Le métabolisme cellulaire est la source principale d’énergie et les cellules cancéreuses ont un métabolisme différent des cellules non transformées. La cellule tumorale a tendance à éviter l’activité mitochondriale et ainsi la phosphorylation oxydative, pour lui préférer la voie de la glycolyse pour la production d’énergie (Effet Warburg). Cette altération du métabolisme est si bénéfique pour les cellules en croissance que cela favorise la croissance tumorale et supprime la réponse immunitaire anticancéreuse. La spécificité de ce métabolisme en fait une cible intéressante pour le développement de thérapies anticancéreuses. Mon travail de thèse comporte deux parties. La première partie décrit que lorsque les cellules cancéreuses sont forcées à utiliser la voie mitochondriale comme source d’énergie à travers l’oxydation phosphorylative, elles initient un mécanisme antioxydant pour tolérer les effets délétères des espèces oxygénées réactives (EOR ou ROS pour reactive oxygene species) produites au cours de l’activité mitochondriale. La stimulation mitochondriale entraîne l’activation de la voie de signalisation ERK5-MEF2, et cette dernière engendre un mécanisme antioxydant de deux façons.Initialement, nous avons observé que MEF2 régule positivement l’expression de miR23a, et ce dernier inhibe l’expression de KEAP1. Cette protéine est responsable de la dégradation ubiquitine dépendante de NRF2, un régulateur clé de la réponse antioxydante cellulaire. L’inhibition de KEAP1 empêche la dégradation cytoplasmique de NRF2. Consécutivement à cela la concentration cytoplasmique en NRF2 augmente ce qui engendre sa translocation dans le noyau où il se lie à une séquence élément de réponse antioxydant (ARE) dans la région promotrice de nombreux gènes antioxydants, initiant ainsi leur transcription. Plus tard nous avons observé que l’activation de la voie ERK5-MEF2 induisait directement la synthèse de novo de NRF2, induisant sa translocation nucléaire et un mécanisme antioxydant. L’inhibition de la voie ERK5-MEF2 altère la réponse antioxydante, sensibilisant ainsi les cellules au stress oxydant.La seconde partie de mon travail a exploré les mécanismes à l’origine des effets hypolipémiants du dichloroacétate (DCA). Le DCA est une petite molécule qui inhibe la PDK1 et permet au pyruvate d’entrer dans la mitochondrie. Il a été utilisé en clinique dans le passé pour baisser les taux plasmatiques de cholestérol mais le mécanisme n’était pas clair et nous l’avons décris. Le DCA force les cellules à entrer en oxydation phosphorylative ce qui active la voie ERK5-MEF2. Cette voie augmente directement l’expression du LDLR (Low Density Lipoprotein Receptor ; récepteur aux lipoprotéines de basse densité) qui permet l’endocytose des LDL riches en cholestérol qui sont responsables de la plupart des maladies cardiovasculaires. L’inhibition de cette voie supprime l’afflux de lipides et par conséquent serait une cible intéressante pour de futures recherches puisque de hauts taux de cholestérols sont directement corrélés avec une augmentation du risque d’athérosclérose et de toutes les complications mortelles qu’il entraine.Notre prochain objectif est d’explorer les autres mécanismes cellulaires régulés par la voie ERK5-MEF2. Sur la base de nos résultats préliminaires, nous proposons que cette voie non seulement régule l’expression du LDLR mais aussi celle de nombreux autres gènes qui sont impliqués directement ou indirectement dans le métabolisme des lipides. / Cellular metabolism is the main source of energy and cancer cells has different metabolism than non-transformed cells. Tumor cell tends to avoid mitochondrial activity and oxidative phosphorylation (OXPHOS) and prefer glycolysis for energy production (Warburg effect). This alteration in metabolism is beneficial for growing cells in many ways that promote tumor growth and suppress the anti-cancer immune response. This specific metabolism is an auspicious target for the better development of cancers chemotherapies.My thesis work comprises two parts. The first portion describes that when cancer cells are forced to utilize their mitochondria in order to obtain the energy from OXPHOS they initiate an antioxidant mechanism to cope with the deleterious effects of reactive oxygen species (ROS) produced during mitochondrial activity. Mitochondrial