Les interférons (IFN) de type I et type III sont des cytokines induites par des pathogènes. L'IFN de type I (IFN α/β)se fixe à un récepteur constitué des chaînes IFNAR1 et IFNAR2. L'IFN de type III (3 λs) se fixe à un récepteur constitué des chaines IFNLR1 et IL-10R2. La liaison de ces IFNs à leur récepteur active la voie Jak/Stat, induit les mêmes gènes et des réponses cellulaires communes essentielles à la protection antivirale. L'IFN de type I joue un rôle pléiotropique et de ce fait la réponse cellulaire aux IFNs doit être contrôlée dans le temps et dans l'espace. Certains régulateurs négatifs tels que les SOCS ou les ubiquitine ligases ciblant la sous-unité IFNAR1 vont agir rapidement après la stimulation, alors que d'autres agissent à des temps plus tardifs, tels qu'USP18. USP18 est une cystéine protéase induite par l'IFN, elle clive ISG15, une molécule semblable à l'ubiquitine, à partir de protéines ISGylées. J'ai étudié comment une stimulation prolongée avec de l'IFN de type I ou III interfère avec la capacité de ces cellules à répondre à une re-stimulation par les IFN α, tout en maintenant leur sensibilité à l'IFN β et λ . Ce phénomène de désensibilisation différentielle n'est pas dû à une diminution des récepteurs à la surface des cellules mais à l'induction de la forme catalytiquement active d'USP18. Lors de traitements prolongés à l'IFN, l'accumulation d'USP18, dont l'expression est régulée par ISG15, inhibe progressivement la signalisation induite par l'IFN α. En conclusion, ces études montrent qu'USP18 fait partie intégrante des signaux transmis lors d'une stimulation par les IFN de type I et III et définit le seuil d'activité des différents sous-types α/β.

<p>Coronaviruses (CoVs) are single-stranded, positive-sense RNA viruses in the Coronaviridae family. Within this family are four different genera, Alpha-, Beta-, Gamma-, and Deltacoronaviruses with human-infecting CoVs spanning the Alpha- and Beta-CoV genera. Most notably, Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus-1 (SARS-CoV-1) and SARS-CoV-2 are Betacoronaviruses that spread worldwide in their outbreaks from 2002-2003 (SARS-CoV-1) and 2019-2020 (SARS-CoV-2). Human-infecting Alphacoronaviruses, NL63-CoV and 229E-CoV, have caused milder infections involving respiratory disease, gastroenteritis, and in more severe cases, death. Despite milder disease, Alphacoronaviruses are the cause of 15-30% of severe upper and lower respiratory tract infections each year. There have been recent efforts in the development of potent, small-molecule inhibitors to treat SARS-CoV-2 infection but there is an ongoing need to develop new and effective anti-coronavirus therapeutics to treat other human-infecting CoVs circulating society. Coronaviruses encode two essential proteases, the papain-like protease (PLP) and the 3C-like protease. PLPs are cysteine proteases located in non-structural protein 3 (nsp3). PLPs processes the viral polyprotein, releasing the first three nonstructural proteins encoded in the virus, and also are involved in evading the innate immune response through deubiquitinating (DUB) and deISGylating activity. </p> <p><br></p> <p>This study compares the substrate specificity and catalytic function of multiple human-infecting PLPs from both Alpha- and Beta-CoVs including NL63-CoV PLP2, 229E-CoV PLP2, Canine-CoV PLP2, FIPV-CoV PLP2, PEDV-CoV PLP2, SARS-CoV-1 PLpro, and SARS-CoV-2 PLpro. Interestingly, Alphacoronavirus PLP2s have a >400-fold greater catalytic efficiency for ubiquitin compared to Betacoronaviruses PLpro. This work also identifies a non-covalent scaffold of inhibitors that has pan-CoV inhibition; however, the IC50 values are >30-fold higher for NL63-CoV PLP2 than for SARS-CoV-1 PLpro. The X-ray structures of NL63 PLP2 and 229E PLP2 were determined to 2.1 Å and 1.8 Å, respectively, and provide structural information about the substrate and inhibitor binding region that could be the result in the differences in Alpha- and Betacoronavirus PLP function. Since PLP does not function as a single-domain in vivo, it is critical to understand the function of PLP when tethered to other domains of nsp3. This study also investigates nine different constructs of SARS-CoV-2 nsp3 with increasing domains, ranging from the single PLpro domain to Ubl1-Ydomain ΔTM1-TM2. Interestingly, the longer constructs of SARS-CoV-2 nsp3 show less catalytic efficiency for Ub-AMC and greater affinity for ISG15-AMC, with 8-fold lower Km values compared to PLpro alone. Lastly, each SARS-CoV-2 nsp3 construct was inhibited by a known PLpro inhibitor, GRL-0617, with reported IC50 values ranging from 0.91 μM to 1.9 μM. These data show that GRL-0617 still remains a lead compound to be optimized for cellular potency. </p> <p><br></p> <p>Overall, this dissertation advances the understanding of the kinetic and structural differences between Alphacoronavirus PLP2 and Betacoronavirus PLpro enzymes in the efforts of developing a pan-CoV inhibitor. Additionally, these data provide initial kinetic and biophysical characterization of PLpro within the larger context of nsp3 to elucidate the function of PLpro in its most native context during coronaviral infection.</p>