Dans le rachitisme hypophosphatémique lié à l’X (XLH), MEPE (Matrix Extracellular PhosphoglycoprotEin), une protéine non collagénique impliquée dans la biominéralisation, subit un clivage pathologique de son extrémité C-terminale. Les peptides ainsi libérés sont porteurs d’un domaine ASARM (acidic serine- and aspartate- rich motif) très conservé dans l’évolution. ASARM inhibe la réabsorption tubulaire du phosphate et la minéralisation de la matrice extracellulaire osseuse. Précédemment, notre équipe a identifié des taux élevés de ce peptide ASARM dérivé de MEPE dans la dentine issue de patients XLH. Ce travail a pour objectif principal d’étudier l’effet d’ASARM sur la minéralisation dentinaire afin de mieux comprendre son implication dans les anomalies dentaires observées chez les malades. Des lattis de collagène ensemencés avec des cellules souches pulpaires SHEDs (Dental pulp stem cells derived from deciduous teeth) englobés dans une tranche de dent humaine ont été cultivés dans des conditions d’induction odontoblastique avec et sans 20 µM de chacune des formes phosphorylé (p-ASARM) ou non phosphorylé (np-ASARM) du peptide recombinant. La minéralisation a été appréciée par microscopie électronique à balayage et colorations de von Kossa. L’expression des marqueurs odontogéniques (DSPP, ostéocalcine, MEPE) a été évaluée par immunohistochimie, qPCR et Western-blot. Parallèlement, des billes d’agarose imprégnées p-ASARM et np-ASARM ont été implantées dans un modèle d’effraction pulpaire chez le rat, dans lequel un pont de dentine de réparation se forme spontanément. La minéralisation dans la chambre pulpaire a été évaluée par micro-CT et immunohistochimie. Dans le modèle in vitro 3D, p-ASARM a inhibé la différenciation des SHEDs, ce qui s’est traduit par 1) l’absence de formation de nodule de minéralisation, 2) la diminution des marqueurs odontogéniques, 3) la surexpression de MEPE, comparativement au contrôle ou au traitement du milieu par np-ASARM. In vivo, p-ASARM a perturbé le processus de réparation dentinaire et a entrainé une surexpression de MEPE. Ces résultats confirment notre hypothèse selon laquelle p-ASARM inhibe la différenciation odonblastique et la minéralisation de la dentine. De plus, l’effet inducteur de p-ASARM sur l’expression de MEPE suggère l’existence d’une boucle de rétrocontrôle positif impliquée dans l’étiopathogénie du XLH. Ainsi, les défauts de minéralisation de la dentine hypophosphatémique sont probablement une conséquence de la libération du peptide ASARM dans la matrice extracellulaire. / In X-linked familial hypophosphatemic rickets (XLH), MEPE (Matrix Extracellular PhosphoglycoprotEin) is cleaved, releasing phosphorylated ASARM (acidic serine- and aspartate- rich motif) peptides that inhibit mineralization of bone extracellular matrix (ECM), and renal tubular phosphate reabsorption. We recently identified high levels of MEPE-derived ASARM peptides in human XLH dentin. The present study was aimed to investigate their effects on dentin mineralization in order to better understand their role in the etiology of tooth abnormalities observed in XLH patients. Dental pulp stem cells derived from deciduous teeth (SHEDs) were seeded in a collagen scaffold, cultured in human tooth slices under mineralizing conditions as a control, and with 20 µM of either phosphorylated (p-ASARM) or non-phosphorylated (np-ASARM) MEPE-derived ASARM peptides. Mineralization was assessed by scanning electron microscopy and von Kossa staining. Odontogenic markers (DSPP, osteocalcin, MEPE) were assessed by immunohistochemistry, RT-PCR and Western blot. In parallel, agarose beads soaked with recombinant ASARM peptides were implanted in a rat pulp injury model where a reparative dentin bridge is spontaneously formed; the repair process was evaluated by micro-CT and IHC. In the tooth slice culture model, p-ASARM inhibited SHED differentiation, with 1) no formation of mineralization nodule, 2) decreased odontogenic marker expression, and 3) up-regulation of MEPE expression, in contrast with np-ASARM and control. In the rat pulp injury model, p-ASARM impaired the formation of the reparative dentin bridge and increased MEPE expression. The present data support our hypothesis that p-ASARM impairs odontogenic differentiation process and the resulting mineralization of dentin. Moreover, the identification of a stimulating effect of p-ASARM on MEPE expression suggests a positive feedback loop in the pathogenicity of XLH disease. Accordingly, the mineralized defects in XLH tooth dentin may be a direct consequence of the release of ASARM peptides in the ECM.

