S. pneumoniae est un pathogène qui cause plus d'un million de mort par an dans le monde. L'étude de la division bactérienne, processus essentiel à la propagation des bactéries, peut fournir de nouvelles cibles thérapeutiques. DivIB/FtsQ, DivIC/FtsB et FtsL sont trois protéines centrales de la division bactérienne. Nous avons pu démontrer que ces protéines forment un complexe ternaire essentiel à la division du pneumocoque. La protéine DivIB n'est pas essentielle en milieu riche. Son absence entraîne des défauts de séparation des cellules et confirme son rôle dans la division du pneumocoque. Cependant, DivIB est essentielle à la viabilité du pneumocoque en milieu défini. Par ailleurs, nous confirmons que DivIB est nécessaire à la stabilité de FtsL in vivo et suggérons que l'essentialité de DivIB est reliée à la stabilité relative de FtsL. Une étude de la fonctionnalité des domaines a, ß et gamma de la partie extracellulaire de DivIB a révélé que le domaine ß complet est nécessaire pour restaurer le phénotype sauvage de la souche. Enfin, la délétion de divIB accentue la sensibilité du pneumocoque aux antibiotiques de la famille des ß-lactames renforçant l'idée d'un rôle de DivIB dans le métabolisme de la paroi lors de la division. DivIB semble donc être une cible de choix pour rétablir l'efficacité des antibactériens les plus testés et les plus utilisés au monde, les ß-lactames.

Le peptidoglycane est un composant majeur de la paroi cellulaire bactérienne dont l'intégrité est essentielle à la survie cellulaire. La biosynthèse du peptidoglycane est un processus régulé faisant intervenir des enzymes de synthèse, les « Penicillin-Binding Proteins », et des hydrolases qui agissent, selon toute vraisemblance, de façon concertée lors de la croissance et de la division bactérienne. La comparaison des génomes bactériens a permis d'identifier un nouveau domaine protéique, probablement impliqué dans le clivage du peptidoglycane, présent uniquement chez les bactéries à Gram positif : le domaine PECACE (PEptidoglycan CArbohydrate Cleavage Enzyme). Ce domaine, prédit pour avoir un repliement tridimensionnel analogue aux domaines catalytiques de la transglycosylase lytique Slt70 d'Escherichia coli et du lysozyme de type G d'oie, pourrait participer au clivage de la liaison glycosidique β(1-4) entre les résidus acide N-acétyl-D-muramique et N-acétyl-D-glucosamine du peptidoglycane. Chez la bactérie pathogène Streptococcus pneumoniae, ce domaine est présent dans la région extracellulaire d'une protéine que nous nommons Pmp23 (Pneumococcal Membrane Protein). La forme recombinante de cette protéine membranaire bitopique de 23 kDa dégrade in vitro des extraits bactériens contenant du peptidoglycane. L'inactivation du gène pmp23 chez S. pneumoniae modifie le comportement de la bactérie en culture, accroît sa sensibilité aux antibiotiques de la famille des β-lactamines et perturbe la localisation du site de division. Ces observations indiquent que Pmp23 est une hydrolase intervenant dans le métabolisme du peptidoglycane septal.

FtsL, DivIC et DivIB sont trois protéines membranaires impliquées dans la division bactérienne. Leur fonction n'est pas totalement comprise, mais semble mutuellement dépendante, notamment à travers la formation de complexes. Pour contribuer à la connaissance structurale des protéines de la division bactérienne et apporter des indices sur la fonction des trois protéines citées, une étude structurale a été menée sur un système modèle de protéines recombinantes solubles de S. pneumoniae: FtsL, DivIC et DivIB. La partie extracellulaire de DivIB, un complexe contraint des parties extracellulaires de FtsL et DivIC, et l'interaction entre ce complexe et la partie extracellulaire de DivIB ont été étudiés par plusieurs techniques biophysiques (RMN, SAXS, SANS, BIA par SPR). La partie extracellulaire de DivIB est composée de trois domaines dont le domaine central est structuralement proche de son orthologue chez E. coli, et interagit avec un complexe des parties extracellulaires de DivIC et FtsL, via ce domaine central. Un épitope d'interaction sur ce domaine a été identifié. Les domaines C-terminaux de FtsL et divIC sont essentiels à l'interaction avec la partie extracellulaire de DivIB. Un modèle à basse résolution du complexe de ces trois protéines présente en effet le domaine central de la partie extracellulaire de DivIB à l'extrémité du complexe des parties extracellulaires de DivIC et FtsL. Différents modèles d'association dans la cellule, des protéines DivIB, DivIC et FtsL ont été évalués avec ces nouvelles données structurales.

