Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'ACTH stimule son récepteur au niveau du cortex surrénalien afin d'enclencher la synthèse et la sécrétion de cortisol chez l'humain.L'hypothèse du projet propose qu'il existe une régulation moléculaire de MC2R (melanocortin-2 receptor) qui permet les [i.e. aux] cellules corticosurrénaliennes de s'adapter aux variations physiologiques d'ACTH. Mon projet de doctorat a consisté à utiliser MC2R et MRAP (MC2R accessory protein) recombinés dans les cellules embryonnaires de rein humain (HEK) 293/FRT (Flp recombinase target). J'ai développé ce modèle entièrement humain afin de contourner les problèmes d'expression fonctionnelle de MC2R (avant 2005) dans le but d'approfondir nos connaissances sur la régulation fonctionnelle de MC2R. Les objectifs spécifiques étaient de : 1) Déterminer le rôle des isoformes MRAP1 dans l'expression fonctionnelle de MC2R. 2) Déterminer les différences entre MRAPs. 3) Analyser l'internalisation et le recyclage de MC2R. 4) Déterminer la contribution des 9 serines (S) et thréonines (T) intracellulaires de MC2R dans sa régulation fonctionnelle. 5) Déterminer si la phosphorylation des MAPKs (mitogen-activated protein kinases) induite par l?ACTH est liée au processus d'internalisation de MC2R. Premièrement, MC2R est exprimé à la membrane plasmique des cellules 293/FRT mais de manière non-fonctionnelle. La co-expression de l'une ou l'autre des isoformes MRAP1 (MRAP[alpha] ou MRAP[béta]) humaines augmente l'expression membranaire de MC2R. MRAP[alpha] n'induit pas autant l'expression membranaire de MC2R que MRAP[béta], ce qui se répercute sur la capacité de liaison de l?ACTH et aussi sur les réponses maximales d'AMPc. Par contre, MRAP[alpha] permet une plus grande affinité pour l?ACTH que MRAP[béta], ce qui se traduit par une plus grande sensibilité des cellules à l?ACTH (section 3.1). Deuxièmement, MC2R est N-glycosylé sur ses deux sites de N-glycosylation, mais cette dernière n'est pas requise pour sa fonctionnalité (article non-présenté). Troisièmement, le système ACTH/MC2R/MRAP1/MRAP2 du poisson zèbre a été caractérisé (article non-présenté) et s'est soldé par l'observation que zfMRAP1 procure 10 fois plus de sensibilité à l?ACTH que MRAP[alpha]. Quatrièmement, chaque domaine C-terminal semble servir au triage des protéines MRAP1 au niveau de l'appareil de Golgi car MRAP[alpha] (pré-Golgi), MRAP[béta] (post-Golgi) et leur version tronquée, MRAPdCT (au Golgi), sont préférentiellement localisées dans différents compartiments cellulaires. Les MRAP1s et les MRAP2 modulent l'expression de MC2R. En retour, MC2R augmente l'expression et le ciblage membranaire des MRAP1s (section 3.2). Cinquièmement, l'internalisation de MC2R est clathrine-, dynamine- et arrestine-dépendente. Le recyclage et la resensibilisation de MC2R permet à l?ACTH d'entretenir une production d'AMPc soutenue. Les isoformes MRAP1 internalisent avec MC2R dans des endosomes positifs pour Rab4, Rab5 et Rab11 (section 3.3). Sixièmement, plusieurs S/T sont susceptibles d'être impliquées dans la désensibilisation, l'internalisation et dans la régulation de l'expression membranaire de MC2R. Le résidu T143, cible potentielle de la protéine kinase C (PKC), est critique à l'expression membranaire de MC2R (section 3.3). Finalement, l'activation des voies MAPK n'est pas liée à l'interaction MC2R-arrestine durant l'internalisation (article non-présenté).

