Submitted by Neusa Fagundes (neusa.fagundes@unioeste.br) on 2018-07-12T13:40:55Z No. of bitstreams: 2 Gabriela_Bronczek2018.pdf: 2363715 bytes, checksum: 1e18d95b6ab4cde85b4747bc5aac855a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-12T13:40:55Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Gabriela_Bronczek2018.pdf: 2363715 bytes, checksum: 1e18d95b6ab4cde85b4747bc5aac855a (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2018-03-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Appropriate control of glycaemia in type 1 diabetic patients (T1D) needs daily insulin administration, which can lead to hypoglycemic events and others side effects. Therefore, it is important to find endogenous molecules, without side effects, for T1D treatment. In this sense, the biliary acid conjugated with taurine, tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) presents positive effects in type 2 diabetes treatment. However, its beneficial effects on T1D have been less explored. Thus, we have assessed the effects of TUDCA on glycemic control in streptozotocin-induced diabetic mice. For this, C57BL/6 mice received intraperitoneal (i.p.) administration of streptozotocin (40mg/kg, streptozotocin was dissolved in 0,5 M citrate buffer, pH 4,5) for 5 days, STZ group (n=22). Whereas control (CON) group (n=6) received the same volume of citrate buffer. Once confirmed diabetes in the STZ group, diabetic mice were randomly selected and allocated in the 2 following groups: 1) STZ group (n=10) that received i.p. PBS, and 2) STZ+TUDCA group (n=12) that received i.p. 300 mg/kg TUDCA (dissolved in PBS). These treatments were maintained for 24 days. After 15 days of treatment, STZ+TUDCA mice showed a 43% reduction in blood glucose, compared with STZ. This reduction was probably due to an increase in insulinemia. This increase in insulinemia may be explained, at least in part, by a reduction in hepatic activity of IDE (insulin degrading enzyme) the enzyme responsible for insulin degradation, as well as by an increase in beta cell mass and higher beta cell number per islet. All together, these effects contributed to the improvement of metabolic flexibility. In conclusion, TUDCA shows therapeutic potential for the control of glycemia in T1D. / Pacientes com Diabetes Mellitus do tipo 1 (DM1) necessitam de administração diária de insulina exógena, o que pode causar eventos de hipoglicemia e outros efeitos colaterais. Diante disso, é de extrema importância encontrar moléculas endógenas que possam ser utilizadas no controle glicêmico no DM1 e que não apresentem efeitos colaterais. Nesse sentido, o ácido biliar conjugado com taurina, ácido tauroursodesoxicólico (TUDCA), tem se mostrado eficaz no tratamento do Diabetes Mellitus do tipo 2; contudo, sua eficiência no tratamento do DM1 tem sido menos explorada. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos do TUDCA no controle glicêmico de camundongos com DM1. Para tanto, foram utilizados camundongos C57BL/6 divididos inicialmente em dois grupos: 1) Grupo controle (CTL n=6), que recebeu injeção intraperitoneal (i.p.) de tampão citrato de sódio (0,5 M, pH 4,5) e 2) Grupo estreptozotocina (STZ n=22), o qual recebeu uma dose i.p. de 40mg/kg de STZ (dissolvida em tampão citrato de sódio 0,5 M, pH 4,5) durante cinco dias para indução do DM1. Uma vez instalado o DM1 no grupo STZ, esse foi subdividido em dois grupos: 1) STZ (n=10), que recebeu injeção i.p. de PBS e 2) STZ+TUDCA (n=12), que recebeu uma dose i.p. de 300 mg/kg de TUDCA (dissolvido em PBS). Essas administrações foram executadas diariamente durante 24 dias. Após 15 dias de tratamento, os animais do grupo STZ+TUDCA apresentaram redução de 43% na glicemia, comparado ao grupo STZ. Essa redução da glicemia, provavelmente, deveu-se a um aumento da insulinemia, observada ao final do tratamento. Esse aumento da insulinemia pode ser explicado, pelo menos em parte, pela redução da atividade hepática da IDE (insulin degrading enzyme), responsável pela degradação da insulina, bem como pelo aumento da massa de células beta e da quantidade dessas células por ilhota. Juntos, esses efeitos contribuíram para a melhora na flexibilidade metabólica nos camundongos STZ+TUDCA. Concluímos, então, que o TUDCA apresenta potencial terapêutico para o controle da glicemia no DM1.