The first chapter of this thesis describes the study of intestinal stem cells (ISCs) and their relationship to colon cancer. We describe the transcriptional landscape of intestinal epithelial populations through the use of the surface marker EphB2 which allowed us to build an ISC-specific gene signature. Elevated levels of this signature characterize CRC patients with high risk of disease relapse after therapy. Furthermore, our studies led us to discover that colon cancers are organized according to a hierarchical structure similar to that present in the normal colonic epithelium. EphB2- high cells retain an ISC-like phenotype and behave as cancer stem cells (CSCs). The second chapter of this thesis focuses on the description of the function of Mex3a, a novel ISC-specific gene. We generated genetic mouse models to disrupt Mex3a function in vivo. We show that this RNA binding protein is required for embryonic development, but dispensable in adult intestines. By generating a Mex3a reporter mouse we have been able to identify intestinal cells that resemble label-retaining cells. This mouse strain has also allowed us to purify stem/progenitor cells from other tissues. We demonstrate that Mex3a is a translational activator that interacts with the protein HuR. Our data suggest that Mex3a may be involved in the response of stem cells to stress. / El primer capítulo de esta tesis describe el estudio de células madre intestinales (CMIs) y su relación con el cáncer de colon. Describimos los perfiles de expresión génica de las distintas poblaciones intestinales utilizando la expresión del receptor EphB2. Esto nos permitió describir la firma genética de las CMIs. Observamos que los tumores de colon con altos niveles de expresión de la firma genética de CMI tienen mayor probabilidad de recaer después de terapia. Además de estas observaciones, describimos que los tumores de colon se organizan con una estructura similar a la del colon normal. Finalmente observamos que las células tumorales con altos niveles de EphB2 retienen una identidad de célula madre intestinal y se comportan como células madre tumorales. El segundo capítulo de esta tesis se centra en el estudio del gen Mex3a, el cual es un nuevo gen específico de células madre intestinal. Generamos ratones modificados genéticamente para eliminar la función de Mex3a in vivo. Observamos que este gen es esencial para el desarrollo embrionario, pero que es dispensable para la homeostasis del intestino adulto de ratón. También generamos un ratón reportero de Mex3a que nos permitió purificar una población de células intestinales que se asemejan a “células retenedoras de marcaje”. Además, con este ratón reportero pudimos purificar células madre de otros tejidos. Demostramos que Mex3a es un activador traduccional que interacciona con la proteína HuR. Nuestros datos sugieren que Mex3a podría estar involucrado en como las células madre responden a estrés.

No description available.

