En els darrers anys s´ha consolidat l´enfoc translacional en l´abordatge del càncer. Aquest es basa en la voluntat de comprendre la biologia tumoral i implementar clínicament aquest coneixement dissenyant nous fàrmacs capaços d´inhibir específicament molècules oncogèniques.En aquest context, s´han descobert els receptors tirosina-quinasa (RTK) com a proto-oncogens crucials en la diferenciació i proliferació cel·lular i com a molècules amb un gran paper en carcinogènesi. KIT i PDGFR són dos exemples paradigmàtics de RTK pels que s´han desenvolupat fàrmacs inhibidors, amb gran èxit terapèutic en aquells tumors, com el GIST, on aquestes proteïnes tenen un paper patogenètic crucial.L´enfoc translacional ha tingut un gran impacte en el camp dels tumors renals que representen un 3% dels tumors de l´economia i dels quals s´en reconeixen diferents subtipus. Els avenços en biologia molecular han permès definir la patogènia d´algunes entitats, sobretot del Carcinoma renal de cèl·lula clara (CRCC), un dels subtipus tumorals freqüents i més agressiu per l´alt nombre de pacients que desenvolupen malaltia metastàtica (30-50%) i pels quals s´estan buscant noves eines terapèutiques.Pel valor oncogènic i com a dianes terapèutiques del KIT i PGFR, aquest treball té com a objectiu estudiar l´expressió d´aquestes proteïnes per immunohistoquímica sobre teixit de tumors de cèl·lules renals. A més a més, en base a aquests resultats i la literatura es pretén discutir el seu valor com a dianes terapèutiques.En el nostre estudi es va demostrar expressió de KIT de forma específica en Carcinoma renal Cromòfob (ChRCC) i Oncocitoma (OR). També es va trobar sobreexpressió de KIT i PDGFRα en la diferenciació sarcomatoide de carcinomes renals (SRCC) sense que aquesta s´associès amb mutacions en els exons 9, 11, 13, 17 del KIT ni en els exons 11, 12, 17, 18 de PDGFRα; que són els més freqüent mutats en el GIST .Alhora vam observar expressió inespecífica en cèl·lules tumorals de PDGFRα i PDGFRβ en un baix nombre de casos i de forma dèbil en diferents subtipus de tumors renals. Per contra, vam evidenciar sobreexpressió de PDGFRβ vascular de forma característica en un alt percentatge de CRCC. En base als nostres resultats, proposem la utilitat de KIT com a marcador en el diagnòstic diferencial de diferents subtipus tumorals. Alhora, hem demostrat que l´expressió de KIT i PDGFRα en els SRCC no segueix el mateix model patogenètic que el GIST. La literatura sosté la necessitat de demostrar la implicació patogènica d´una proteïna en un tumor per plantejar l´efectivitat de la seva inhibició selectiva, essent l´expressió immunohistoquímica per si mateixa insuficient per sostindre aquest principi.Fins al moment, no es coneix si KIT i PDGFR tenen un paper oncogènic en el ChRCC, OR i en SRCC.Per tant, no hi ha suficients dades per proposar l´us d´inhibidors proteics contra aquestes proteïnes en ChRCC i SRCC disseminats.Per altra banda l´expressió vascular de PDGFRβ en CRCC si que té una base patogenètica ja que el seu lligand (PDGF) s´ha implicat directament en la seva biologia. Alhora aquesta expressió vascular és coherent amb els estudis que relacionen la isoforma beta del PDGFR amb la maduració dels pericits i en la promoció de l´angiogènesi.Per tant, els nostres resultats sostenen la relació del PDGFRβ en la patogènia del Carcinoma renal de cèl·lula clara i el valor terapèutic dels fàrmacs contra aquest receptor amb finalitat antiangiogènica.En conclusió, en el context de l´enfoc translacional del càncer i la necessitat d´implementació de nous fàrmacs inhibidors proteics pel tractament del carcinoma renal metastàtic, l´anàlisi d´expressió de RTK en tumors renals permet juntament amb la integració d´altres estudis, la discussió del valor diagnòstic i sobretot terapèutic d´aquestes dianes moleculars. / Renal Cell Neoplasms (RCN) represent 3% of cancer incidence and comprise different clinicopathologic entities. Malignant subtypes, specially the most frequent one Clear Cell Renal Cell Carcinoma (CRCC), remain the most lethal of urologic cancers due to the high rate of patients (30-50%) developing metastatic disease for whom new therapies are needed.Great advances in molecular biology have led to the identification of tyrosine-kinase receptors (TKR) as relevant proteins in tumorigenesis. Moreover the advent of selective inhibitors against them