Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Herstellung und Charakterisierung einzelner Edelmetallnanopartikel-Cluster für die oberflächenverstärkte Raman-Streuung (engl. surface-enhanced Raman scattering; SERS). In Clustern treten stark lokalisierte Regionen mit sehr hohen Feldverstärkungen auf (engl. hot spots), die den SERS-Effekt extrem verstärken. In der Regel werden Metallnanopartikel in kolloidaler Suspension untersucht, so dass nur Aussagen über das gesamte Kolloid und nicht über einzelne Cluster getroffen werden können. Für die Identifizierung von Struktur-Eigenschafts-Korrelationen wurden in dieser Arbeit daher einzelne Cluster optisch und elektronenmikroskopisch charakterisiert. Der erste Teil der vorliegenden Arbeit beschreibt neue Ansätze zur Trennung von glasverkapselten SERS-Nanopartikel-Clustern mit Hilfe der Dichtegradientenzentrifugation sowie die Etablierung einer modifizierten Synthesevorschrift zur Herstellung von monodispersen Silbernanopartikeln. Der zweite Teil beschäftigt sich mit der optischen Charakterisierung einzelner SERS-Cluster und den dafür notwendigen experimentellen Umbauten eines bestehenden Versuchsaufbaus. Anschließend wird die oberflächenverstärkte Raman-Streuung von SERS-Clustern in Abhängigkeit der Polarisation gemessen und die lokalisierte Oberflächenplasmonenresonanz (engl. localized surface plasmon resonance; LSPR) von Nano- und Mikrostrukturen bestimmt.

Hedgehog (Hh) proteins control animal development and tissue homeostasis. They activate gene expression by regulating processing, stability, and activation of Gli/Cubitus interruptus (Ci) transcription factors. Hh proteins are secreted and spread through tissue, despite becoming covalently linked to sterol during processing. Multiple mechanisms have been proposed to release Hh proteins in distinct forms; in Drosophila, lipoproteins facilitate long-range Hh mobilization but also contain lipids that repress the pathway. Here, we show that mammalian lipoproteins have conserved roles in Sonic Hedgehog (Shh) release and pathway repression. We demonstrate that lipoprotein-associated forms of Hh and Shh specifically block lipoprotein-mediated pathway inhibition. We also identify a second conserved release form that is not sterol-modified and can be released independently of lipoproteins (Hh-N*/Shh-N*). Lipoprotein-associated Hh/Shh and Hh-N*/Shh-N* have complementary and synergistic functions. In Drosophila wing imaginal discs, lipoprotein-associated Hh increases the amount of full-length Ci, but is insufficient for target gene activation. However, small amounts of non-sterol-modified Hh synergize with lipoprotein-associated Hh to fully activate the pathway and allow target gene expression. The existence of Hh secretion forms with distinct signaling activities suggests a novel mechanism for generating a diversity of Hh responses.

Hedgehog (Hh) proteins control animal development and tissue homeostasis. They activate gene expression by regulating processing, stability, and activation of Gli/Cubitus interruptus (Ci) transcription factors. Hh proteins are secreted and spread through tissue, despite becoming covalently linked to sterol during processing. Multiple mechanisms have been proposed to release Hh proteins in distinct forms; in Drosophila, lipoproteins facilitate long-range Hh mobilization but also contain lipids that repress the pathway. Here, we show that mammalian lipoproteins have conserved roles in Sonic Hedgehog (Shh) release and pathway repression. We demonstrate that lipoprotein-associated forms of Hh and Shh specifically block lipoprotein-mediated pathway inhibition. We also identify a second conserved release form that is not sterol-modified and can be released independently of lipoproteins (Hh-N*/Shh-N*). Lipoprotein-associated Hh/Shh and Hh-N*/Shh-N* have complementary and synergistic functions. In Drosophila wing imaginal discs, lipoprotein-associated Hh increases the amount of full-length Ci, but is insufficient for target gene activation. However, small amounts of non-sterol-modified Hh synergize with lipoprotein-associated Hh to fully activate the pathway and allow target gene expression. The existence of Hh secretion forms with distinct signaling activities suggests a novel mechanism for generating a diversity of Hh responses.