La sérotonine (5-HT) joue un rôle majeur dans la modulation de nombreuses fonctions physiologiques et des déficits de la neurotransmission sérotoninergique sont associés à la dépression. Les récepteurs de type 5-HT1A sont impliqués dans la régulation de l’humeur, et le délai d’action thérapeutique d’un traitement par antidépresseur inhibiteur sélectif de la recapture de la 5-HT (ISRS) serait en relation avec leur désensibilisation qui se développe progressivement dans les neurones du raphé au cours du traitement. De fait, il a été rapporté que l’accélération de la désensibilisation des (auto)récepteurs 5-HT1A dans le raphé induit une réduction du délai d’action des antidépresseurs ISRS. Des données indirectes suggèrent que l’internalisation des récepteurs 5-HT1A pourrait être impliquée dans leur désensibilisation. L’objectif de ma thèse a été d’étudier le lien entre l’internalisation des récepteurs 5-HT1A et leur désensibilisation. A cette fin, j’ai développé des outils permettant d’étudier les mécanismes d’internalisation des récepteurs 5-HT1A dans des lignées cellulaires puis dans des neurones de raphé ou d’hippocampe en culture primaire. Nous avons produit un vecteur pour l’expression du récepteur 5-HT1A étiqueté avec un site de liaison de la bungarotoxine (BBS-5-HT1A), et le suivi de son trafic en microscopie confocale et vidéomicroscopie dans les lignées cellulaires et les neurones. Notre construction a permis de montrer que le récepteur BBS-5-HT1A est internalisé constitutivement dans la lignée LLC-PK1 et dans les neurones de raphé et d’hippocampe. Cette internalisation implique la voie clathrine-dépendante, et est suivie du recyclage de la plus grande partie du récepteur internalisé à la membrane plasmique. Enfin, nous avons également montré que, suite à un traitement chronique avec le 8-OH-DPAT, le récepteur 5-HT1A présente aussi une internalisation agoniste-dépendante spécifiquement dans les neurones sérotoninergiques du raphé. De fait, ce phénomène n’intervient ni dans les neurones non-sérotoninergiques du raphé ni dans les neurones de l’hippocampe. Ces résultats suggèrent que l’internalisation du récepteur 5-HT1A, qui est induite par sa stimulation prolongée, dépend du phénotype du neurone qui l’exprime et met en jeu des mécanismes intracellulaires spécifiques. Le parallèle entre les différences régionales (raphé versus hippocampe) de l’internalisation agoniste-dépendante du récepteur 5-HT1A et celles qui concernent sa désensibilisation fonctionnelle sous traitement ISRS au long cours laisse à penser que l’endocytose du récepteur 5-HT1A pourrait jouer un rôle majeur dans sa propre régulation et dans celle de la neurotransmission sérotoninergique centrale. / Pas de résumé en anglais

L’utilisation des opioïdes est à l’origine de phénomènes de tolérance et d’hyperalgésie induite (HIO) aussi bien chez l’animal qu’en utilisation clinique. Ces phénomènes surviennent avec tous les opioïdes de manière dose-dépendante. Les mécanismes qui les sous-tendent sont complexes et imparfaitement connus. Le rémifentanil et le sufentanil sont les opioïdes les plus utilisés en France en anesthésie-réanimation. Leur utilisation s’accompagne d’une HIO qui majore la douleur postopératoire et peut être responsable de la persistance de la douleur à long terme. La perception des stimuli nociceptifs chez un patient sous anesthésie générale n’est pas aisée et repose encore sur des signes cliniques indirects d’activation du système sympathique. Ces signes peu sensibles et peu spécifiques conduisent à sous doser ou sur-doser les patients en opioïdes. Récemment, un nouvel outil de monitorage de la nociception est apparu, l’analgesia nociception index (ANI). L’ANI reflète le tonus parasympathique et de ce fait permettrait aux anesthésistes de mieux adapter le dosage des opioïdes. Dans cette thèse, nous avons d’abord évalué la sensibilité et la spécificité de l’ANI à détecter les stimuli nociceptifs, puis montré qu’elles étaient supérieures à celles des signes cliniques, et supérieures à d’autres indices de monitorage proposés. Ensuite nous avons validé la capacité de l’ANI à guider l’analgésie peropératoire du rémifentanil dans différentes situations.Sur le plan expérimental, nous avons exploré, après une exposition courte ou prolongée à différentes doses de rémifentanil et de sufentanil, les mécanismes associés à l’hyperalgésie thermique in vivo, chez la souris, et ex vivo, sur la voie des MAP kinases ERK1/2 et sur le trafic membranaire des récepteurs opioïdes de type µ (MOR) dans différentes cultures cellulaires. Chez la souris, nous avons mis en évidence une hyperalgésie précoce au saut sur plaque chaude, après exposition aux doses les plus élevées de rémifentanil, mais pas avec le sufentanil. De plus, nous n’avons pas observé d’HIO sur le léchage des pattes.Sur les cultures cellulaires, le rémifentanil comme le sufentanil activent la voie des MAPK ERK1/2 lors d’une exposition courte, avec apparition d’une désensibilisation lorsque l’exposition se prolonge. Le rémifentanil comme le sufentanil induisent une internalisation précoce et progressive des récepteurs MOR. / The use of opioids is associated with tolerance and induced hyperalgesia (OIH). Tolerance and OIH occur with all opioids and have been demonstrated both, in animals and in humans and are likely to be dose-dependent. The underlying mechanisms are complex and partially known. Remifentanil and sufentanil are the most used opioids in France in anesthesia and intensive care. Their use is associated with OIH that increases postoperative pain and may be responsible for persistent pain. In anesthetized patients, nociceptive stimuli are still detected according to clinical signs of sympathetic activation. These signs lack sensitivity and specificity and lead to underdosing or overdosing opioids. Recently, the analgesia nociception index (ANI), has been proposed as surrogate marker of nociception. The ANI reflects the parasympathetic tone and thus may allow anesthetists to better adapt the opioid dosage. In this thesis, we first evaluated the sensitivity and specificity of ANI to detect nociceptive stimuli, and showed that it better detects them than do clinical signs or than other currently available monitoring tools. Subsequently, we validated the ability of the ANI to adequately guide the intraoperative dosing of remifentanil in different clinical setting.After acute and sustained exposure to different doses of remifentanil and sufentanil we investigated, in vivo, the mechanisms associated with thermal hyperalgesia in mice, and ex vivo, the effect on the MAP kinase ERK1/2 pathway and the μ-type opioid receptor (MOR) membrane trafficking in human neuroblastoma and embryonic kidney cell cultures. In mice, high-dose remifentanil induced early hyperalgesia assessed by the jumping latency in a hot-plate test, but not the sufentanil. We did not observe OIH for the hind paw licking test. On cell cultures, after short exposure, both remifentanil and sufentanil produced activation of the MAP kinase ERK1/2 pathway, and rapid desensitization and internalization of the MOR.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse diffusée initialement dans le cadre d'un projet pilote des Presses de l'Université de Montréal/Centre d'édition numérique UdeM (1997-2008) avec l'autorisation de l'auteur.