stimulation leads to activation of ERK5-MEF2 signaling pathway, which triggers the antioxidant mechanism by at least two ways.Initially we observed that MEF2 up regulates the expression of miR23a, which inhibits KEAP1 expression. This protein is responsible for ubiquitinational degradation of NRF2, a master regulator of the antioxidant response in cells. The inhibition of KEAP1 prevents the NRF2 cytoplasmic degradation. This results in high built up of NRF2 in cytoplasm that translocates to nucleus where it binds to ARE (antioxidant response element) in the upstream promoter region of many antioxidant genes hence initiates their transcription. Latter we observed that activation of ERK5-MEF2 pathway directly results in de novo synthesis of NRF2, resulting in nuclear translocation and triggering of the antioxidative mechanism. Inhibition of ERK5-MEF2 pathway impairs the cellular antioxidant response, thus sensitizing cells towards oxidative stress.The second part of my work explored the mechanism behind the lipid lowering effects of dichloroacetate (DCA). DCA is a small molecule, which inhibits the PDK1 and enables pyruvate to enter the mitochondria. It was used clinically in past to lower the plasma cholesterol level but the underlying mechanism was not clear and we describe it here. DCA forces cells to perform OXPHOS, which activate the ERK5-MEF2 pathway. This pathway directly up-regulates the expression of Low Density Lipoprotein Receptors (LDLR) that are mainly involved in the endocytosis of cholesterol-rich low density lipoproteins, which are responsible for the majority of cardiovascular diseases. Inhibition of this pathway suppresses lipid influx and hence, it would be an interesting target of future investigation since high cholesterol level is the main cause of various life threatening diseases and the development of atherosclerosis.Our next goal is to exploit other possible cellular mechanism regulated by ERK5-MEF2 pathway. Based on our preliminary data, we propose that this pathway not only regulate the LDLR expression but many other genes, which are directly or indirectly involved in lipid metabolism.

It is well established that a cardiomyopathy independent of atherosclerosis develops in both humans and animals with diabetes mellitus. The etiology of diabetic cardiomyopathy is very complex involving many different processes, one of which may be the increased fatty acid utilization, and/or the concomitant decrease in glucose utilization, by the diabetic heart. We compared control and 6-week streptozotocin(STZ)-induced diabetic isolated working rat hearts and were able to demonstrate cardiac dysfunction in the diabetic as assessed by depressed heart rate (HR), heart rate peak systolic pressure product (HR X PSP), left ventricular developed pressure (LVDP), rate of pressure rise (+dP/dt) and rate of pressure decline (-dP/dt). Paralleling depressed cardiac function in the diabetic were hyperglycemia, hyperlipidemia and decreased body weight gain as compared to age-matched controls. The addition of free fatty acids, in the form of 1.2 mM palmitate, to the isolated working heart perfusate had no effect on either control or diabetic heart function, with the exception of a depressive effect on +dP/dt of diabetic hearts and -dP/dt of control hearts. But, diabetic hearts perfused with palmitate-containing perfusate plus the glucose oxidation stimulator dichloroacetate (DCA) showed a marked improvement in function. Heart rate, HR X PSP, LVDP and +/-dP/dt were all restored to control heart values in diabetic hearts perfused in the presence of DCA. Creatine phosphate and adenosine 5'-triphosphate (ATP) levels were similar under all perfusion conditions, therefore eliminating energy stores as the limiting factor in heart function. Results indicate that DCA-induced stimulation of glucose oxidation acutely reversed diabetic cardiac function depression. Therefore, depression of glucose oxidation in the diabetic heart may be contributing to diabetic cardiomyopathy. / Pharmaceutical Sciences, Faculty of / Graduate