Mitochondriopathien sind Multisystemerkrankungen die durch verschiedene Defekte in den Energie (ATP) produzierenden Stoffwechselwegen der Mitochondrien verursacht sind. Will man Mitochondriopathien auf molekularer Ebene diagnostizieren, stößt man auf folgende Schwierigkeiten: (A) Ungefähr 1000 Gene sind an der Biogenese des Mitochondriums beteiligt. Die Dysfunktion jedes einzelnen dieser Gene kann potentiell zur Mitochondriopathie führen. (B) Mitochondriale Proteine werden durch zwei Genome, durch die mitochondriale und durch die nukleäre DNA kodiert. (C) Die klinischen Symptome der Patienten weisen selten auf die molekulare Diagnose, da der Phänotyp oft nur auf einem sekundären Energiemangel beruht. In der Regel besteht keine sichere Genotyp-Phänotyp-Relation. Mit den gegenwärtig zur Verfügung stehenden Methoden lassen sich bei nur 20% der Patienten Mutationen finden. Wir wollten daher eine neue Screening-Methode entwickeln, mit deren Hilfe wir hoffen, die Aufspürungsrate für mitochondriale Mutationen zu erhöhen. Die Gesamtheit der Proteine einer Organelle oder einer ganzen Zelle (ihr "Proteom") stellt das Verbindungsglied zwischen Geno- und Phänotyp dar. Aus diesem Grunde wollten wir das mitochondriale Proteom von gesunden Kontrollpersonen und von Patienten mit Mitochondriopathien untersuchen. Protein-Muster, die zwischen diesen beiden Gruppen abweichen, könnten die Aufmerksamkeit auf Gene und Proteine richten, die an der Entstehung des Krankheits-Phänotyps beteiligt sind. Um solch eine vergleichende Studie durchzuführen, muß zunächst eine Referenzkarte des normalen mitochondrialen Proteoms erstellt werden. In meinem Dissertationsprojekt habe ich diese grundlegende Arbeit durchgeführt und zahlreiche Proteine auf der Proteomkarte menschlicher Mitochondrien identifiziert, die aus Epstein-Barr-Virus-transformierten lymphoblastoiden Zellen gewonnen worden waren. Ich wählte diese Zellsorte als Untersuchungsmaterial, da sie nicht nur einfach von Patienten gewonnen werden, sondern auch potentiell permanent wachsen kann. Dies erlaubt die Züchtung einer hohen Zellzahl ohne übermäßigen Aufwand. Ich optimierte ein Protokoll zur Zentrifugation in einem hybriden Gradienten, mit dem genug gereinigte Mitochondrien aus 108 Zellen gewonnen werden konnten. Für die Referenzkarte benutzte ich die lymphoblastoide Zellline einer gesunden Kontrollperson. Die Methode der Wahl zur Proteinidentifikation in Proteom-Projekten ist die zweidimensionale Proteinelektrophorese gekoppelt mit der MALDI-TOF-Massenspektrometrie. Ich entdeckte mehr als 400 Punkte in meinem silbergefärbten zweidimensionalen Gel und analysierte die 141 stärksten Punkte nach in-gel Trypsin-Verdau und anschließender MALDI-TOF-Massenspektrometrie in einem Verfahren, das als "Peptide Mass Fingerprinting" (Peptidmassen-Fingerabdruck) bezeichnet wird. Mit Hilfe entsprechender Datenbanken konnte ich schließlich 115 verschiedene Proteinpunkte (entsprechen 95 verschiedenen Proteinen) identifizieren. 90 dieser Punkte (entsprechend 74 verschiedenen Proteinen) waren sicher mitochondrialer Herkunft und sind Komponenten aller wesentlichen im Mitochondrium lokalisierten Stoffwechselwege. 16 der 74 identifizierten mitochondrialen Proteine gehören zur Atmungskette. Obwohl 18 mitochondriale Proteine in der Datenbank SWISS-PROT als "Membran-assoziiert" annotiert sind, identifizierte ich nur vier Proteine mit sicheren Transmembrandomänen. Ich entdeckte keine der 13 durch die mitochondriale DNA kodierten Proteine, die alle stark hydrophobe Membranproteine sind. Andere Forscher sind bei dem Versuch diese Proteine zu identifizieren, auf die gleichen Schwierigkeiten gestoßen. Mit meiner Dissertationsarbeit habe ich unsere eigene Datenbank und Referenzkarte des mitochondrialen Proteoms lyphoblastoider Zellen erstellt. Diese Daten ermöglichen nun die Analyse des mitochondrialen Proteoms von Patienten. Meine weiteren Untersuchungen auf diesem Gebiet werden