Le syndrome de Joubert est une maladie récessive caractérisée par une malformation congénitale distincte du tronc cérébral et du cervelet, associée à une anomalie des mouvements oculaires (apraxie oculomotrice), une respiration irrégulière, un retard de développement, et une ataxie à la démarche. Au cours de la dernière décennie, plus de 20 gènes responsables ont été identifiés, tous ayant un rôle important dans la structure et la fonction des cils primaires. Ainsi, le syndrome de Joubert est considéré une ciliopathie. Bien que le Syndrome de Joubert ait été décrit pour la première fois dans une famille canadienne-française en 1969, le(s) gène(s) causal demeurait inconnu dans presque tous les cas de syndrome de Joubert recensés en 2010 dans la population canadienne-française, soit début de mon projet doctoral. Nous avons identifié un total de 43 individus canadiens-français (35 familles) atteints du syndrome de Joubert. Il y avait un regroupement de familles dans la région du Bas-Saint-Laurent de la province de Québec, suggérant la présence d'un effet fondateur. L’objectif de ce projet était de caractériser la génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française. Notre hypothèse était qu’il existait un effet fondateur impliquant au moins un nouveau gène JBTS. Ainsi, dans un premier temps, nous avons utilisé une approche de cartographie par homozygotie. Cependant, nous n’avons pas identifié de région d’homozygotie partagée parmi les individus atteints, suggérant la présence d’une hétérogénéité génétique ou allélique. Nous avons donc utilisé le séquençage exomique chez nos patients, ce qui représente une approche plus puissante pour l’étude de conditions génétiquement hétérogènes. Nos travaux ont permis l’identification de deux nouveaux gènes responsables du syndrome de Joubert: C5orf42 et TMEM231. Bien que la localisation cellulaire et la fonction de C5orf42 soient inconnus au moment de cette découverte, nos résultats génétiques combinés avec des études ultérieures ont établi un rôle important de C5orf42 dans la structure et la fonction ciliaire, en particulier dans la zone de transition, qui est une zone de transition entre le cil et le reste de la cellule. TMEM231 avait déjà un rôle établi dans la zone de transition ciliaire et son interaction avec d’autres protéines impliquées dans le syndrome de Joubert était connu. Nos études ont également identifié des variants rares délétères chez un patient JBTS dans le gène ciliaire CEP104. Nous proposons donc CEP104 comme un gène candidat JBTS. Nous avons identifié des mutations causales dans 10 gènes, y compris des mutations dans CC2D2A dans 9 familles et NPHP1 dans 3 familles. Au total, nous avons identifié les mutations causales définitives chez 32 des 35 familles étudiées (91% des cas). Nous avons documenté un effet fondateur complexe dans la population canadienne-française avec de multiples mutations récurrentes dans quatre gènes différents (C5orf42, CC2D2A, TMEM231, NPHP1). Au début de ce projet de recherche, l’étiologie génétique était inconnue chez les 35 familles touchées du syndrome de Joubert. Maintenant, un diagnostique moléculaire définitif est identifié chez 32 familles, et probable chez les 3 autres. Nos travaux ont abouti à la caractérisation génétique du syndrome de Joubert dans la population canadienne-française grâce au séquençage exomique, et révèlent la présence d'un effet fondateur complexe avec une l'hétérogénéité allélique et intralocus importante. Ces découvertes ont éclairé la physiologie de cette maladie. Finalement, l’identification des gènes responsables ouvre de nouvelles perspectives diagnostiques ante-natales, et de conseils génétique, très précieuses pour les familles. / Joubert syndrome (JBTS) is a primarily autosomal recessive disorder characterized by a distinctive mid-hindbrain/cerebellum malformation, eye movement abnormalities (oculomotor apraxia), irregular breathing, developmental delay, and ataxia. Over the past decade, over 20 causal genes have been identified, all of which have an important role in the structure and function of the primary cilia. Thus, JBTS joins an expanding category of diseases termed “ciliopathies”. Though JBTS was first described in affected siblings of a French Canadian (FC) family in 1969, the underlying genesis basis of the disorder was unknown in the overwhelming majority of FC cases at the onset of this doctoral project in 2010. We identified a total of 43 FC individuals with JBTS from 35 families. We observed a clustering of the affected families in the Lower Saint-Lawrence region of the province of Quebec, suggesting the presence of a founder effect. The aim of this doctoral project was to characterize the genetic landscape of JBTS in the FC population, and we hypothesized the presence of a founder effect in novel JBTS gene(s). Therefore, we initially used a homozygosity mapping approach. However, we did not identify any shared regions of homozygosity amongst affected