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune crônica, durante a qual as células beta pancreáticas, responsáveis pela secreção de insulina, são seletivamente destruídas. O desenvolvimento desta doença é uma consequência da predisposição genética combinada a fatores ambientais largamente desconhecidos e eventos estocásticos. Neste trabalho foi proposta a comparação da expressão gênica transcricional em grande escala (transcriptoma) entre amostras de pacientes de DM1 e controles, obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As alterações resultantes na expressão gênica causada pela doença podem ser amostradas em PBMCs, uma vez que as células imunes efetoras estão presumivelmente em equilíbrio com a população celular circulante. A fim de identificar alterações na expressão gênica, foram utilizados métodos analíticos como a tecnologia de microarrays e o cálculo do coeficiente de correlação de Pearson, sendo possível observar aumento ou diminuição na expressão gênica e também a magnitude desta mudança. Além disso, foi realizada análise de grupos gênicos (gene sets ou GSA), método baseado na significância de conjuntos gênicos pré-definidos, ao invés de genes individuais. Este procedimento é mais adequado para análise de uma doença poligênica, tal como o DM1. A análise de GSA possibilitou a seleção de genes envolvidos, por exemplo, nas seguintes vias: cascata de I-kappaB kinase/NF-kappaB, regulação da via de sinalização do receptor de TGF-ß, regulação da cascata de JAK-STAT e via de sinalização mediada por citocinas e quimiocinas, das quais podem ser identificados marcadores transcricionais. A análise imparcial do transcriptoma de PBMCs permitiu a identificação de gene sets e genes associados ao DM1, seu perfil de expressão preferencial em tipos celulares do sistema imune e seus padrões de modulação. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic autoimmune disease, in which the pancreatic beta cells responsible for secretion of insulin are selectively destroyed. The development of this disease is a result of genetic predisposition combined with largely unknown environmental factors and stochastic events. In this work it was proposed to compare the large scale transcriptional gene expression (transcriptome) between samples obtained from T1DM patients and healthy controls, obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The resulting changes in gene expression caused by the disease can be sampled in PBMCs, as immune effector cells are presumably in equilibrium with the circulating cell population. In order to identify changes in gene expression, we used analytical methods such as microarray technology and calculating the Pearson correlation coefficient, where it was possible to observe increases or decreases in gene expression and also the magnitude of change. Furthermore, we performed a gene set analysis (GSA) method based on the significance of predefined gene sets instead of individual genes. This procedure is more suitable for analyzing a polygenic disease such as T1DM. GSA analysis enabled the selection of genes involved for example, in the following pathways: I-kappaB kinase/NF-kappaB cascade, regulation of TGF-ß receptor signaling pathway, regulation of JAK-STAT cascade and cytokine and chemokine mediated signaling pathway, from which transcriptional markers can be identified. An unbiased transcriptome analysis of PBMCs allowed the identification of gene sets and genes associated with T1DM, its preferential expression profile in cell types of the immune system and its modulation patterns.

