Avec la révolution moléculaire en biologie, une compréhension des mécanismes de la relation génotype-phénotype est devenue possible. Récemment, les progrès réalisés dans la synthèse et le séquençage de l’ADN ont permis le développement d’expériences de deep-mutational scanning capable de quantifier divers phénotypes pour un ensemble de génotypes sur toute la longueur d’un gène. Ces ensembles de données sont non seulement intéressants en eux-mêmes, mais permettent également de tester de manière rigoureuse des modèles phénotypiques quantitatifs. Nous avons utilisé cette technologie pour caractériser les cartes séquence-fitness de 3 systèmes bactériens modèles: un régulateur global, la CRP, une enzyme de résistance aux antibiotiques, la β-lactamase, et une petite voie métabolique constituée des enzymes AraA et AraB. Ces systèmes ont été choisis pour éclairer les rôles de différentes caractéristiques dans la formation de la relation génotype-fitness (réseaux de régulations, stabilité des protéines et flux métabolique). Nous constatons que la tendance globale des effets sur le fitness semble prévaloir sur les tendances spécifiques. Ceci nous conduit à penser qu’une grande partie de la relation entre le génotype et le fitness pourrait être expliquée à partir de la forme des fonctions de phénotype-fitness. Par ailleurs, nous voyons que la caractérisation de la relation génotype-fitness dans différents systèmes peut être un moyen puissant d’obtenir des informations sur les phénotypes pertinents. / With the molecular revolution in Biology, a mechanistic understanding of the genotype-phenotype relationship became possible. Recently, advances in DNA synthesis and sequencing have enabled the development of deep-mutational scanning experiments, capable of scoring comprehensive libraries of genotypes for a variety of phenotypes over the length of entire genes. Such datasets are not only interesting in themselves, but also allow rigorous testing of quantitative phenotypic models. We used this technology to characterise sequence-fitness maps for 3 model bacterial systems: a global regulator, CRP, an antibiotic-resistance enzyme, β-lactamase, and a small metabolic pathway, consisting of the enzymes AraA and AraB. These different systems were chosen to illuminate the roles of different mechanistic features in shaping the genotype-fitness relationship (regulatory wiring, protein stability and metabolic flux). We find that smooth patterns of fitness effects tend to prevail over idiosyncrasy, indicating that much of the genotype-fitness relationship could be understood from the global shape of smooth underlying phenotype-fitness functions. On the flip side, we see that characterising the genotype-fitness relationship in different systems can be a powerful way to glean phenotypic insights.