sich nun auf die genetische Variabilität des Proteoms gesunder Kontrollpersonen und auf das Proteom der Patienten mit Mitochondriopathien beziehen. / Mitochondrial disorders are multisystem diseases that can be caused by any defect in the energy (ATP) generating pathways in the mitochondria. The difficulty in diagnosing mitochondrial diseases on the molecular level arises from several obstacles: (A) About 1000 genes are involved in the biogenesis of mitochondria. The dysfunction of each of them may potentially cause mitochondriopathy. (B) The mitochondrial proteins are encoded by two genomes: the mitochondrial DNA and the nuclear DNA. (C) The clinical symptoms of the patients rarely suggest a molecular diagnosis since in most cases, the phenotype is a secondary phenomenon to energy depletion. Generally there is no genotype-phenotype relation. Based on current diagnostic methods in only 20% of the patients a mutation can be found. We therefore wanted to develop a new screening method by which we hope to increase the identification rate. Since the numerous proteins of an organelle or of a whole cell (its "proteome") connect the genotype with the phenotype, we set out to study the proteome of the mitochondrion in healthy individuals and in patients with mitochondrial diseases. Deviating protein patterns between the two individuals could direct the attention to disease-specific proteins and genes, which might be involved in the expression of a disease-phenotype. In order to perform such a comparison I first had to establish a normal reference map. In my dissertation project I performed this basic task and identified numerous mitochondrial proteins on the proteome-map of human mitochondria, which had been extracted from lymphoblastoid cells. I selected Epstein-Barr-Virus-transformed lymphoblastoid cells as samples not only because they are easily obtained from patients, but also due to their potential permanent growth. This approach allows the cultivation of high cell numbers without excessive expenditure of work and cost. I optimized a protocol for hybrid gradient centrifugation, by which enough mitochondria can be purified from 108 cells. I used a cultured lymphoblastoid cell line from a normal control patient and isolated mitochondria from it by using hybrid gradient centrifugation. In proteomics the combination of the high-resolution two-dimensional electrophoresis and matrix assisted laser desorption/ionization-time-of-flight-mass spectrometry (MALDI-TOF-MS) is currently the method of choice for protein identification. I detected more than 400 spots in a silver-stained two-dimensional gel. I analyzed the 141 strongest spots of it by trypsin in gel digestion and subsequent MALDI-TOF mass spectrometry in a process termed "peptide mass fingerprinting". After database search, I finally identified 115 protein spots (corresponding to 95 different proteins), 90 of which (corresponding to 74 different proteins) are of confirmed mitochondrial origin. These identified proteins are components of the main biological pathways located in the mitochondrion. 16 of the 74 identified mitochondrial proteins belong to the respiratory chain. Despite the fact that 18 mitochondrial proteins are annotated in the SWISS-PROT-database as "membrane associated proteins", only four of them have clear transmembrane domains. None of the proteins encoded by the mitochondrial DNA could be detected. All of them are hydrophobic membrane proteins. A similar difficulty in resolving these proteins was encountered by other research groups. With my dissertation I established our own database and reference map of the mitochondrial proteome of lymphoblastoid cells. These data will facilitate the analysis of the mitochondrial proteome in patients. My future research based on this dissertation will mainly focus on the genetic variation of the proteome of healthy individuals and on patients with mitochondrial diseases.