O Diabetes Mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença metabólica multifatorial caracterizada por hiperglicemia e hipoinsulinemia crônicas, decorrentes da destruição progressiva das células &#946 pelo sistema imunológico. Durante a progressão do DM1, as ilhotas de Langherhans são invadidas por células do sistema imune que secretam citocinas pró-inflamatórias, gerando um quadro denominado insulite. A exposição das células &#946 a essas citocinas leva a ativação de diversas vias de sinalização que aumentam o estresse oxidativo e de retículo endoplasmático, contribuindo para a indução da morte das células &#946. Existem muitos estudos que investigam as vias moleculares que levam à destruição da célula durante o DM1, contudo é necessário um melhor entendimento da regulação e contribuição dessas diferentes vias para o desenvolvimento dessa patologia para que se possa desenhar terapias mais apropriadas para impedir seu desenvolvimento ou até mesmo para se atingir uma cura. Algumas das dificuldades encontradas na aplicação desses estudos estão relacionadas ao fato de que eles são conduzidos em sua maioria em células &#946 ou ilhotas isoladas em cultura. Sabe-se que há uma importante regulação entre os diferentes tipos celulares presentes na ilhota e também entre as células da ilhota e as células adjacentes a ela, o que, sem dúvida, influencia no destino da célula &#946 frente a um ataque autoimune. Este trabalho visou aperfeiçoar o conhecimento acerca do comportamento das células da ilhota pancreática frente ao desenvolvimento do DM1, utilizando técnicas de imunomarcação em cortes histológicos pancreáticos de três modelos animais de DM1. No primeiro modelo: Influência do exercício físico na indução do DM1, mostramos que o exercício físico é capaz de prevenir a destruição das células &#946 e potencialmente estar envolvido na transdiferenciação celular para recuperação de células endócrinas na ilhota desses animais. No segundo modelo: Efeito de NOX1 e NOX2 na viabilidade e função de células &#946 \", observamos que a presença dessas NADPH oxidases parece ter influência na estrutura e provavelmente na viabilidade de células &#946. No terceiro modelo: Papel de HNF4 &#945 na viabilidade e função das células &#946, mostramos que a imunomarcação das ilhotas de animais KO para esse fator de transcrição nas células &#946 é uma ferramenta de extrema importância para esse estudo. O desenvolvimento desse trabalho possibilita que a investigação de diferentes vias envolvidas na destruição das células &#946 seja realizada no ambiente em que essas células se encontram, permitindo avaliar a ativação de vias especificas, como por exemplo ativação de NF-kB e validar os resultados observados em células isoladas. / Type 1 Diabetes Mellitus (DM1) is a multifactorial metabolic disease characterized by chronic hyperglycemia and hypoinsulinemia, which is due to the progressive and specific destruction of &#946 cells by the immune system. During the progression of DM1, the islets of Langherhans are invaded by cells of the immune system that secrete proinflammatory cytokines, in a process called insulitis. Exposure of &#946 cells to these cytokines leads to the activation of several signaling pathways that increase oxidative and endoplasmic reticulum stress, contributing to the -cell death. There are many studies that investigate the molecular pathways that lead to the destruction of the &#946-cell during DM1, but a better understanding of the regulation and contribution of these different pathways to the development of this pathology is necessary in order to design more appropriate therapies to prevent their development or even to achieve a cure. Some of the difficulties encountered in the application of these studies are related to the fact that they are conducted mostly on &#946-cells or isolated islets in cell culture. It is known that there is an important regulation between the different cell types present in the islet and also between the islet cells and the cells adjacent to it, which undoubtedly influences the fate of the &#946-cell against an autoimmune attack. This work aimed to improve the knowledge about the behavior of pancreatic islet cells in the development of DM1, using immunostaining techniques in pancreatic histological sections of three animal models of DM1. In the first model, \"Influence of physical exercise on the induction of DM1\", we showed that physical exercise is able to prevent the destruction of &#946 cells and potentially be involved in cell transdifferentiation for the recovery of endocrine cells in the islet of these animals. In the second model, \"Effect of NOX1 and NOX2 on viability and &#946 cell function\", we observed that the presence of these NADPH oxidases appears to influence the structure and probably the viability of &#946 cells. \"In the third model:\" Role of HNF4&#945 in viability and &#946 cell function, we show that the immunostaining of islets of KO animals for this transcription factor in &#946 cells is a tool of paramount importance for this study. The development of this work enables the investigation to be performed in the environment of these cells, allowing to evaluate the activation of specific pathways and validate the results observed in isolated cells.