La relation qui lie la séquence d'une protéine à sa fonction nous échappe toujours en grande partie, pourtant elle est essentielle à la compréhension de l'évolution moléculaire.La microfluidique permet de remplacer les traditionnels tubes à essais par des micro-gouttelettes afin de tester séparément des mutants d'enzyme à des fréquences de l'ordre du kilohertz. Cette technique fournit un moyen de coupler le génotype et le produit de l'activité enzymatique (phénotype). Sélectionner et récupérer les gouttelettes sur demande et séquencer leur contenu permet d'effectuer la cartographie génotype-phénotype de millions de mutants d'enzymes en une seule expérience.Au cours de cette thèse, j'ai tout d'abord développé un système microfluidique basé sur l'expression de protéines in vitro afin de pouvoir réaliser la cartographie génotype-phénotype de Streptomyces griseus aminopeptidase (SGAP). Des gènes mutants de l'enzyme SGAP sont encapsulés (un par gouttelette au maximum) amplifiés, exprimés et testés contre un substrat fluorogénique. Des incompatibilités entre les étapes d'amplification, d'expression et d'essai enzymatique en gouttelettes obligent à réaliser chacune de ces étapes séparément et successivement, afin de diluer le produit de chaque réaction par l'électro-coalescence des gouttelettes. Je montre qu'un work-flow microfluidique dans lequel (i) les gènes sont encapsulés et amplifiés dans des gouttes de 0.2 pL, (ii) exprimés in vitro, (iii) testés contre un substrat fluorogenique dans des gouttelettes de 20 pL, permet de mesurer l'activité de variants de SGAP avec un contraste important. Afin d'optimiser l'essai enzymatique en gouttelettes de SGAP, j'ai aussi développé, en collaboration avec Dr. Johan Fenneteau (Laboratoire de Chimie Organique, ESPCI Paristech), un nouveau substrat fluorogénique basé sur une rhodamine hydrophile. Cette sonde est caractérisée par un échange limité de la rhodamine entre les gouttelettes.J'ai ensuite développé un work-flow microfluidique in vivo, pour Ratus norvegicus trypsin (la trypsine du rat), dans lequel les capacité de sécrétion de Bacillus subtilis sont utilisées afin de simplifier les expériences. Des cellules uniques de B. subtilis sont encapsulées dans des gouttelettes de 20 pL où elles sécrètent des mutants de la trypsine en protéine de fusion avec un rapporteur permettant de mesurer le niveau d'expression. Les mutants sont testés par électro-coalescence avec des gouttelettes de 2 pL contenant un substrat fluorogénique de la trypsine. En normalisant l'activité totale détectée par la fluorescence du rapporteur du niveau d'expression, l'efficacité catalytique peut être directement mesurée en gouttelettes. C'est la première fois qu'un système expérimental d'essai enzymatique haut-débit fournit l'opportunité de mesurer directement l’efficacité catalytique de mutants d'une enzyme à une fréquence de l'ordre du kilo Hertz. Une méthode afin de réaliser la mutagenèse saturée (tous les simples mutants) du gène de la trypsine du rat a aussi été développée. Combinée au séquençage nouvelle génération, la méthode microfluidique développée permettra de réaliser la première cartographie génotype-phénotype de tous les simples mutants de la trypsine du rat / The question of how sequence encodes proteins' function is essential to understand molecular evolution but still remains elusive.Droplet-based microfluidics allows to use micro-metric droplets as reaction vessels to separately assay enzyme variants at the kHz frequency. It also provides an elegant solution to couple the genotype with the product of the catalytic activity of enzymes. Sorting droplets on demand and sequencing their content enables to map the genotype of millions of enzyme variants to their phenotype in a single experiment.First, I developed a cell-free microfluidic work-flow to carry out genotype-phenotype mapping of Streptomyces griseus aminopeptidase (SGAP). Single enzyme variant genes are encapsulated and amplified in droplets, expressed, and assayed against a fluorogenic substrate. Incompatibilities between gene amplification, expression and assay reactions, constrain to execute each one of those steps successively and to dilute the product of each reaction by droplet electro-coalescence. I show that a work-flow in which (i) genes are encapsulated and amplified into 0.2 pL droplets, (ii) expressed using cell-free expression reagents in 2 pL droplets and (iii) assayed with a fluorogenic substrate in 20 pL droplets, allows to measure SGAP variants activity with high contrast. To optimize the SGAP droplet assay, I also developed in collaboration with Dr. Johan Fenneteau (Laboratory of Organic Chemistry, ESPCI Paristech), a hydrophilic rhodamine based substrate, characterized by limited exchange of the released fluorophore between droplets.Second, I developed an in vivo microfluidic work-flow on Ratus norvegicus trypsin (rat trypsin), in which Bacillus subtilis secretion abilities are used to simplify the microfluidic work-flow. Single B. subtilis cells are encapsulated in 20 pL droplets where they secrete trypsin variants as fusion proteins with a fluorescent expression-level reporter. The variants are assayed by droplet electro-coalescence with 2 pL droplets containing a trypsin fluorogenic substrate. Trypsin variants catalytic efficiency can be directly measured in droplets, by normalizing the total trypsin activity by the expression-level reporter fluorescence. This is the first time a high-throughput protein assay work-flow gives the opportunity to directly measure the catalytic efficiency of enzyme variants at the kHz frequency. A method to carry out saturated mutagenesis on the rat trypsin gene was also developed. Together with deep sequencing, the developed experimental work-flow will allow to perform the first quantitative genotype-phenotype mapping of all single point mutants of the rat trypsin protein

Controlling influenza A virus (IAV) infections remains a challenge largely due to the high replication and mutation rates of the virus. IAV is a negative-sense RNA virus with two main surface proteins — hemagglutinin (HA) and neuraminidase (NA). HA recognizes and binds sialic acid on host cell receptors to initiate virus entry. NA also recognizes sialic acid on host cell receptors but functions by cleaving sialic acid interactions to release progeny virus. Because both HA and NA interact with sialic acid on the host cell surface with opposing effects, their balance is essential for optimal viral infectivity. However, the evolutionary constraints that maintain HA and NA function, while conserving a functional balance, are not fully understood. I adapted the comprehensive and systematic mutational scanning technology, termed EMPIRIC (Exceedingly Meticulous and Parallel Investigation of Randomized Individual Codons), to investigate the local fitness landscape of regions of HA under standard conditions and under drug pressure. We observed that synonymous substitutions had a higher mean absolute fitness effect in the signal than a neighboring HA region used as a control. Folding ∆G calculations revealed a hairpin loop that appeared to be differentially enriched between human and swine IAV variants in sequences of circulating strains. However, the molecular mechanism resulting in the observed host species-specific constraints remains undefined. Studying the fitness landscape of the receptor binding site of HA revealed the high sensitivity of this region to mutation. However, modulating the levels of NA activity by mutation and by using the NA inhibitor oseltamivir enabled the identification of HA mutations with adaptive potential under selection pressure by oseltamivir. These results highlight the importance of the HA-NA functional balance virus replication and in the development of resistance to oseltamivir inhibitors. These studies provide improved understanding of IAV biology, and can inform the development of improved antiviral agents with reduced likelihood for resistance.

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