The recent discovery that intestinal adenomas are built on a stem cell hierarchy has raised great interest in understanding the signals that maintain tumor stem cells. We unveiled the existence of a transcriptional circuit dedicated to prevent the expansion of adenoma stem cells during the onset of CRC. This circuit was found to be controlled by the transcription factor GATA6, which directly activated the expression of the WNT pathway component LGR5 and repressed BMP levels in adenomas. As a result of this mechanism, two cell compartments were established in adenomas: a BMP positive zone that comprises differentiated tumor cells and a BMP negative niche that hosts adenoma stem cells. Genetic deletion of Gata6 elevated BMP levels in tumors, which in turn inhibited adenoma stem cell self-renewal and intestinal tumorigenesis. These findings represent a key contribution to understand the mechanisms that regulate the tumor stem cell hierarchy and reveal for first time the existence of a niche that protects AdSCs from BMP signals. In subsequent studies, we further explore the role of GATA factors in EMT both in Drosophila and mammalian models. During the formation of the Drosophila endoderm relatively static epithelial cells have to convert to highly migratory cells to form a large part of the intestinal tract. We showed that the Drosophila GATA factor Srp is necessary to induce EMT, which resulted in relocalization of E-cadherin protein without altering its expression. Mammalian GATA4 and GATA6 also induced an EMT when ectopically expressed in culture. GATA factor Srp and GATA6 both transcriptionally inhibited Crumbs orthologues, delocalized E-cadherin and activated mesenchymal genes. This work has uncovered a novel evolutionarily conserved alternative route to EMT that is Snail independent. This discovery could have important clinical implications in pathogenesis, namely in cancer progression. Further studies aimed to characterize WNT signaling during CRC progression. WNT signaling is required for the maintenance of colorectal cancer stem cells (CRC-SCs) but paradoxically low levels of WNT genes associate with a higher risk of disease relapse. We identified a core expression program driven by beta-catenin/TCF in CRC-SCs, which was shown to be a strict indicator of the dependency on WNT signaling for growth. We showed that during disease progression, a subset of WNT genes is downregulated as a consequence of tumor hypoxia. This response characterized a group of patients displaying very high risk of cancer recurrence after therapy. Hypoxia-induced genes were prominently expressed at invasion fronts coinciding with lower expression of the WNT program. Therefore, hypoxia refines the WNT program in CRC-SCs during the acquisition of a malignant phenotype. This finding has important implications in CRC progression, as it explains how some CRC-SC genes (like EPHB2) are shut down during the progression of the disease and directly challenges recent high impact work in the field that points to methylation as the mechanism responsible for the refinement of WNT signaling. Moreover it identifies hypoxia as a culprit in this invasive cell phenotype. These findings may have important clinical implications in treatment of CRC. / El reciente descubrimiento de que los adenomas intestinales mantienen una jerarquía similar a la del epitelio intestinal normal, ha despertado gran interés por entender las señales que especifican y mantienen a las células madre tumorales. En este trabajo, damos a conocer la existencia de un circuito transcripcional dedicado a prevenir la expansión de células madre de adenoma durante el inicio del cáncer colorectal (CCR). Este circuito está controlado por el factor de transcripción GATA6, el cual activa directamente el componente de la vía de señalización WNT LGR5, y reprime los niveles de BMP en adenomas. Como resultado de este mecanismo, se establecen dos compartimentos celulares en los adenomas: una zona BMP positiva que contiene células tumorales diferenciadas y un nicho BMP negativo que aloja células madre de adenoma. La deleción genética de Gata6 eleva los niveles de BMP en tumores, lo que a su vez inhibe la auto-renovación de células madre de adenoma y la tumorigénesis intestinal. Estos hallazgos representan una contribución fundamental para comprender los mecanismos que regulan la jerarquía de las células madre tumorales y revelan por primera vez la existencia de un nicho que protege a las células madre de adenoma de señales BMP. En estudios posteriores, continuamos explorando el rol de los factores GATA en la transición epitelio-mesénquima tanto en modelos de Drosophila como de mamífero. Durante el desarrollo del endodermo en Drosophila, células epiteliales relativamente estáticas se convierten en células migratorias para formar una gran parte del tracto intestinal a través del proceso de transición epitelio-mesénquima. Hemos demostrado que el factor GATA -en Drosophila denominado Srp- es necesario para inducir una transición epitelio-mesénquima que da lugar a la relocalización de la proteína E-cadherina sin alterar su expresión. Los factores GATA4 y GATA6 de mamífero también inducen transición epitelio-mesénquima cuando son expresados de forma ectópica en cultivos celulares. Tanto el factor GATA Srp como GATA6 inhiben la transcripción de ortólogos de Crumbs, deslocalizan la E-cadherina y activan genes mesenquimales. Nuestro trabajo ha dado a conocer una nueva ruta alternativa para la transición epitelio-mesénquima que se encuentra conservada evolutivamente y que es independiente de Snail. Este descubrimiento podría tener importantes implicaciones clínicas en patogenia, y más específicamente en la progresión del cáncer. Un tercer aspecto del trabajo presentado se centra en la caracterización de la vía de señalización WNT durante la progresión del CCR. La señalización WNT es necesaria para el mantenimiento de las células madre de cáncer colorectal (CM-CCR), aunque paradójicamente, bajos niveles de genes WNT se asocian con un mayor riesgo de recaída de la enfermedad. Hemos identificado un programa básico de expresión impulsado por beta-catenina/TCF en CM-CCR, que se ha demostrado ser un indicador estricto de la dependencia de señalización WNT para el crecimiento. Hemos demostrado que durante la progresión de la enfermedad, se suprime la expresión de un subconjunto de genes WNT como consecuencia de hipoxia tumoral. Esta respuesta caracteriza a un grupo de pacientes con un muy alto riesgo de reincidencia del cáncer después de la terapia. Los genes inducidos por hipoxia se expresan de manera prominente en frentes de invasión coincidiendo con una menor actividad de la vía del programa WNT. Por lo tanto, la hipoxia refina el programa WNT en CM-CCR durante la adquisición de un fenotipo maligno. Este hallazgo tiene implicaciones importantes para la progresión del CCR, porque explica cómo algunos genes de CM-CCR (como receptores EPHB2) se apagan durante la progresión de la enfermedad y directamente desafía trabajos de alto impacto recientemente reportados en el área, que apuestan por la metilación como mecanismo responsable del refinamiento del programa WNT. Por otra parte, identifica a la hipoxia como un culpable de este fenotipo de células invasivas. Estos hallazgos podrían tener importantes implicaciones clínicas en el tratamiento del cáncer colorectal.

