dar. Über die Aufnahme von kontaminierten Futtermitteln (FM) kann es in tierische Produkte und anschließend in die Nahrungsmittelkette gelangen. Dem Mykotoxin werden starke immunmodulatorische Eigenschaften zugeschrieben. Gliotoxin gilt als eine sehr reaktive Verbindung, die in der Umwelt schnell zu bis(methylthio)Gliotoxin (bmGliotoxin) umgesetzt werden kann. Dieser Metabolit ist sowohl atoxisch als auch biologisch inaktiv und wird aufgrund seiner Stabilität als ein wichtiger und zuverlässiger Diagnostikmarker beschrieben. In der Mykotoxinanalytik werden Konzentrationsbestimmungen primär durch chromato-graphische Verfahren durchgeführt. Mit diesen Verfahren konnten bereits Gliotoxin-Konzentrationen in verschiedensten FM bestimmt werden. Im Gegensatz zu anderen prominenten Mykotoxinen gibt es für das Gliotoxin kein Nachweisverfahren für routinemäßige Kontrolluntersuchungen. Daher war das Ziel der Dissertationsarbeit die Entwicklung eines ELISA, mit dem Gliotoxin in FM einfach und schnell bestimmt werden kann. Es wurden zunächst geeignete Protein-Gliotoxin-Konjugate für die Anti-Gliotoxin-Immunisierung hergestellt. Kaninchen wurden nach einem festgelegten Protokoll mit diesen Hapten-Konjugaten immunisiert (Kurzzeit- bzw. Langzeitimmunisierung). Anschließend erfolgte die Titerbestimmung in den Antiseren und die Überprüfung der Paratophemmbarkeit durch freies Gliotoxin. Aus dem Antiserum mit der höchsten IgG-anti-Gliotoxin-Konzentration wurden die Antikörper antigenaffinitäts-chromatografisch aufgereinigt. Zusätzlich wurde für den kompetitiven ELISA ein geeignetes Gliotoxin-Peroxidase-Konjugat hergestellt. Alle Testkomponenten wurden vorab geprüft und danach der kompetitive Gliotoxin-ELISA validiert. Mit dem optimierten kompetitiven Testsystem wurden die Gliotoxin-Konzentrationen in Schimmelpilz-Kulturüberständen (Aspergillus sp.) gemessen. Anschließend erfolgte die Untersuchung von Futtermittelproben (Silagen) auf Gliotoxin. Nach der entsprechenden Probenaufbereitung der FM wurde das Gliotoxin im kompetitiven ELISA ebenfalls quantitativ bestimmt. Die hier gemessenen Gliotoxin-Konzentrationen wurden mit Ergebnissen aus parallel durchgeführten Untersuchungen mit der LC-MS/MS verglichen. Mit dem entwickelten kompetitiven ELISA sind quantitative Aussagen zu erhöhten Gliotoxin-Konzentrationen in verschiedenen Probenmaterialien möglich. Das Mykotoxin kann sowohl frei in seiner nativen Form, gebunden an Proteine oder metabolisiert als bis(methylthio)gliotoxin detektiert werden. Mit dem Testsystem kann die quantitative Produktion von Gliotoxin durch verschiedene Schimmelpilzarten beurteilt werden. Die untersuchten FM (Silageproben) konnten im entwickelten ELISA alle erfolgreich gemessen und beurteilt werden.:1 Einleitung 1 2 Literaturübersicht 2 2.1 Schimmelpilze 2 2.1.1 Definition und Zuordnung 2 2.1.2 Vorkommen in der Umwelt 4 2.1.3 Bedeutung und Nutzen 5 2.1.4 Schadwirkung für Mensch und Tier 7 2.2 Mykotoxine 9 2.3 Gliotoxin 10 2.3.1 Allgemeine Merkmale 10 2.3.2 Bis(methylthio)Gliotoxin 16 2.3.3 Ausgewählte Pathogenitätsmechanismen 17 2.3.3.1 Redox-Zirkel und ROS-Produktion 17 2.3.3.2 Verschiebung des TH1/ TH2-Gleichgewichtes 18 2.3.3.3 Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-κB 19 2.3.3.4 Einleitung von Apoptose und Nekrose 20 2.3.3.5 Inhibition von Mastzellen 21 2.3.4 Nachweisverfahren 22 2.3.4.1 Chromatographie 22 2.3.4.2 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA) 23 2.3.5 Quantitative Mengenbestimmungen in Proben 25 2.3.5.1 Klinisches Probenmaterial 25 2.3.5.2 Belastete Futtermittelproben 27 2.3.5.3 Belastete Lebensmittelproben 33 3 Material und Methoden 34 3.1 Gliotoxin, Chemikalien und ausgewählte Laborgeräte 34 3.2 Gliotoxin-Hapten für die Immunisierung 35 3.3 Immunisierung 37 3.4 Untersuchung der Anti-Gliotoxin-Antiseren 37 3.4.1 Protein-Gliotoxin-Konjugate für ELISA 37 3.4.2 ELISA für Antiserumuntersuchung 39 3.4.3 ELISA für die Bestimmung der IgG-Konzentrationen anti-Gliotoxin 40 3.5 Etablierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 42 3.5.1 Isolierung der IgG-anti-Gliotoxin 42 3.5.2 Herstellung des Gliotoxin-HRP-Konjugates 43 3.5.3 Prüfung der Testkomponenten 44 3.5.4 Validierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 45 3.6 Untersuchung von Kreuzreaktionen 45 3.7 Untersuchung von Pilzkulturen auf Gliotoxin 45 3.8 Untersuchung von Futtermitteln auf Gliotoxin 47 3.8.1 Untersuchung von dotiertem Futtermittel 47 3.8.2 Futtermitteluntersuchung mit dem Gliotoxin-ELISA 48 3.8.3 Futtermitteluntersuchung mit der LC-MS/MS 49 3.9 Datenauswertung 49 4 Ergebnisse 50 4.1 Hapten für die Immunisierung 50 4.2 Untersuchung der Anti-Gliotoxin-Antiseren 50 4.2.1 Titerbestimmung 50 4.2.2 Bestimmung der Hemmungsrate durch freies Gliotoxin 51 4.2.3 IgG-anti-Gliotoxin-Konzentration in den Antiseren 53 4.3 Untersuchung der Antiseren 55 4.3.1 Isolierung des IgG-anti-Gliotoxin 55 4.3.2 Voruntersuchungen für die Etablierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 57 4.3.3 Validierung des kompetitiven Gliotoxin-ELISA 60 4.4 Untersuchung von Kreuzreaktionen 64 4.5 Untersuchung von Pilzkulturen auf Gliotoxin 65 4.6 Untersuchung von Futtermitteln auf Gliotoxin 68 4.6.1 Untersuchung mit Gliotoxin dotierter Futtermittel 68 4.6.2 Futtermitteluntersuchung mit Gliotoxin-ELISA und LC-MS/MS 71 4.7 Auswertung und Bewertung 73 5 Diskussion 78 5.1 Bewertung der Gliotoxin-Antigen Entwicklung 78 5.2 Bewertung der Antiseren nach Immunisierung (28d- und 91d-Protokoll) 79 5.3 Etablierung des kompetitiven ELISA 83 5.4 Bewertung der Pilze und der Kulturüberstände 85 5.5 Bewertung der Futtermittel 88 6 Zusammenfassung 96 7 Summary 98 8 Literaturverzeichnis 100 9 Anhang 116