Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-07T17:22:47Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 563823 bytes, checksum: 2c66f83b8501ad88309e6fc9cd513ad6 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-07T17:22:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 563823 bytes, checksum: 2c66f83b8501ad88309e6fc9cd513ad6 (MD5) Previous issue date: 2005-07-29 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Devido à grande importância que a soja representa para a agricultura mundial, avanços vêm ocorrendo nas técnicas voltadas para o desenvolvimento genético, molecular e genômico desta leguminosa a fim de assegurar produção suficiente para a comercialização dos grãos e de seus derivados. As principais perdas no cultivo da soja são decorrentes de doenças. Entender as interações entre hospedeiro-patógeno e os mecanismos de resistência envolvidos nessa relação são importantes para possibilitar o controle de grandes epidemias em culturas agrícolas, bem como elucidar mecanismos de sinalização ativados em resposta ao patógeno. Dentro deste cenário, este trabalho objetivou a identificação de genes envolvidos na resposta de resistência a doenças da soja. Por meio do screening de uma biblioteca de cDNA do cultivar FT-Cristalina, clones positivos foram isolados utilizando o fragmento de RFLP A53-09 como sonda. Este fragmento possui 1019 pb e apresenta homologia a genes de resistência. Três clones foram obtidos a partir da análise de 5 x10 5 placas de lise de fagos recombinantes hibridizados à sonda, os quais foram denominados: A5309-47, A5309-71 e A5309-72. O tamanho estimado de cada um foi de 2,0; 1,3 e 1,12 kb, respectivamente. Estes clones foram seqüenciados e suas seqüências nucleotídicas foram submetidas à análise de similaridade com outras seqüências existentes no banco de dados GenBank, com o auxílio do programa BLASTX. O alinhamento entre as seqüências nucleotídicas dos clones isolados com a sonda A53-09 mostrou uma identidade de nucleotídeos variando entre 41 e 45%. O clone A5309-47 foi parcialmente seqüenciado, obtendo-se uma sequência de 963 pb com uma ORF putativa correspondente a 78 resíduos de aminoácidos, homóloga à enzima lipoxigenase (LOX) de Glycine max, com 85% de identidade. O clone A5309-71 foi totalmente seqüenciado; contém 1587 pb com uma ORF correspondente a 306 resíduos de aminoácidos. A análise de similaridade revelou que há 75% de identidade deste clone com a proteína estearoil-acil dessaturase de Arabidopsis thaliana. O clone A5309-72 também foi totalmente seqüenciado, apresentando 1263 pb, com uma ORF correspondente a 124 resíduos de aminoácidos com identidade de 43% a uma peroxidase de Glycine max. Todos os clones isolados apresentaram similaridades com enzimas chaves para a ativação de várias vias de respostas de defesa, por meio de mecanismos que alteram todo o metabolismo da planta. Sendo assim, todas as seqüências de DNA obtidas correspondem a proteínas que estão potencialmente envolvidas na defesa da planta. / The great importance of soybean to world agriculture has brought advancements in techniques for the genetic, molecular and genomic development of this legume in order to assure enough production for the commercialization of grains and byproducts. The main losses in soybean crop are due to diseases. Understanding host-pathogen interactions and the resistance mechanisms involved in this relationship is important in making it possible to control major epidemics in crops, as well as to elucidate signaling mechanisms activated in response to pathogens. In this context, the objective of this work was to identify genes involved in the resistance response to soybean diseases. By screening a cDNA library of cultivar FT-Cristalina, positive clones were isolated using the A53-09 fragment as an RFLP probe. This 1019-pb fragment shows resistance gene homology. Three clones were obtained from the analysis of 5x10 5 lysis plates of recombinant phages hybridized to the probe, which were named: A5309-47, A5309-71 and A5309-72. The estimated size of each one was of 2,0, 1.3, and 112 kb respectively. These clones were sequenced and their nucleotide sequences were analyzed for similarity to sequences in GenBank database, using the BLASTX software. The alignment between the nucleotide sequences of the clones isolated with the A53-09 probe showed a nucleotide identity varying between 41 and 45%. The clone A5309-47 was partially sequenced, resulting in a 963-pb sequence with a putative ORF corresponding to 78 amino acid residues, homologous to Glycine max lipoxigenase enzyme (LOX), with 85% identity. The clone A5309-71 was totally sequenced; it contains 1587 pb with ORF corresponding to 306 amino acid residues. The similarity analysis revealed 75% identity of this clone with the protein estearoil-acyl desaturase of Arabidopsis thaliana. The clone A5309-72 was also totally sequenced, giving 1263 pb, with ORF corresponding to 124 amino acid residues with 43% identity to a Glycine max peroxidase. All isolated clones showed high similarities with key enzymes for the activation of several defense-response pathways, through mechanisms which modify the whole plant metabolism. Therefore, all DNA obtained sequences correspond to proteins potentially involved in plant defense. / Dissertação importada do Alexandria.