Scientific rationale for study The literature about lasers in the field of periodontology is contradictory. The present study aimed at evaluating benefits of Er, Cr: YSGG laser irradiation following deep scaling compared to scaling alone in a randomized controlled clinical trial based on an appropriate sample size. Principal Findings The present study demonstrated that laser irradiation combined with conventional Sc/RP did not improve the clinical outcomes regarding probing pocket depth reduction and attachment level gain compared to Sc/RP alone. Practical implications Taken into account that lasers are expensive devices and no superior results can be expected by using them, their recommendation for clinical application is still questionable. / Justificació de l´estudi La literatura sobre l´ús de làser en el camp de la periodòncia és contradictori. Aquest estudi té com objectiu evaluar els beneficits de la irradiació amb làser d´Er,Cr:YSGG després de realitzar un raspat de les arrels comparat amb el raspat sense aplicar làser en un estudi clínic randomitzat amb un tamany mostral adequat. Resultats principals Aquest estudi ha demostrat que la irradiació de láser Er,Cr:YSGG combinada amb el tractament convencional de raspat I allisat radicular no millora les variables clíniques en la disminució de la profunditat de bossa i del augment del nivell d´inserció clínica. Implicacions pràctiques Tenint en compte que els aparells de làsers son costosos i que els resultats obtinguts no son superiors al tractament convencional, la recomanació d´aplicació clínica és a data d´avui encara qüestionable.

Cyclin O, a novel identified Cdk1 and Cdk2-binding cyclin, has been demonstrated to be required for apoptosis induced by intrinsic apoptotic stimuli. Because proteins implicated in apoptosis are often deregulated in cancer, we aimed to study the expression and role of Cyclin O in Colorectal carcinomas. We demonstrate that Cyclin O is overexpressed in CRC already during early stages of tumour development. Cyclin O expression correlated with a better prognosis of the CRC patients. Furthermore, we could show that loss of one Cyclin O allele leads to a higher adenoma count in a mouse model of CRC, the APCmin/+ mouse, suggesting that Cyclin O has tumour suppressor functions. Addtionally, we observed Cyclin O expression in the histologically normal APCmin/+ mouse- and in human peritumoral- intestinal epithelium. Accordingly, we hypothesise that Cyclin O could act as an early indicator of epithelial cell transformation to CRC. / La Ciclina O, una ciclina que ha estat identificada recentment i que s'uneix amb Cdk1 i Cdk2, s'ha demostrat ser necessària per a l'apoptosis induïda per estímuls intrinsecs. Donat que les proteïnes implicades en apoptosis solen estar desregulades en el càncer, nosaltres hem volgut estudiar l'expressió i la implicació de la Ciclina O en carcinomes colorectals (CRC). Hem demostrat que la Ciclina O es sobreexpressa en estadis prematurs de CRC. L'expressió de la Ciclina O correlaciona amb una millor pronòstic en pacients amb CRC. A més, hem demostrat que la pèrdua d'un al·lel de la Ciclina O comporta l'aparició d'un major nombre d'adenomes en un model de ratolí de CRC, els ratolin s APCmin/+. Això ens indica que la Ciclina O funciona com un gen supressor de tumors. També hem observat expressió de la Ciclina O en teixits no tumorals de l'epitel·li intestinal dels ratolins APCmin/+ i en teixit peritumorals de pacients amb CRC. Amb aquestes observacions hem arribat a formular la hipòtesi de que la Ciclina O podria ser útil com a indicador precoç de la transformació de cèl·lula epitel·lial a tumoral en los pacientes de CRC.