Les récepteurs P2X, activés par l’ATP extracellulaire et cations non-sélectifs, sont impliqués dans de nombreux rôles physiopathologiques. Le manque de sélectivité de molécules pharmacologiques est un inconvénient majeur pour leur étude. La résolution de leurs structures cristallographiques a permis de les comprendre à l’échelle moléculaire, cependant les mécanismes impliqués dans les transitions allostériques restent mal compris. Au laboratoire, deux outils, dérivés d’azobenzène, permettant l’activation des récepteurs P2X en absence d’ATP et par la lumière ont été développés. L’utilisation de ces outils ont permis l’étude de la transition allostérique de l’état ouvert à l’état désensibilisé, mettant en avant une zone de régulation efficace dans les espaces transmembranaires. De plus, leur utilisation a permis l’investigation biophysique d’une mutation présente sur P2X2 humain, responsable d’une surdité non-syndromatique. Cette mutation entraine un rétrécissement du pore, impactant le passage de gros cations impliqués dans le processus d’audition. Enfin, la relation entre le diamètre du pore ionique et le passage de gros cations a été établi. / P2X receptors, activated by extracellular ATP and non-selective cations, are involved in many physiopathological roles. The lack of selectivity of pharmacological molecules is a major drawback for their study. The resolution of their crystallographic structures provided a molecular framework, but the mechanisms involved in allosteric transitions remain misunderstood. In the laboratory, two tools have been developed, derived from azobenzene, allowing the activation of P2X receptors in the absence of ATP and by light. The use of these tools allowed the study of the allosteric transition from the open to the desensitized state, highlighting an effective regulatory zone in transmembrane spaces. In addition, their use provided the biophysical investigation of a mutation present on hP2X2, responsible for non-syndromatic hearing loss. This mutation leads to a narrowing of the pore, affecting the large cations flow involved in hearing process. Finally, the relationship between the diameter of the ionic pore and the passage of large cations has been established.

Les interférons (IFN) de type I et type III sont des cytokines induites par des pathogènes. L'IFN de type I (IFN α/β)se fixe à un récepteur constitué des chaînes IFNAR1 et IFNAR2. L'IFN de type III (3 λs) se fixe à un récepteur constitué des chaines IFNLR1 et IL-10R2. La liaison de ces IFNs à leur récepteur active la voie Jak/Stat, induit les mêmes gènes et des réponses cellulaires communes essentielles à la protection antivirale. L'IFN de type I joue un rôle pléiotropique et de ce fait la réponse cellulaire aux IFNs doit être contrôlée dans le temps et dans l'espace. Certains régulateurs négatifs tels que les SOCS ou les ubiquitine ligases ciblant la sous-unité IFNAR1 vont agir rapidement après la stimulation, alors que d'autres agissent à des temps plus tardifs, tels qu'USP18. USP18 est une cystéine protéase induite par l'IFN, elle clive ISG15, une molécule semblable à l'ubiquitine, à partir de protéines ISGylées. J'ai étudié comment une stimulation prolongée avec de l'IFN de type I ou III interfère avec la capacité de ces cellules à répondre à une re-stimulation par les IFN α, tout en maintenant leur sensibilité à l'IFN β et λ . Ce phénomène de désensibilisation différentielle n'est pas dû à une diminution des récepteurs à la surface des cellules mais à l'induction de la forme catalytiquement active d'USP18. Lors de traitements prolongés à l'IFN, l'accumulation d'USP18, dont l'expression est régulée par ISG15, inhibe progressivement la signalisation induite par l'IFN α. En conclusion, ces études montrent qu'USP18 fait partie intégrante des signaux transmis lors d'une stimulation par les IFN de type I et III et définit le seuil d'activité des différents sous-types α/β.