Orientador: Sergio Marangoni / Tese (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas / Made available in DSpace on 2018-08-04T18:57:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fagundes_FabioHenriqueRamos_M.pdf: 2584588 bytes, checksum: b35682c6f4cea12ca88485bf389b2262 (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Enquanto estudos estruturais de toxinas de veneno de serpentes são feitos usando amostras de veneno, a construção de cDNAs precursores destas toxinas requer o sacrifício do espécime para a extração da glândula de veneno. No presente trabalho nós descrevemos uma técnica simples para isolar mRNAs presentes em amostras de veneno total. Para ilustrar esta técnica nós amplificamos através de RT-PCR um cDNA que codifica uma PLA2 049 (F6) do complexo crotoxina neurotóxica "in vitro" a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus. Estes achados implicam que a aparente ausência do mRNA em matrizes biológicas complexas não são sempre reais e facilitam a maneira de aquisição acelerada de dados micro evolutivos assim como de estrutura-função desta família de proteínas para serem utilizadas como ferramentas moleculares, sem o sacrifício do animal. O cONA que codifica PLA2 F6 do complexo crotoxina presente no veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus foi seqüenciada. A seqüência deduzida de aminoácidos deste cDNA codifica a PLA2 (F6) com alto grau de homologia seqüencial desta família de proteínas PLA2 do grupo 11, incluindo os 14 resíduos de cisteina capazes de dar forma a sete ligações dissulfeto que caracterizam este grupo de PLA2. A PLA2, foi isolada a partir do veneno total da sub espécie Crotalus durissus collilineatus através de coluna de cromatografia convencional de baixa pressão (8ephades G75) e por HPLC fase reversa. A massa molecular foi estimada por espectrometria de massa por MALDI - TOF. Para a identificação desta PLA2 (F6) como uma neurotoxina "in vitro", nós usamos a preparação biventer cervicis de pintainho. A análise filogenética da PLA2 (F6) da sub espécie Crotalus durissus collilineatus mostrou que os subtipos estruturais de N6-PLA2s com a substituição F24 ou 824 evoluíram paralelamente, possivelmente descendendo respectivamente das Protobothrops e a Gloydius dos dias de hoje / Abstract: While structural studies of snake venom toxins can be achieved using venom samples, until now the construction of precursor cDNAs required sacrifice of the specimen for dissection of the venom glands. Here we describe a simple and rapid technique that isolation mRNAs present in whole venom samples. To iIIustrate the technique we have RT-PCR amplified the cDNA that it codifies a "in vitro" neurotoxic protein PLA2 049 (F6) from crotoxin complex, from the venom of snake sub specie, Crotalus durissus collilineatus. These findings imply that the apparent absence of mRNA in complex biological matrices is not always real and paves the way for accelerated acquisition of micro evolution as well as of structure-function of this protein family being used as molecular tools, without sacrifice of animal. The cDNA encoding PLA2 F6 from crotoxin complex in the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus venom was sequenced. The deduced amino acid sequence of this cDNA encoded PLA2 (F6) with high overall sequence identity of this protein family to the group 11 PLA2, including the 14 cysteine residues capable of forming seven disulphide bonds that characterize this group of PLA2 enzymes. The PLA2, were isolated from the whole venom of sub