Els cossos de processament (cossos-P) són grànuls discrets i dinàmics que contenen mRNAs represos en la traducció així com proteïnes involucrades en la degradació dels mRNAs i de la maquinària dels miRNAs. Alguns components dels cossos-P, com els repressors de la traducció PatL1, LSm1 i DDX6, promouen la traducció i la replicació del virus de la hepatitis C (VHC) i d’altres virus RNA de polaritat positiva [RNA(+)]. A més a més, un genome wide screening en llevat va determinar que l’exonucleasa Xrn1, que també es localitza als cossos-P, pot afectar la taxa de recombinació d’un virus RNA(+) de plantes Així doncs, els components dels cossos-P estan estretament relacionats amb els cicles vitals dels virus RNA(+). En l’estudi que aquí es presenta hem explorat la relació del VHC amb els cossos-P, demostrant que la infecció pel VHC promou canvis en la composició dels cossos-P a través de l’alteració de la localització d’aquells components que són necessaris per a la replicació viral. A més a més, hem demostrat que els components dels cossos-P però no els grànuls per se són necessaris per a la replicació del VHC. Addicionalment, hem posat a punt un sistema de detecció de recombinació en cultiu cel•lular basat en replicons del VHC que permet analitzar successos de recombinació i caracteritzar la possible participació dels components dels cossos-P en aquest mecanisme d’evolució. Amb aquest sistema s’han establert les primeres estimacions en la freqüència de recombinació del VHC indicant que la recombinació en aquest virus no és gaire comú. A més a més, la reducció del nivell d’expressió de Xrn1 no va alterar la taxa de recombinació del VHC indicant que la utilització de l’exonucleasa no és una característica general en la recombinació dels virus RNA(+). En conjunt, aquests resultats incrementen el nostre coneixement sobre els aspectes bàsics de la biologia del VHC així com de l’estreta relació que aquest virus estableix amb l’hoste.

El propósito de esta investigación es evaluar la capacidad del sellado marginal de restauraciones de zirconio fabricadas a partir de impresiones digitales y de modelos de yeso obtenidos con poliéter como material de impresión en preparaciones con dos diseños de línea de terminación diferentes, hombro redondeado de 90º y chaflán de 45º; así como la influencia de los ciclos de cocción de la cerámica de recubrimiento, el glaseado y el cementado en el sellado marginal.

L’IKKα nuclear regula la transcripció gènica i ha estat relacionada amb la progressió del càncer i la metàstasis, tot i que la connexió mecanística no s’entén massa bé. Hem observat que les cèl·∙lules tumorals tenen una forma d’IKKα activada (p45-­‐IKKα) al nucli. Aquesta p45-­‐IKKα activada i nuclear forma un complex amb IKKα no activada i NEMO que media la fosforilació d’SMRT i d’histona H3. La formació de p45-­‐IKKα és necessària per tal de prevenir l’apoptosis de les cèl·∙lules de càncer colorectal i per tal de mantenir el creixement tumoral. També hem observat que KRAS a través de BRAF indueix l’activació de p45-­‐IKKα mediada per TAK1, amb un mínim efecte sobre NF-­‐κB. Mecanísticament, BRAF promou la ubiquitinació de NEMO i l’associació de la forma activada de TAK1 al complex de p45-­‐IKKα. També hem desmostrat que p45-­‐IKKα és necessària per la transformació cel·∙lular mediada per KRAS/BRAF i que inhibidors de la funció endosomal suprimeixen l’activitat de TAK1 i de p45-­‐IKKα. Treient partit d’un model ortotòpic xenògraft humà hem demostrat l’eficàcia d’aquestes drogues en prevenir la capacitat metastàtica de cèl·∙lules primàries de càncer colorectal d’un pacient amb resistència adquirida al tractament quimioteràpic estàndard / Nuclear IKKα regulate gene transcription and it has been linked to cancer progression and metastasis, although the mechanistic connection remains poorly understood. We have found that nucleus of tumor cells contains an active IKKα isoform of 45kD (p45-­‐IKKα). Active nuclear p45-­‐ IKKα forms a complex with non-­‐active IKKα and NEMO that mediates phosphorylation of SMRT and Histone H3. Generation of p45-­‐IKKα is required to prevent apoptosis of CRC cells and to sustain tumor growth. We have observed that KRAS through BRAF induces TAK1-­‐mediated activation of p45-­‐IKKα, with minor impact on NF-­‐κB. Mechanistically, BRAF promotes NEMO ubiquitination and association of active TAK1 to the p45-­‐IKKα complex. We also demonstrate that p45-­‐IKKα is required for KRAS/BRAF-­‐mediated cell transformation and inhibitors of the endosomal function abolished TAK1 and p45-­‐IKKα activities. Using a human orthotopic xenograft model we demonstrate the efficacy of these drugs in preventing the metastatic capacity of primary CRC cells from a patient with acquired resistance to standard chemotherapy.