O diabetes mellitus do tipo 1 (DM1) é uma doença autoimune crônica, durante a qual as células beta pancreáticas, responsáveis pela secreção de insulina, são seletivamente destruídas. O desenvolvimento desta doença é uma consequência da predisposição genética combinada a fatores ambientais largamente desconhecidos e eventos estocásticos. Neste trabalho foi proposta a comparação da expressão gênica transcricional em grande escala (transcriptoma) entre amostras de pacientes de DM1 e controles, obtidas a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). As alterações resultantes na expressão gênica causada pela doença podem ser amostradas em PBMCs, uma vez que as células imunes efetoras estão presumivelmente em equilíbrio com a população celular circulante. A fim de identificar alterações na expressão gênica, foram utilizados métodos analíticos como a tecnologia de microarrays e o cálculo do coeficiente de correlação de Pearson, sendo possível observar aumento ou diminuição na expressão gênica e também a magnitude desta mudança. Além disso, foi realizada análise de grupos gênicos (gene sets ou GSA), método baseado na significância de conjuntos gênicos pré-definidos, ao invés de genes individuais. Este procedimento é mais adequado para análise de uma doença poligênica, tal como o DM1. A análise de GSA possibilitou a seleção de genes envolvidos, por exemplo, nas seguintes vias: cascata de I-kappaB kinase/NF-kappaB, regulação da via de sinalização do receptor de TGF-ß, regulação da cascata de JAK-STAT e via de sinalização mediada por citocinas e quimiocinas, das quais podem ser identificados marcadores transcricionais. A análise imparcial do transcriptoma de PBMCs permitiu a identificação de gene sets e genes associados ao DM1, seu perfil de expressão preferencial em tipos celulares do sistema imune e seus padrões de modulação. / Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a chronic autoimmune disease, in which the pancreatic beta cells responsible for secretion of insulin are selectively destroyed. The development of this disease is a result of genetic predisposition combined with largely unknown environmental factors and stochastic events. In this work it was proposed to compare the large scale transcriptional gene expression (transcriptome) between samples obtained from T1DM patients and healthy controls, obtained from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The resulting changes in gene expression caused by the disease can be sampled in PBMCs, as immune effector cells are presumably in equilibrium with the circulating cell population. In order to identify changes in gene expression, we used analytical methods such as microarray technology and calculating the Pearson correlation coefficient, where it was possible to observe increases or decreases in gene expression and also the magnitude of change. Furthermore, we performed a gene set analysis (GSA) method based on the significance of predefined gene sets instead of individual genes. This procedure is more suitable for analyzing a polygenic disease such as T1DM. GSA analysis enabled the selection of genes involved for example, in the following pathways: I-kappaB kinase/NF-kappaB cascade, regulation of TGF-ß receptor signaling pathway, regulation of JAK-STAT cascade and cytokine and chemokine mediated signaling pathway, from which transcriptional markers can be identified. An unbiased transcriptome analysis of PBMCs allowed the identification of gene sets and genes associated with T1DM, its preferential expression profile in cell types of the immune system and its modulation patterns.

O diabetes mellitus do tipo 1 (T1D) é uma doença autoimune mediada por células T e caracterizada pela destruição seletiva das células ? pancreáticas produtoras de insulina. Células estromais mesenquimais (MSCs) e células tronco hematopoéticas (HSCs) são os principais componentes do nicho hematopoético na medula óssea. Estas células vêm sendo utilizadas nos últimos anos em transplantes autólogos para tratamento do T1D. O objetivo geral do presente trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica global de MSCs e HSCs de pacientes com T1D e compará-lo com células isoladas de indivíduos saudáveis através da técnica de microarray e programas específicos de bioinformática. As MSCs e HSCs foram isoladas da medula óssea de pacientes com T1D antes e após o tratamento com imunossupressão em altas doses seguida pelo transplante autólogo de células tronco hematopoéticas (AHSCT). As MSCs apresentaram valor elevado de expressão absoluta de diversas moléculas potencialmente relacionadas com suas funções de suporte à hematopoese. MSCs de pacientes diabéticos apresentaram perfil de expressão gênica global distinto das isoladas de indivíduos saudáveis, com hiper-regulação da sinalização via proteína G e hiporregulação da atividade transcricional. O receptor ?3 adrenérgico, assim como a sinalização simpática, foram hiper-expressos nas células dos pacientes. Genes que codificam moléculas que suportam a hematopoese e regulados pelo sistema nervoso simpático, VCAM1 e CXCL12, foram hiporregulados em nossa análise. Após o AHSCT, houve atenuação do perfil de expressão diferencial das MSCs dos pacientes, entretanto elas permaneceram com hiperatividade da sinalização via proteína G e déficit da atividade transcricional. As HSCs apresentaram altos níveis de expressão absoluta de diversas integrinas e receptores de citocinas e fatores de crescimento, potencialmente relacionados com funções na hematopoese. HSCs de pacientes com T1D apresentaram perfil de expressão gênica global distinto das de indivíduos saudáveis, com hiper-regulação de genes associados com a atividade transcricional. Os fatores de transcrição TCFL2 e p53, que