individuals, suggesting the presence of genetic and/or allelic heterogeneity. We therefore primarily used a whole exome sequencing approach in our JBTS patients, a strategy that is better suited for the study of genetically heterogeneous conditions. Our work has resulted in the identification of two novel JBTS genes: C5orf42 and TMEM231. In total, we have identified causal mutations in C5orf42 in 14 families (including the original JBTS family described in 1969), and TMEM231 in 2 families. Though the function and cellular localization of C5orf42 was not known at the time of the publication of our manuscript, our genetic findings combined with subsequent animal and cellular work establish the important role of C5orf42 in ciliary structure and function, particularly at the ciliary transition zone. TMEM231 had been previously shown to localize to the ciliary transition zone and interact with several JBTS gene products. We also identified deleterious rare variants in one JBTS patient in the ciliary gene CEP104, implicating CEP104 as a strong candidate JBTS gene. We identified causal mutations in 10 JBTS genes, including CC2D2A in 9 families and NPHP1 in 3 families. Definite causal mutations were identified in 32 of 35 families (91% of cases). We documented a complex founder effect in the FC population with multiple recurrent mutations in 4 different genes (C5orf42, CC2D2A, TMEM231, NPHP1). Prior to the start of this research endeavor, the underlying genetic etiology of Joubert syndrome was unknown in all 35 families. Now, a definite molecular diagnosis has been identified in 32 families, and a probable molecular diagnosis in the remaining 3. Therefore, our work has resulted in the unraveling of the genetic basis of JBTS in the French-Canadian population using WES, and reveals the presence of a complex founder effect with substantial locus and allelic heterogeneity.

Made available in DSpace on 2016-01-26T12:51:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 andreluizmarcalterreri_tese.pdf: 1424254 bytes, checksum: ce6957bfb32d6676367e8e7ed0411ad5 (MD5) Previous issue date: 2007-06-19 / The objective of this study was to evaluate 2 classification criteria used in the prioritization of dental caries treatment in the Family Health Program. The research took place in the city of Ipiguá SP and included 538 five to twelve year-old children registered in public schools and attended by the local Family Health Unit. An oral examination and the fulfilling of the two classification criteria were done for the same children in order to evaluate the priorities in curative odontological care resulting from each of the criterion. Among the 538 children who were examined there were 313 (58,3%) in need of curative treatment. Based on the activity of the caries, it was possible to verify that 236 children (75,4%) were considered first priority in odontological care, while the criterion based on the amount and the size of the cavity included 73 children (23,4%). According to the criteria, 186 children (59,4%%) did not fit into the same priority of curative treatment for caries. The criteria for classification of caries used in the registration of the oral health conditions are very different in determining the priority of curative odontological treatment. Therefore, more studies related to the subject should allow creating a pattern for registration of the oral health conditions of children who use the Family Health Program. / O objetivo deste trabalho foi avaliar dois critérios utilizados no Programa Saúde da Família (PSF) para determinação da prioridade do atendimento odontológico curativo da cárie. O estudo foi feito no município de Ipiguá SP, entre 538 crianças de cinco a doze anos de idade, matriculadas na rede pública de ensino e atendidas na Unidade de Saúde da Família da cidade. Realizou-se o exame bucal e preenchimento de dois critérios de classificação para as mesmas crianças, para avaliar as prioridades no atendimento odontológico curativo resultantes de cada um dos critérios. Entre as 538 crianças examinadas havia 313 (58,3%) com necessidade de tratamento curativo. Com base na atividade da doença cárie, verificou-se que 236 crianças (75,4%) foram consideradas como primeira prioridade no atendimento odontológico, enquanto que o critério baseado na quantidade e tamanho da cavidade de cárie incluiu 73 crianças (23,4%). Conforme os critérios, 186 crianças (59,4%) não estiveram presentes na mesma prioridade de tratamento curativo para a cárie. Os dois critérios utilizados no PSF foram bastante diferentes na determinação da prioridade do atendimento odontológico curativo da cárie. Conclui-se que para determinar a prioridade do tratamento restaurador da cárie é necessário considerar a atividade da doença, a quantidade de cavidades e a necessidade de tratamento. Assim, mais pesquisas neste contexto devem permitir a padronização do cadastramento das condições de saúde bucal de crianças usuárias do PSF.