The purpose of this study was to clinically compare the use of a 810 nm diode laser (DL) following modified Widman flap (test sites) to that of modified Widman flap (MWF) alone (control sites). Thirteen patients with periodontal pockets in two different quadrants with at least one tooth exhibiting a pocket depth of >7 millimeters and attachment levels of >7mm were selected. One side was randomly selected to receive MWF and the other to receive a diode laser following MWF. The DL was used to de-epithelialize the inner part of the periodontal flap and photo-biostimulate the surgical area. Probing depth (PD), clinical attachment levels (CAL), plaque index (PI), and gingival index (GI) were evaluated at baseline, 6 weeks and 5 months. Pain scale assessment (PS), pain medication consumption (PM), tissue edema (TE), and tissue color (TC) were evaluated one week following surgery. Treatment differences were analyzed using McNemar’s test, paired t-tests or a Wilcoxon Signed Rank Test. No statistical differences of CAL gain, PD, GI and PI reduction between laser sites and control sites were seen. Statistically significant differences were seen for TE (p=0.041), PM (p<0.001) and PS (p<0.001) favoring test sites. TC did not show a statistically significant difference (p=0.9766). Patients rated the first surgical treatment performed as more painful than the second (p<0.002). The use of a 810 nm diode laser following modified Widman flap provided additional benefits in terms of less edema and post operative pain.

The infection of gastric mucosa by Helicobacter pylori is a key step in the initiation and evolution to gastric adenocarcinomas. Prolonged infection promotes the infiltration of inflammatory cells and subsequent increased presence of pro-inflammatory cytokines. During the sequence of gastric pre-neoplasic lesions decrease the expression of gastric-specific genes whereas appears the ectopic expression of intestinal-specific genes. We describe that in gastric pre-neoplasic lesions and adenocarcinomas decrease the expression of the gastric transcription factor SOX2, whereas high expression of the intestinal transcription factor CDX2 is detected. Moreover, the pro-inflammatory cytokine IL-6, through SHP-2/ERK/MAPK and JAK/STAT pathways, contributes to the regulation of CDX2 expression in gastric cancer cells. And, NF-κB pathway, induced by IL-1β and TNF-α, has a role in the down-regulation of the gastric marker TFF1 in human stomach explants and gastric cancer cells. In conclusion, signalling pathways induced by pro-inflammatory cytokines can contribute to the down-regulation of gastric genes and the up-regulation of intestinal genes. / La infecció de la mucosa gàstrica per Helicobacter pylori és un factor clau en la iniciació i desenvolupament d’adenocarcinomes gàstrics. Durant una infecció prolongada augmenta la presència de citoquines pro-inflamatòries. En la seqüència de lesions pre-neoplàsiques gàstriques disminueix l’expressió de gens gàstrics i apareix l’expressió de gens intestinals. En aquest treball hem descrit que en lesions pre-neoplàsiques i adenocarcinomes gàstrics disminueix l’expressió del factor de transcripció gàstric SOX2, a la vegada que es detecta l’expressió ectòpica del factor de transcripció intestinal CDX2. A més, la citoquina pro-inflamatòria IL-6, a través de les vies SHP-2/ERK/MAPK i JAK/STAT, contribueix a la regulació de l’expressió de CDX2 en cèl•lules de cancer gàstric. La via d’NF-κB, induïda per IL-1β i TNF-α, contribueix a la disminució del marcador gàstric TFF1 en explants gàstrics humans i línies cèl•lulars gàstriques. En conclusió, les vies de senyalització induïdes per citoquines pro-inflamatòries poden ajudar a la disminució de l’expressió de gens gàstrics i a l’increment de l’expressió de gens intestinals.