has raised interest on its expression in different tumors.PDGFR and KIT are two examples of TKR that have an oncogenic role in numerous neoplasms and can be inhibited pharmacologically. Because of its potential role as proto-oncogens and therapeutic targets; We aimed to study its immunohistochemical expression in RCN and to discuss its possible role as molecular targets.Our results highlight specific expression of KIT in Chromophobe renal cell carcinoma (ChRCC) and Renal Oncocytoma (RO). Overexpression of KIT and PDGFRα was found in sarcomatoid differentiation of renal tumours (SRCC) without mutations in KIT exons 9,11,13,17 nor PDGFR exons 11,12,17,18 which are the most commonly mutated in GIST.Moreover inespecific and low expression of PDGFRα and PDGFRβ was evidenced in tumoral cells in different RCN. In contrast, vascular expression of PDGFRβ was seen caracteristically in half of CRCC cases.According to our results, we propose KIT as a useful marker for differential diagnosis among RCN.Moreover we demonstrate that expression of KIT and PDGFR in SRCC doesn´t follow the same pathogenetic mecanism as GIST.Scientific community claims that immunohistochemical expression of a protein in a tumor is not enough to propose it as a therapeutic target and that demonstation of its pathogenetic role is needed. So as, there is still no evidence of participation of KIT-PDGFR in ChRCC, OR nor SRCC oncogenesis, there is not enough data to propose them as therapeutic targets.Conversely, in different studies PDGFRβ has been involved in CRCC pathogenesis and has been related to tumor angiogenesis by perycite recruitment. So that, vascular expression of PDGFRβ in CRCC favours its consideration as a therapeutic target in this tumor subtype.

En la majoria de processos cel·lulars, hi ha multitud de proteïnes que interaccionen entre sí, essent aquests contactes proteïna-proteïna, fonamentals per al correcte funcionament de cadascun d'aquests processos. Aquests contactes, es donen a través de les superfícies de les diferents proteïnes, de manera que aquestes superfícies són unes dianes terapèutiques potencialment molt interessants. Donada la importància del reconeixement de superfícies proteiques, aquest treball de tesis doctoral s'ha dirigit a l'estudi de la utilització de lligands peptídics per al reconeixement de superfícies proteiques riques en carboxilats. En concret, com a diana, s'ha escollit el domini de tetramerització de la proteïna supressora de tumors p53.Així, partint dels estudis previs realitzats en el grup de recerca basats en la interacció de molècules tetraguanidíniques no peptídiques amb petits pèptids model amb quatre residus àcids distribuïts en i / i+3 / i+6 / i+9, s'ha pogut dissenyar i sintetitzar un pèptid (Ac-AGAAGWARGRARSR-NH2), el qual és capaç de reconèixer la superfície rica en carboxilats de la p53. Per poder dur a terme aquests estudis, ha estat necessari establir la metodologia per obtenir mitjançant expressió en cultius bacterians, el domini de tetramerització de la p53 (amb i sense marca isotòpica). El pèptid s'ha dissenyat mitjançant eines de modelat molecular, i la interacció s'ha estudiat mitjançant la combinació de diferents tècniques com són l'espectroscòpia de fluorescència, la ressonància magnètica nuclear, la ressonància de plasmó superficial i la microcalorimetria. A partir d'aquest estudis s'ha pogut concloure que la constant d'afinitat és de l'ordre de 10 milimicres. A més a més, s'ha pogut comprovar que el pèptid Candidat 4, és capaç de creuar la membrana cel·lular, fet que obre les portes a poder avaluar aquesta interacció in vivo.A partir del pèptid Candidat 4, s'ha dissenyat una quimioteca de 40 pèptids amb l'objectiu d'optimitzar l'afinitat i entendre quins són els factors que controlen aquest procés de reconeixement. La quimioteca corresponent s'ha sintetizat, purificat i avaluat la seva interacció amb el domini de tetramerització de la p53 mitjançant espectroscòpia de fluorescència. A partir d'aquests estudis, s'ha comprovat que s'han pogut preparar quatre pèptids amb una afinitat fins a un ordre de magnitud superior i s'han pogut extreure idees de caràcter més general que poden ser útils per al disseny de lligands per a altres superfícies proteiques. Finalment, també s'han obtingut anticossos dirigits a dues regions diferents del domini de tetramerització de la p53.