têm papel fundamental na regulação do ciclo celular das HSCs, foram diferencialmente expressos entre as HSCs de pacientes diabéticos e controles. Assim, nossos resultados de expressão gênica global apontaram alterações intrínsecas nas HSCs e MSCs de pacientes diabéticos que podem estar relacionadas com a falha terapêutica dos transplantes autólogos. A implicação dessas alterações no desenvolvimento e patogênese do T1D permanece desconhecida e a realização de ensaios funcionais poderá esclarecer o significado biológico das mesmas. / Type 1 diabetes mellitus (T1D) is a T cell-mediated autoimmune disease, characterized by selective destruction of insulin-producing pancreatic ? cells. Mesenchymal stromal cells (MSCs) and hematopoietic stem cells (HSCs) are the main components of hematopoietic niches. In the last years, these cells are being used in autologous transplantation settings for T1D treatment. The main goal of this study was to evaluate the global gene expression profile of MSCs and HSCs from T1D patients, by using microarrays and bioinformatics specific programs. MSCs and HSCs were isolated from bone marrow of T1D patients before and after treatment with high dose immunossupression followed by hematopoietic stem cell transplantation. MSCs showed high absolute expression values of several molecules potentially related to their function of hematopoiesis support. MSCs from T1D patients exhibited distinct gene expression profile from control MSCs and presented up-regulation of the G protein-coupled receptor signaling pathway and down-regulation of transcriptional activity. The ?3 adrenergic receptor, as well the sympathetic nervous system signaling were up-regulated on patient´s cells. Genes that codify molecules which support hematopoeisis and are regulated by the symphatic nervous system, VCAM1 and CXCL12, were downregulated on our analysis. After AHSCT, there was an attenuation of the differential expression profile of MSCs from T1D patients, however they remained with G proteincoupled receptor signaling pathway hyperactivity and transcriptional activity deficit. HSCs exhibited high absolute expression values of integrins, cytokine receptors and growth factors, molecules potencially related to hematopoietic functions. HSCs from T1D patients showed distinct expression profile from control HSCs and demonstrated up-regulation of genes related to transcriptional activity. The transcription factors TCFL2 and p53, which have important role in regulating HSC cycle, were differentially expressed between HSCs from T1D patients and controls. Thus, our global gene expression analysis has revealed intrinsic alterations on MSCs and HSCs from T1D patients that could be related to the autologous transplant therapeutic failures. The implications of these alterations on the development and pathogenesis of T1D remain unknown and functional assays could unravel their biological meaning.

O Diabetes mellitus (DM) do tipo 1 é uma doença causada pela destruição, por mecanismo auto-imune, das células beta das ilhotas pancreáticas, produtoras de insulina. O tratamento convencional da doença é realizado por meio de injeções diárias de insulina exógena. O transplante de ilhotas pancreáticas inclui-se, atualmente, como uma das alternativas terapêuticas à insulinoterapia. Entretanto, para atingir a insulino-independência, é necessário transplantar um grande número de ilhotas por paciente. O conhecimento do mecanismo de proliferação das células beta pode possibilitar a realização do transplante a partir da expansão celular ex vivo. A glicose é um dos principais indutores da proliferação de células beta. Neste trabalho, foi estabelecida e executada a tecnologia de isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas humanas, visando sua estimulação com glicose. Para identificar genes regulados por glicose nestas ilhotas, foi utilizada a técnica de hibridização subtrativa SSH, associada ao rastreamento da biblioteca através de macroarranjos de DNA. Num primeiro rastreamento, foram identificados dois fragmentos gênicos induzidos pela glicose. Um destes apresentou homologia com uma proteína hipotética humana de função desconhecida e o segundo com o receptor de polipetídeo pancreático. Este trabalho permitiu a identificação de novos genes regulados pela glicose em ilhotas pancreáticas humanas, os quais podem estar relacionados à proliferação celular deste tecido. / Type 1 Diabetes mellitus (T1DM) is caused by autoimmune destruction of the insulin-producing pancreatic islet b-cells. Treatment is generally approached by daily subcutaneous injections of exogenous insulin. Nowadays, pancreatic islet transplantation is considered as an effective alternative treatment to insulin therapy. However, in order to reach insulin-independence, a large number of islets is required for each patient. Knowledge of the mechanisms regulating islet b-cell proliferation may allow ex-vivo b-cell expansion prior to transplant. Glucose is considered one of the main inducers of islet b-cells proliferation. We established and executed the technology of human islet isolation and purification. The islets were then stimulated in culture with glucose. In order to identify glucose-regulated genes in cultured human islets, we utilized the suppression subtractive hybridization (SSH) method, followed by cDNA library screening by DNA macroarrays. Preliminary screening allowed us to isolate two cDNAs displaying glucose regulation, one of which is similar to a human hypothetical protein of unknown function and the other shows similarity to the pancreatic polypeptide receptor. This work allowed identification of glucose-regulated genes in human pancreatic islets, which may be related to cell proliferation in this tissue.