Als Kapazitation bezeichnet man den im weiblichen Reproduktionstrakt stattfindenden Reifungsschritt, der Spermien das volle Fertilisierungspotential verleiht. Die molekularbiologischen Grundlagen dieses für eine erfolgreiche natürliche oder auch artifizielle Befruchtung essenziellen Prozesses sind bis heute nur unvollständig verstanden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die mit der Kapazitation einhergehenden funktionellen und strukturellen spermalen Veränderungen untersucht. Die kapazitative Stimulation führte zu einer gesteigerten Motilität bis hin zur Hyperaktivierung, zu einer vermehrt induzierten Akrosomenreaktion und zu einer deutlich reduzierten Apoptoseaktivität. Anhand von Inhibitionsexperimenten wurde die Rolle der potentiellen Signaltransduktoren Caspase-1, Calpain und Calmodulin analysiert. Dabei wies die Calmodulinantagonisierung auf eine ausgeprägte Calciumabhängigkeit aller untersuchten kapazitationsassoziierten Prozesse hin. Die Hemmung von Caspase-1 und Calpain führte zu einer Beeinträchtigung der Motilität und der Akrosomenreaktion ohne das Ausmaß der Apoptoseinduktion zu beeinflussen. Die vorstehend genannten Erkenntnisse wurden zur Evaluation verschiedener Ejakulataufbereitungsprotokolle genutzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Kombination des modernen Verfahrens der immunomagnetische Zellseparation mit der etablierten Methode der Dichtegradientenzentrifugation dem einfachen Standard in Bezug auf die Anreicherung hochmotiler Spermien mit minimaler Apoptoseaktivität aus frischen wie auch aus kryokonservierten Ejakulaten deutlich überlegen war. Bedeutsam im Hinblick auf eine mögliche pratische Anwendung der immunomagnetischen Zellseparation erscheint der Befund, dass die durch das kombinierte Anreicherungsverfahren erhaltene Spermatozoensubpopulation im Hamsteroozytenpenetrationstest ein signifikant höheres Fertilisierungspotential zeigte.

Als Kapazitation bezeichnet man den im weiblichen Reproduktionstrakt stattfindenden Reifungsschritt, der Spermien das volle Fertilisierungspotential verleiht. Die molekularbiologischen Grundlagen dieses für eine erfolgreiche natürliche oder auch artifizielle Befruchtung essenziellen Prozesses sind bis heute nur unvollständig verstanden. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation wurden die mit der Kapazitation einhergehenden funktionellen und strukturellen spermalen Veränderungen untersucht. Die kapazitative Stimulation führte zu einer gesteigerten Motilität bis hin zur Hyperaktivierung, zu einer vermehrt induzierten Akrosomenreaktion und zu einer deutlich reduzierten Apoptoseaktivität. Anhand von Inhibitionsexperimenten wurde die Rolle der potentiellen Signaltransduktoren Caspase-1, Calpain und Calmodulin analysiert. Dabei wies die Calmodulinantagonisierung auf eine ausgeprägte Calciumabhängigkeit aller untersuchten kapazitationsassoziierten Prozesse hin. Die Hemmung von Caspase-1 und Calpain führte zu einer Beeinträchtigung der Motilität und der Akrosomenreaktion ohne das Ausmaß der Apoptoseinduktion zu beeinflussen. Die vorstehend genannten Erkenntnisse wurden zur Evaluation verschiedener Ejakulataufbereitungsprotokolle genutzt. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Kombination des modernen Verfahrens der immunomagnetische Zellseparation mit der etablierten Methode der Dichtegradientenzentrifugation dem einfachen Standard in Bezug auf die Anreicherung hochmotiler Spermien mit minimaler Apoptoseaktivität aus frischen wie auch aus kryokonservierten Ejakulaten deutlich überlegen war. Bedeutsam im Hinblick auf eine mögliche pratische Anwendung der immunomagnetischen Zellseparation erscheint der Befund, dass die durch das kombinierte Anreicherungsverfahren erhaltene Spermatozoensubpopulation im Hamsteroozytenpenetrationstest ein signifikant höheres Fertilisierungspotential zeigte.