Protein-protein interactions are essential in biological processes and thus, they have become very promising therapeutic targets. Nevertheless, the artificial modulation of protein complexes remains a challenge. Since most work to date has been focused on the inhibition of protein-protein interactions, there is little precedent on the design of molecules which can induce, stabilize or recover the oligomerization state of proteins. In this context, the system comprised of the tetramerization domain of protein p53 (p53TD) and its oncogenic mutants with defective oligomerization properties is an outstanding case of study for the design and evaluation of molecules which can recover the tetrameric structure. Through a collaboration with Prof. Javier de Mendoza, a family of para-guanidinomethyl-calix[4]arenes able to interact simultaneously with the four monomers of the p53 tetramerization domain was rationally designed; hence, the interaction with these compounds would stabilize the whole tetrameric assembly. In order to evaluate experimentally said calix[4]arenes, three natural oncogenic mutants of the p53TD with defective assembly abilities were biosynthesized. Namely, they are: G334V, R337H and L344P. Once synthesized and purified the calix[4]arenes compounds, their molecular recognition properties were tested through a battery of biophysical techniques, including nuclear magnetic resonances (on both the protein and the ligand), circular dichroism, differential scanning calorimetry, crystallography, mass spectrometry and chemical cross-linking. The results clearly show that these calix[4]arenes interact with the proteins as intended and, the most important, they can thermally and kinetically stabilize the tetrameric state. These results are the perfect evidence of the proof-of-concept initially sought: a little synthetic ligand can stabilize the oligomeric state of proteins which are structurally defective. In addition, the study of several ligands with different functionalizations provides further understanding about the basis of molecular recognition events. On the one hand, the guanidinium group has a vital role for high affinity interactions. On the other hand, structural flexibility, in both the protein and the ligand, enables the molecules to adopt the optimal conformation for the tightest interaction, thereby underscoring the ambiguous and unpredictable role of the entropy in interaction processes. / Las interacciones proteína-proteína son esenciales en muchos procesos biológicos y por ello resultan dianas terapéuticas muy prometedoras. Sin embargo, modular artificialmente complejos proteicos resulta todavía un gran reto. Hasta la fecha, los esfuerzos se han dirigido básicamente hacia la inhibición de interacciones proteína-proteína; pocos precedentes describen el diseño de moléculas que puedan inducir, estabilizar o recuperar el estado oligomérico de proteínas. En relación a lo último, el sistema formado por el dominio de tetramerización de la proteína p53 (p53TD) y sus mutantes oncogénicos con oligomerización defectuosa representa un excelente modelo para el diseño y la evaluación de moléculas que puedan recuperar el estado tetramérico nativo.En colaboración con el Prof. Javier de Mendoza, se diseñaron racionalmente compuestos para-guanidinometil-calix[4]arenos capaces de interaccionar con simultáneamente con las cuatros unidades que estructuran el dominio de tetramerización de p53, de tal modo que podrían estabilizar el estado oligomérico de la proteína. Para la evaluación experimental de dichos ligandos calix[4]arenos, se biosintetizaron tres mutantes naturales de p53TD con tetramerización defectuosa: G334V, encontrado en cánceres de pulmón; R337H, asociado al carcinoma adrenocortical infantil; y L344P, asociado al síndrome Li-Fraumeni.Tras la síntesis y purificación de los compuestos guanidinometil-calix[4]arenos, sus capacidades de interacción con las proteínas se estudiaron por técnicas biofísicas, que incluyen resonancia magnética nuclear (sobre la proteína y sobre el ligando), dicroismo circular, calorimetría diferencial de barrido, calorimetría isotérmica de titulación, cristalografía, espectrometría de masas y entrecruzamiento químico. Los resultados muestran claramente que los calix[4]arenos pueden interaccionar con las proteínas tal y como se habían diseñado; en consecuencia, estos ligandos son capaces de estabilizar térmica y cinéticamente las proteínas mutantes, recuperando así su estado tetramérico.Estos resultados son la perfecta prueba del concepto inicialmente planteado: un pequeño ligando sintético diseñado puede estabilizar el estado oligomérico de proteínas estructuralmente defectuosas. El estudio de varios ligandos con diferentes grupos funcionales también pone de manifiesto otros fenómenos de particular relevancia en el campo del reconocimiento de superficies proteicas. Por una parte, el grupo guanidinio tiene un papel clave para la afinidad de la interacción. Por otra parte, la flexibilidad estructural de ambos componentes: la proteína y el ligando, permite que se establezcan interacciones más estrechas y fuertes, lo que refleja el papel tan ambiguo e impredecible de la entropía en procesos de interacción.