O diabetes mellitus do tipo 1 (T1D) é uma doença autoimune mediada por células T e caracterizada pela destruição seletiva das células ? pancreáticas produtoras de insulina. Células estromais mesenquimais (MSCs) e células tronco hematopoéticas (HSCs) são os principais componentes do nicho hematopoético na medula óssea. Estas células vêm sendo utilizadas nos últimos anos em transplantes autólogos para tratamento do T1D. O objetivo geral do presente trabalho foi avaliar o perfil de expressão gênica global de MSCs e HSCs de pacientes com T1D e compará-lo com células isoladas de indivíduos saudáveis através da técnica de microarray e programas específicos de bioinformática. As MSCs e HSCs foram isoladas da medula óssea de pacientes com T1D antes e após o tratamento com imunossupressão em altas doses seguida pelo transplante autólogo de células tronco hematopoéticas (AHSCT). As MSCs apresentaram valor elevado de expressão absoluta de diversas moléculas potencialmente relacionadas com suas funções de suporte à hematopoese. MSCs de pacientes diabéticos apresentaram perfil de expressão gênica global distinto das isoladas de indivíduos saudáveis, com hiper-regulação da sinalização via proteína G e hiporregulação da atividade transcricional. O receptor ?3 adrenérgico, assim como a sinalização simpática, foram hiper-expressos nas células dos pacientes. Genes que codificam moléculas que suportam a hematopoese e regulados pelo sistema nervoso simpático, VCAM1 e CXCL12, foram hiporregulados em nossa análise. Após o AHSCT, houve atenuação do perfil de expressão diferencial das MSCs dos pacientes, entretanto elas permaneceram com hiperatividade da sinalização via proteína G e déficit da atividade transcricional. As HSCs apresentaram altos níveis de expressão absoluta de diversas integrinas e receptores de citocinas e fatores de crescimento, potencialmente relacionados com funções na hematopoese. HSCs de pacientes com T1D apresentaram perfil de expressão gênica global distinto das de indivíduos saudáveis, com hiper-regulação de genes associados com a atividade transcricional. Os fatores de transcrição TCFL2 e p53, que têm papel fundamental na regulação do ciclo celular das HSCs, foram diferencialmente expressos entre as HSCs de pacientes diabéticos e controles. Assim, nossos resultados de expressão gênica global apontaram alterações intrínsecas nas HSCs e MSCs de pacientes diabéticos que podem estar relacionadas com a falha terapêutica dos transplantes autólogos. A implicação dessas alterações no desenvolvimento e patogênese do T1D permanece desconhecida e a realização de ensaios funcionais poderá esclarecer o significado biológico das mesmas. / Type 1 diabetes mellitus (T1D) is a T cell-mediated autoimmune disease, characterized by selective destruction of insulin-producing pancreatic ? cells. Mesenchymal stromal cells (MSCs) and hematopoietic stem cells (HSCs) are the main components of hematopoietic niches. In the last years, these cells are being used in autologous transplantation settings for T1D treatment. The main goal of this study was to evaluate the global gene expression profile of MSCs and HSCs from T1D patients, by using microarrays and bioinformatics specific programs. MSCs and HSCs were isolated from bone marrow of T1D patients before and after treatment with high dose immunossupression followed by hematopoietic stem cell transplantation. MSCs showed high absolute expression values of several molecules potentially related to their function of hematopoiesis support. MSCs from T1D patients exhibited distinct gene expression profile from control MSCs and presented up-regulation of the G protein-coupled receptor signaling pathway and down-regulation of transcriptional activity. The ?3 adrenergic receptor, as well the sympathetic nervous system signaling were up-regulated on patient´s cells. Genes that codify molecules which support hematopoeisis and are regulated by the symphatic