specie Crotalus durissus collilineatus by the conventional and low pressure chromatography (8ephades G75) column and the reverse phase HPLC. The molecular mass estimated by MALDI-TOF mass spectrometry. For the identified this PLA2 F6 like as a "in vitro" neurotoxin, we use the neuromuscular blocking activities were assayed with the chick biventer cervicis neuromuscular tissue. The sub specie' s Crotalus durissus collilineatus PLA2 (F6) phylogeny analysis showed that two structural subtypes of N6-PLA2s with either F24 or 824 substitution have been evolved in parallel, possibly descended respectively from species related to present-day Protobothrops and Gloydius / Mestrado / Bioquimica / Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Submitted by Anderson Silva (avargas@icict.fiocruz.br) on 2012-10-17T17:59:45Z No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) / Made available in DSpace on 2012-10-17T17:59:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ana_c_b_nascimento_ioc_bcm_0022_2010.pdf: 7179459 bytes, checksum: 2ef62247bd903a56caf55419a431306c (MD5) Previous issue date: 2010 / Universidade Federal do Rio de Janeiro. Instituto de Ciencias Medicas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Anualmente, a malária afeta cerca de 300 milhões de pessoas no mundo (causando cerca de um milhão de mortes). No Brasil 450.000 casos são notificados anualmente. Recentemente, muitos trabalhos têm procurado identificar moléculas mediadoras da interação mosquito/plasmódio. Anopheles aquasalis é o vetor de malária mais importante nas regiões litorâneas do Brasil e Plasmodium vivax o agente etiológico causador da maior parte dos casos da doença. Este estudo visa examinar moléculas que participam da interação entre estes dois organismos. Para tal, duas estratégias foram utilizadas: subtração de cDNAs e PCR com iniciadores degenerados. As bibliotecas subtrativas foram produzidas a partir de amostras de A. aquasalis 2 e 24 horas após alimentação sanguínea ou infecção por P. vivax. Após a análise dos cDNAs obtidos foram observadas diferenças na expressão de genes entre A. aquasalis alimentados com sangue e com sangue infectado em ambos os intervalos de tempo investigados. Os resultados das subtrações de cDNA para os genes serino protease, fibrinogênio, proteína responsiva a bactéria e carboxipeptidase foram corroborados utilizando PCR em tempo real. Por exemplo, uma cecropina teve a sua expressão diminuída após a infecção com P. vivax e uma serpina apresentou um resultado oposto. Análise de um fator de transcrição GATA revelou um aumento de RNAm 36 horas após infecção com P. vivax assim como um aumento da infecção após silenciamento deste gene, demonstrando a importância deste fator de transcrição para a resposta imune do inseto contra P. vivax. Em paralelo, cDNAs de A. aquasalis específicos para genes relacionados com a via JAK-STAT [fator de transcrição STAT, proteína inibitória de STAT ativado (PIAS) e óxido nítrico sintase (NOS)] e com o sistema de detoxificação celular (catalase e duas superóxido dismutases) foram amplificados utilizando iniciadores degenerados. Resultados de expressão destes genes revelaram que STAT, PIAS e NOS são induzidos pela infecção com P. vivax e experimentos de genética reversa comprovaram que a via de sinalização JAK/STAT é importante na resposta imune do A. aquasalis contra este parasito. Com relação às enzimas de detoxificação, foi observado um aumento da expressão 36 horas após infecção e uma diminuição da atividade das enzimas SOD e catalase 