Interleukin-10 ist ein Paradebeispiel eines immunhemmenden Zytokins. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe von Tumoren Interleukin-10 produziert, um einer Antitumor-Immunantwort zu entgehen. Viele Studien haben sich mit dem Einfluss von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierenden Fähigkeiten der Dendritischen Zellen beschäftigt. Es gibt eindeutige Hinweise, dass der Effekt von tumorproduziertem Interleukin-10 nicht nur in einer hemmenden Wirkung auf die Ausreifung Dendritischer Zellen besteht, sondern dass Interleukin-10 zu einer Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen führen kann. Ziel dieser Arbeit ist es daher, den Mechanismus für eine solche depletierende Wirkung auf die Dendritischen Zellen zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von Interleukin-10 auf die frühe Differenzierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten untersucht. Die Zugabe von Interleukin-10 zu einem Differenzierungscocktail aus Interleukin-4 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor führt zu einer nachhaltigen Hemmung des Differenzierungsprozesses von Monozyten zu Dendritischen Zellen. Bereits 48h nach Beginn der Zellkultur konnte mit Hilfe von cDNA-Microarray-Analysen gezeigt werden, dass Interleukin-10 nicht nur einen Differenzierungs-hemmenden Effekt ausübt, sondern auch die Entstehung aberranter Zellphänotypen bewirkt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Effekte des Interleukin-10 in der frühen Differenzierungsphase weitgehend irreversibel sind. Zusammenfassend können die Ergebnisse zur Erklärung beitragen, wie es bei Patienten mit Tumoren unter dem Einfluss von Interleukin-10 zu einer Reduktion der absoluten Zahl Dendritischer Zellen kommen kann.

Interleukin-10 ist ein Paradebeispiel eines immunhemmenden Zytokins. Es konnte nachgewiesen werden, dass eine Reihe von Tumoren Interleukin-10 produziert, um einer Antitumor-Immunantwort zu entgehen. Viele Studien haben sich mit dem Einfluss von Interleukin-10 auf die antigenpräsentierenden Fähigkeiten der Dendritischen Zellen beschäftigt. Es gibt eindeutige Hinweise, dass der Effekt von tumorproduziertem Interleukin-10 nicht nur in einer hemmenden Wirkung auf die Ausreifung Dendritischer Zellen besteht, sondern dass Interleukin-10 zu einer Reduktion der Anzahl an Dendritischen Zellen führen kann. Ziel dieser Arbeit ist es daher, den Mechanismus für eine solche depletierende Wirkung auf die Dendritischen Zellen zu analysieren. Hierzu wurden die Effekte von Interleukin-10 auf die frühe Differenzierung von Dendritischen Zellen aus Monozyten untersucht. Die Zugabe von Interleukin-10 zu einem Differenzierungscocktail aus Interleukin-4 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie-stimulierendem-Faktor führt zu einer nachhaltigen Hemmung des Differenzierungsprozesses von Monozyten zu Dendritischen Zellen. Bereits 48h nach Beginn der Zellkultur konnte mit Hilfe von cDNA-Microarray-Analysen gezeigt werden, dass Interleukin-10 nicht nur einen Differenzierungs-hemmenden Effekt ausübt, sondern auch die Entstehung aberranter Zellphänotypen bewirkt. In weiteren Experimenten konnte gezeigt werden, dass die Effekte des Interleukin-10 in der frühen Differenzierungsphase weitgehend irreversibel sind. Zusammenfassend können die Ergebnisse zur Erklärung beitragen, wie es bei Patienten mit Tumoren unter dem Einfluss von Interleukin-10 zu einer Reduktion der absoluten Zahl Dendritischer Zellen kommen kann.:1. Verzeichnis der Abkürzungen 5 2. Einleitung 7 Fragestellung 11 3. Material und Methoden 12 3.1 Verwendete Materialien 12 3.1.1 Reagenzien für Zellseparation und Zellkultur 12 3.1.2 Stimulatoren 12 3.1.3 Reagenzien für FACS-Analysen 12 3.1.4 Molekularbiologische Reagenzien und Puffer 13 3.1.4.1 RNA-Isolierung 13 3.1.4.2 RT-PCR 13 3.1.4.3 cDNA Microarrays 14 3.2 Zellen und Kulturbedingungen 15 3.2.1 Isolierung von Monozyten aus dem peripheren Blut 15 3.2.2 Ausreifung von Monozyten zu Dendritischen Zellen 16 3.3 Durchflusszytometrie 17 3.4 RNA Isolierung 18 3.4.1 Prinzip und Protokoll der RNA-Isolierung 18 3.4.2 Quantifizierung der RNA und Bestimmung der Reinheit 19 3.4.2.1 Photometrische Bestimmung der RNA-Konzentration 19 3.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 20 3.4.2.3 RNA-Fällung 21 3.5 cDNA Expressions-Ansätze 22 3.5.1 mRNA-Amplifikation 22 3.5.2 Membranmarkierung 23 3.5.2.1 Prinzip des cDNA-Array 23 3.5.2.2 Probensynthese 24 3.5.2.3 Aufreinigung 25 3.5.2.4 Hybridisierung der Nylonmembran 25 3.5.2.5 Auswertung der Ergebnisse 27 3.6 Statistische Auswertung 27 4. Ergebnisse 28 4.1 Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von IL-4 und GM-CSF 28 4.2 Ermittlung der wirksamen hemmenden Konzentration von IL-10 29 4.3 Einfluss von IL-10 während der Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 30 4.3.1 Oberflächenexpression nach 7 Tagen 30 4.3.2 Oberflächenexpression nach 2 Tagen 32 4.3.3 Oberflächenexpression nach 24 Stunden und 48 Stunden für die Chemokinrezeptoren CCR1 und CCR7 33 4.4 Ausreifung von unreifen Dendritischen Zellen zu reifen Dendritischen Zellen unter dem Einfluss von KLH, TNF-α und GM-CSF 36 4.5 Kann eine adäquate Ausreifung die hemmenden Effekte von IL-10 überwinden? 37 4.6 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 38 4.7 Genexpressionsmuster in der frühen Phase der Differenzierung Dendritischer Zellen 40 5. Diskussion 49 5.1 Hintergrund 49 5.2 Einfluss von IL-10 auf die Differenzierung von Monozyten zu unreifen Dendritischen Zellen 51 5.3 Einfluss von IL-10 während der Ausreifung Dendritischer Zellen 53 5.4 Genexpression 55 5.4.1 Übersicht 55 5.4.2 Regulation von CCR1 und CCR2 durch IL-10 56 5.4.3 Regulation von IL-1ß und IL-1R1 durch IL-10 58 5.4.4 Regulation von S100A8 und S100A9 durch IL-10 59 5.5 Biologische Bedeutung 61 6. Zusammenfassung 63 7. Literaturverzeichnis 67