nervous system, VCAM1 and CXCL12, were downregulated on our analysis. After AHSCT, there was an attenuation of the differential expression profile of MSCs from T1D patients, however they remained with G proteincoupled receptor signaling pathway hyperactivity and transcriptional activity deficit. HSCs exhibited high absolute expression values of integrins, cytokine receptors and growth factors, molecules potencially related to hematopoietic functions. HSCs from T1D patients showed distinct expression profile from control HSCs and demonstrated up-regulation of genes related to transcriptional activity. The transcription factors TCFL2 and p53, which have important role in regulating HSC cycle, were differentially expressed between HSCs from T1D patients and controls. Thus, our global gene expression analysis has revealed intrinsic alterations on MSCs and HSCs from T1D patients that could be related to the autologous transplant therapeutic failures. The implications of these alterations on the development and pathogenesis of T1D remain unknown and functional assays could unravel their biological meaning.

O Diabetes mellitus (DM) do tipo 1 é uma doença causada pela destruição, por mecanismo auto-imune, das células beta das ilhotas pancreáticas, produtoras de insulina. O tratamento convencional da doença é realizado por meio de injeções diárias de insulina exógena. O transplante de ilhotas pancreáticas inclui-se, atualmente, como uma das alternativas terapêuticas à insulinoterapia. Entretanto, para atingir a insulino-independência, é necessário transplantar um grande número de ilhotas por paciente. O conhecimento do mecanismo de proliferação das células beta pode possibilitar a realização do transplante a partir da expansão celular ex vivo. A glicose é um dos principais indutores da proliferação de células beta. Neste trabalho, foi estabelecida e executada a tecnologia de isolamento e purificação de ilhotas pancreáticas humanas, visando sua estimulação com glicose. Para identificar genes regulados por glicose nestas ilhotas, foi utilizada a técnica de hibridização subtrativa SSH, associada ao rastreamento da biblioteca através de macroarranjos de DNA. Num primeiro rastreamento, foram identificados dois fragmentos gênicos induzidos pela glicose. Um destes apresentou homologia com uma proteína hipotética humana de função desconhecida e o segundo com o receptor de polipetídeo pancreático. Este trabalho permitiu a identificação de novos genes regulados pela glicose em ilhotas pancreáticas humanas, os quais podem estar relacionados à proliferação celular deste tecido. / Type 1 Diabetes mellitus (T1DM) is caused by autoimmune destruction of the insulin-producing pancreatic islet b-cells. Treatment is generally approached by daily subcutaneous injections of exogenous insulin. Nowadays, pancreatic islet transplantation is considered as an effective alternative treatment to insulin therapy. However, in order to reach insulin-independence, a large number of islets is required for each patient. Knowledge of the mechanisms regulating islet b-cell proliferation may allow ex-vivo b-cell expansion prior to transplant. Glucose is considered one of the main inducers of islet b-cells proliferation. We established and executed the technology of human islet isolation and purification. The islets were then stimulated in culture with glucose. In order to identify glucose-regulated genes in cultured human islets, we utilized the suppression subtractive hybridization (SSH) method, followed by cDNA library screening by DNA macroarrays. Preliminary screening allowed us to isolate two cDNAs displaying glucose regulation, one of which is similar to a human hypothetical protein of unknown function and the other shows similarity to the pancreatic polypeptide receptor. This work allowed identification of glucose-regulated genes in human pancreatic islets, which may be related to cell proliferation in this tissue.