Les soins pulpaires en denture lactéale sont les soins fréquemment réalisés en odontologie pédiatrique et la réaction pulpaire ainsi que les mécanismes de réparation tissulaire lors d’un traumatisme ne sont pas très bien connus ou investigués. En se référant à la littérature dentaire, on constate que les recherches sont souvent focalisées sur la denture définitive.<p>Objectifs<p>1) Etudier l’influence du traitement avec divers matériaux sur la formation dentinaire, la structure tissulaire et le degré d’inflammation.<p>2) Acquérir des connaissances sur l’interaction à l’interface matériau/tissu.<p>3) Etudier le rôle de la voie de signalisation Notch (1 et 2) dans le processus de remaniement et réparation du tissu pulpaire en cas de traumatisme.<p>Matériels et méthodes<p>Deux types de soins pulpaires, la pulpotomie et le coiffage direct, sont réalisés sur les dents lactéales porcines et les résultats sont étudiés après 3 périodes :7 jours, 21-28 jours et 90 jours.<p>La pulpotomie :8 matériaux, 10 dents par matériau, 2 matériaux par cochon et par période pour un total de 240 dents.<p>Le coiffage direct :10 matériaux, 10 dents par matériau, 2 matériaux par cochon et par période pour un total de 300 dents.<p>Par la suite, différentes techniques ont été utilisées :<p>1. La microscopie optique :étude des coupes histologiques après coloration.<p>2. La microscopie électronique à transmission :observer les caractéristiques morphologiques du tissu pulpaire et analyser les structures cellulaires en détail. L’objectif principal de cette recherche était centré sur les biomatériaux pour la période de 21-28 jours afin d’examiner l’interaction entre le biomatériau et le complexe dentino-pulpaire après leur placement.<p>12<p>3. La voie de signalisation Notch (1 et 2): investiguer l’intervention éventuelle de cette voie dans le processus de régénération tissulaire par différenciation des cellules pour les deux périodes de 7 et 21-28 jours pour tous les matériaux utilisés.<p>Résultats<p>A. Microscopie optique :<p>1. La pulpotomie :les biomatériaux provoquent moins d’infiltrat de cellules inflammatoires au niveau du tissu pulpaire et favorisent la déposition dentinaire.<p>2. Le coiffage direct :on obtient les mêmes résultats que dans le cadre de la pulpotomie.<p>B. Microscopie électronique en transmission :<p>1. L’induction du tissu calcifié ou la formation de néo-dentine s’est seulement produite au niveau du site de l’exposition après le placement des biomatériaux dans les 2 types du traitement (pulpotomie & coiffage direct). En revanche aucune formation du tissu calcifié n’a été observée dans le parenchyme pulpaire à distance du site de l’exposition.<p>2. Cet examen montre que les cellules en contact des biomatériaux ou même à proximité de ces derniers présentent un réticulum endoplasmique élargi parallèle à la longueur de la cellule. Des mitochondries, plusieurs appareils de Golgi et des éléments denses sont observés dans le cytoplasme cellulaire.<p>3. Cet examen a également montré que le MTA et le WPC, considérés par la littérature dentaire comme non-résorbables, sont phagocytés par les cellules histiocytaires.<p>C. Voie de signalisation de Notch :<p>Nos recherches n’ont pas montré de marquage concluant pour aucun de matériaux sauf dans le cadre de coiffage direct pour les dents traitées au MTA et Ca(OH)2 pour la période de 7 jours. Par contre, aucun marquage n’est observé après 21-28 jours. / Doctorat en Sciences dentaires / info:eu-repo/semantics/nonPublished