La division bactérienne résulte de la constriction de la membrane, menée par la protéine du cytosquelette FtsZ, et de l’expansion et du remodelage de la paroi, réalisés par des synthétases et des hydrolases de la paroi. La coordination de ces processus au sein d’un macrocomplexe protéique, le divisome, est nécessaire au maintien de la forme et de l’intégrité bactérienne. J’ai étudié deux aspects importants de ce mécanisme de coordination chez le pathogène humain Streptococcus pneumoniae. J’ai déterminé in vivo la nanostructure de la protéine FtsZ en développant l’utilisation du PALM (PhotoActivated Localization Microscopy)chez le pneumocoque. Cette technique, basée sur la détection de molécules uniques et permettant une résolution de 20-40 nm, a révélé des aspects inattendus (dimensions, amas, sous-structures) de l’architecture de l’anneau de FtsZ au cours du cycle cellulaire. En parallèle, j’ai étudié le rôle de l’hydrolase Pmp23 par génétique, biochimie et microscopie à fluorescence. Mon travail a montré que Pmp23 est requise pour la stabilité des macrostructures du divisome du pneumocoque, révélant une nouvelle connexion entre le métabolisme de la paroi et la division cellulaire. / Bacterial division results from the combination of membrane constriction, driven by the cytoskeletal protein FtsZ, with cell wall expansion and remodeling, performed by cell wall synthases and hydrolases. Coordination of these processes within a large protein complex known as the divisome ensures cell integrity and maintenance of cell shape. I have investigated two important aspects of this coordination mechanism in the human pathogen Streptococcus pneumoniae. I determined the in vivo nanostructure of the divisome scaffolding protein FtsZ by developing the use of PhotoActivated Localization Microscopy (PALM) in the pneumococcus. PALM, which is based on the detection of single fluorescent labels and allows 20-40 nm resolution, has revealed unexpected features (dimensions, clusters, new substructures) of the FtsZ-ring architecture along the cell cycle. In parallel, I studied the role of the cell wall hydrolase Pmp23 using genetics, biochemistry and fluorescence microscopy. My work has shown that Pmp23 is required for the stability of divisome macrostructures in the pneumococcal cell, revealing a new connection between cell wall metabolism and cell division.

La bactérie Streptococcus pneumoniae peut provoquer de sérieuses pathologies chez l'homme telles que des pneumonies, méningites ou septicémies. L'étude de cette bactérie constitue donc un enjeu de santé publique international. Ces dernières années, il a été mis en évidence que les bactéries exprimaient des Sérine/Thréonine Protéine‐Kinases de type eucaryote (STPKs) et que ces dernières intervenaient dans la régulation de nombreux processus cellulaires. Une approche prometteuse serait donc de cibler les mécanismes de régulation contrôlés par les STPKs pour lutter contre les infections à pneumocoque. L'analyse du génome de S. pneumoniae a montré que cette bactérie possède un seul gène codant pour une STPK, la protéine StkP. Mes travaux de thèse ont montré que StkP est un acteur majeur de la division cellulaire et de la morphogenèse du pneumocoque. J'ai montré que son activité kinase est dépendante de la protéine GpsB et qu'elle phosphoryle spécifiquement plusieurs protéines dont la protéine de division DivIVA. L'ensemble de mes travaux permet de proposer un modèle dans lequel la triade StkP/GpsB/DivIVA régulerait finement la division et l'élongation cellulaire du pneumocoque. À plus long terme, ces travaux pourront servir de base à des études plus structurales pour développer des molécules bloquant les processus dépendants de la phosphorylation assurée par StkP, et générer ainsi de nouvelles molécules affectant le pouvoir pathogène du pneumocoque / The bacterium Streptococcus pneumoniae is the causative agent of several diseases such as pneumonia, meningitis or septicemia. The study of this bacterium represents thus an international health challenge. Over the last decade, bacteria have been shown to produce eukaryotic‐like Serine/Threonine Protein‐Kinases (STPKs) that are involved in the regulation of several cellular processes. A promising approach would be to target the regulatory mechanisms controlled by STPKs to combat pneumococcal infections. The pneumococcus possesses a single gene encoding for a STPK, the protein StkP. The aim of my work was to characterize the biological function of StkP. My work shows that StkP plays crucial roles in the cell division and morphogenesis of S. pneumoniae. I show that the cell division protein GpsB is required for the kinase activity of StkP that, in turn, specifically phosphorylates the cell division protein DivIVA. Altogether, I propose a model in which the StkP/GpsB/DivIVA triad finely tunes S. pneumonia cell division and elongation. These data could provide the basis for future structural studies to develop specific inhibitors of StkP‐mediated phosphorylation and affecting pneumococcal virulence