24 horas após infecção. Este aumento de RNAm 36 horas após infecção pode estar relacionado à tentativa das células de diminuírem a quantidade intracelular de espécies reativas de oxigênio mantida pela diminuição da atividade destas enzimas 24 horas pós infecção. Surpreendentemente, o silenciamento da catalase exacerbou a infecção do P. vivax. Este resultado pode ser correlacionado com a produção de uma rede de ditirosina que protegeria os parasitos da resposta imune do inseto. Nossos resultados apontam mecanismos imunes adotados pelo A. aquasalis para combater o P. vivax, fornecendo informações importantes sobre moléculas envolvidas no processo de interação e imunidade deste vetor de malária no Brasil com seu parasito. / Each year, malaria affects 300 million people worldwide, causing 1 million deaths. In Brazil, 450,000 cases are reported annually. Recently, many studies have attempted to identify molecules that mediate the interaction mosquito-parasite. Anopheles aquasalis is the most important vector of malaria in the coastal regions of Brazil and the etiological agent Plasmodium vivax causes most cases of the disease. This study aims examining molecules that participate in the interaction between these two organisms. For this, two strategies were used: cDNA subtraction and PCR using degenerate primers. The subtractive libraries were produced from samples of A. aquasalis 2 and 24 hours after blood feeding or infection by P. vivax. After analyzes of cDNAs, differences were observed in gene expression between A. aquasalis fed with blood or infected blood at both times investigated. The expression of some candidates obtained through subtraction cDNA (serine protease, fibrinogen, carboxypeptidase and bacteria responsive protein genes) were confirmed using real time PCR. For example, the expression of a cecropin decreased after P. vivax infection while a serpin presented increased expression. Analysis of a transcription factor, GATA, revealed an increase in the mRNA levels 36 hours after infection. Silencing of this gene produced increased infection, demonstrating the importance of this transcription factor for the insect's immune response against P. vivax. In parallel, A. aquasalis cDNA sequences for the JAK-STAT pathway [transcription factor STAT, protein inhibitor of activated STAT (PIAS) and nitric oxide synthase (NOS)] and for genes related to cellular detoxification (catalase and two superoxide dismutases) were obtained using degenerate primers. Results of expression of these genes revealed that STAT, PIAS and NOS are induced by infection with P. vivax and reverse genetics experiments have shown that this pathway is important in the immune response of A. aquasalis against P. vivax. Regarding the detoxification enzymes, an increase in mRNA expression was observed 36 hours after infection and a decrease in activity 24 hours after infection. This increase in mRNA 36 hours after infection may be related to the attempt of cells to decrease the amount of intracellular ROS due to the diminished activity of these enzymes 24 hours after infection. Surprisingly, the silencing of catalase exacerbated the infection of P. vivax. This result may be correlated with the production of a dytirosine network that protects the parasites from the insect's immune response. Our results indicate immune mechanisms adopted by A. aquasalis to combat P. vivax, providing important information about molecules involved in the process of interaction and immunity of this vector with its Brazilian malaria parasite.