Whilst progress has been made in reducing mortality in some cancers, mortality rates remain high in many cancers and there is a need to develop novel therapeutic strategies. In this thesis, various pharmacological strategies designed to enhance the activity of existing therapeutic drugs were evaluated. Cancer cells are dependent upon aerobic glycolysis (the Warburg effect) and glutamine uptake. Using clinically approved tyrosine kinase inhibitors and Bortezomib, significant enhancement of chemosensitivity was observed when used in combination with inhibitors of lactate dehydrogenase (Gossypol) and pyruvate kinase dehydrogenase (Dichloroacetate). In contrast, depletion of glutamine from media had to be extensive in order to induce cell death and cell death only occurred after prolonged exposure to glutamine-deprived conditions. This suggests that glutamine depletion strategies alone are unlikely to be successful but may be useful in combination with other agents targeting glutamine addiction in cancer cells. Finally, Temozolomide (TMZ) is an important drug in the treatment of glioblastomas but its activity is reduced by resistance mechanisms including O6 methyl guanine methyltransferase (MGMT) and mismatch repair (MMR). This thesis has identified analogues of TMZ (EA02-45, EA02-59, EA02-64 and EA02-65) that are MGMT and MMR independent in terms of inducing cell kill in vitro. These compounds are promising leads for future development. In conclusion, this thesis has demonstrated that interfering with the metabolic phenotype of cancer can enhance the activity of existing drugs and identified novel analogues of TMZ that circumvent drug resistance mechanisms that hamper the efficacy of TMZ.

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La formation et le développement d'une tumeur sont provoqués par une série de défauts qui se produisent à l'intérieur de la cellule cancéreuse et dans son microenvironnement. Ces anomalies permettent à la cellule de développer ses propres stratégies de croissance, de prolifération, de différenciation et de métabolisme. Toutes ces adaptations, ainsi que la création d'un micro-environnement unique favorisent la croissance de la tumeur et inhibent la réponse immunitaire anti-tumorale. Le métabolisme des cellules cancéreuses et l'évasion immunitaire sont des points très sensibles dans le développement des cancers et peuvent être utilisés en clinique. Les études récentes suggèrent que ces deux phénomènes sont liés, et que le métabolisme des cellules cancéreuses peut amener à l'échappement immunitaire par la tumeur. Le métabolisme des cellules tumorales a tendance à éviter l'activité mitochondriale et la phosphorylation oxydative, et est principalement basée sur la glycolyse pour la production d'énergie (effet Warburg). Mon travail de thèse est divisé en deux parties. Dans la première partie nous avons proposé un concept thérapeutique novateur avec une nouvelle thérapie combinatoire pour le traitement de cancers hématologiques. Cette thérapie est basée sur l'induction de changements métaboliques par le dichloroacétate (DCA), et elle est associée avec la chimiothérapie conventionnelle (doxorubicine, vincristine) pour réactiver les fonctions de p53. Les tumeurs avec p53 mutantes sont résistantes à cette combinaison. Dans ce cas, nous avons constaté que le DCA peut coopère avec 17-AAG (l'inhibiteur de Hsp90) pour éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses. En conséquence, une meilleure compréhension des signaux et des mécanismes par lesquels le DCA sensibilise les cellules tumorales à la chimiothérapie est nécessaire pour en comprendre le mode d'action. En outre, l'identification de ce mécanisme permettra d'élucider les voies métaboliques impliquées dans la survie des cellules cancéreuses. La deuxième partie de ma thèse se concentre sur la biologie des cellules NK. Les cellules NK sont des lymphocytes du système immunitaire inné et possèdent une cytotoxicité naturelle contre les cibles, c'est à dire les cellules tumorales. L'utilisation optimale des cellules NK en clinique nécessite leur expansion et leur activation in vitro. Les cellules NK s'activent en présence de cytokines ou par le contact avec les cellules cibles. L'activation des cellules NK induit la prolifération, mais celle-ci dépend aussi de la présence d'autres cellules immunitaires. L'activation, par les cytokines et par les cellules cibles, induit un différent ARNm/microARN profil d'expression. L'analyse détaillée des isoformes de la protéine tyrosine phosphatase CD45 a permis de caractériser de nouvelles populations de cellules NK anti-tumorales humaines. L'identification de différentes populations de cellules NK est très importante pour la compréhension de leur physiologie et pour l'amélioration de leur utilisation en immunothérapie clinique. Cela peut également donner des informations précieuses sur l'état physiologique de l'hôte. En effet, l'augmentation des cellules CD45RAdim et CD45RO + dans le compartiment des cellules NK matures identifie clairement les patients avec des hémopathies malignes. Nous pensons que leur détection peut être utilisée comme un outil de diagnostic et également pour évaluer l'efficacité des traitements anti-tumoraux, car ces populations de cellules NK spécifiques devraient diminuer lors de l'élimination de cellules tumorales cibles. Dans l'avenir, nous voulons combiner le traitement du métabolisme de la tumeur avec la thérapie anti-tumorale basée sur les cellules NK. Sur la base de nos données préliminaires, nous pouvons proposer le traitement des cellules cancéreuses par des médicaments métaboliques pour augmenter la sensibilité et la reconnaissance par les cellules NK activées. / Tumor formation and development are caused by a range of defects that occur inside the cancer cell and in the external cellular microenvironment. These abnormalities allow developing tumors to establish their own strategies of growth, proliferation, differentiation and metabolism. All these adaptations, as well as the creation of a unique microenvironment, promote tumor growth and suppress the anti-cancer immune response. Tumor cell metabolism and immune evasion are sensitive points of cancer development that can be targeted in clinic. Recent studies suggest that these two phenomena are related and that cancer cell metabolism may propel tumor immune escape. Tumor cell metabolism tends to avoid mitochondrial activity and oxidative phosphorylation (OXPHOS), and largely relies on glycolysis to produce energy (Warburg effect). My thesis work is divided into two parts. The first one proposes an innovative therapeutic strategy, which is the use of different combinatorial therapy depending on the p53 status for the treatment of hematological cancers. This is based on the induction of metabolic changes by dichloroacetate (DCA), combined with conventional chemotherapy (doxorubicin, vincristine) to reactivate wild type p53 functions. Mutant p53 tumors are resistant to this combination approach. However, we found that DCA synergized with the Hsp90 inhibitor 17-AAG to specifically eliminate these cells. Therefore, a clearer understanding of the signals and mechanisms by which DCA sensitize cancer cells to chemotherapy was needed to understand its mode of action. We uncovered it in our work. In addition, identification of this mechanism will help to elucidate metabolic pathways involved in cancer cell survival.The second part of my thesis is focused on the study of NK cell biology. NK cell is an innate immune system lymphocyte lineage with natural cytotoxicity against targets, i.e. tumor cells. Its optimal use in the clinic requires in vitro expansion and activation. Cytokines and the encounter with target cells activate NK cells, induce their proliferation, and cause clearly different mRNA/miRNA expression profile. Detailed analysis of the leucocyte-specific phosphatase CD45 isoforms allowed us to characterize new human anti-tumor NK cell populations. The identification of the different NK cell populations is important for understanding their physiology and for improving their therapeutic use in the clinic. It can also give valuable information about the host physiological status. Indeed, the increase of CD45RAdim and CD45RO+ cells in the mature NK cell compartment clearly identifies patients with hematological malignancies. We thus hypothesize that their detection could be used as a diagnostic tool, and also to assess the efficacy of antitumor treatments, because these specific NK cell populations should decrease upon removal of the targeted tumor cells. Our future goal is to use a novel combinatorial therapy in hematological cancers that will combine metabolic drugs and NK cell-based therapy. Based on our preliminary data, we propose that the treatment of cancer cells with metabolic drugs could increase their sensitivity and recognition by activated NK cells.