A biotecnologia está revolucionando a atividade humana nas mais diversas áreas. No setor florestal, as novas tecnologias como transgenia, genômica, proteômica e bioinformática, estão sendo rapidamente incorporadas. A associação dessas tecnologias aos programas de melhoramento convencional de árvores pode acelerar o processo de obtenção de árvores com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. UDP-glicose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glicose, intermediário na interconversão de carboidratos envolvidos em várias funções metabólicas, como síntese de sacarose e de celulose. No presente trabalho, foi clonado o cDNA que codifica a UGPase. Este cDNA foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando-se mRNA extraído de tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.). Os primers específicos para a ORF do gene da UGPase foram definidos com base em seqüências conservadas entre genes ortólogos, já disponíveis em bancos de dados. O cDNA foi clonado no vetor pENTR-D TOPO e inserido, por meio de transformação química, em células competentes de Escherichia coli. O DNA plasmidial foi purificado e após seu sequenciamento, a presença de um inserto de 1402 pb foi confirmada. O alinhamento da seqüência deduzida de aminoácidos com outras UGPases revelou alta homologia a UGPases de batata e de outras espécies vegetais. Na seqüência do cDNA clonado foram identificados sítios de N-glicosilação, resíduos lisina e motivos conservados que possivelmente estão relacionados tanto com a capacidade de ligação ao substrato, como com a atividade catalítica da enzima. Também foi realizada uma análise de Southern blot para confirmar a presença deste gene no DNA genômico de batata e de eucalipto (Eucalyptus grandis). Posteriormente, o cDNA clonado será utilizado na avaliação do impacto de sua superexpressão na biossíntese de celulose e hemiceluloses e no desenvolvimento de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto. / Biotechnology is revolutionazing human activity in several fields. In forestry, new technologies like transgenies, genomics, proteomics and bioinformatics have been quickly consolidated. Assossiating these technologies with conventional forestry breeding will accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important intermediate in carbohydrate interconversion involved in various metabolic processes like sucrose and cellulose synthesis. In this work, it was cloned the cDNA that encodes UGPase. This cDNA was synthetized through RT-PCR using RNA extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber. The UGPase primers were designed based on the conserved sequences of hortologous genes, already available in public data banks. The cDNA was cloned into pENTR-D TOPO vector and introduced into Escherichia coli competent cells, by chemically transforming. The plasmid DNA was purified and the insert PCR amplified. The presence of 1402 bp insert was confirmed after sequencing. The alignment of the derived amino acids sequence with other UGPases revealed high homology to UGPases from potato and other plant species. Along the cDNA sequence N-glicolisation sites, Lysyl residues and conserved domain were identified, which probably are involved in substrate binding capacity, as well as catalytic ativity of the enzyme. Southern blot analysis was carried to confirm the presence of this gene in potato and eucalypt (Eucalyptus grandis) genomic DNA. The cloned cDNA will be used to evaluate the impact of overexpression on celullose and hemicelluloses biosynthesis and in the tobacco (Nicotiana tabacum) and eucalypt plant development.

A biotecnologia está revolucionando a atividade humana nas mais diversas áreas. No setor florestal, as novas tecnologias como transgenia, genômica, proteômica e bioinformática, estão sendo rapidamente incorporadas. A associação dessas tecnologias aos programas de melhoramento convencional de árvores pode acelerar o processo de obtenção de árvores com características específicas da madeira para a indústria de papel e celulose. UDP–glicose pirofosforilase (UGPase, EC 2.7.7.9) é uma enzima chave na produção de UDP-glicose, intermediário na interconversão de carboidratos envolvidos em várias funções metabólicas, como síntese de sacarose e de celulose. No presente trabalho, foi clonado o cDNA que codifica a UGPase. Este cDNA foi sintetizado por meio de RT-PCR utilizando-se mRNA extraído de tubérculo de batata (Solanum tuberosum L.). Os primers específicos para a ORF do gene da UGPase foram definidos com base em seqüências conservadas entre genes ortólogos, já disponíveis em bancos de dados. O cDNA foi clonado no vetor pENTR-D TOPO e inserido, por meio de transformação química, em células competentes de Escherichia coli. O DNA plasmidial foi purificado e após seu sequenciamento, a presença de um inserto de 1402 pb foi confirmada. O alinhamento da seqüência deduzida de aminoácidos com outras UGPases revelou alta homologia a UGPases de batata e de outras espécies vegetais. Na seqüência do cDNA clonado foram identificados sítios de N-glicosilação, resíduos lisina e motivos conservados que possivelmente estão relacionados tanto com a capacidade de ligação ao substrato, como com a atividade catalítica da enzima. Também foi realizada uma análise de Southern blot para confirmar a presença deste gene no DNA genômico de batata e de eucalipto (Eucalyptus grandis). Posteriormente, o cDNA clonado será utilizado na avaliação do impacto de sua superexpressão na biossíntese de celulose e hemiceluloses e no desenvolvimento de plantas de fumo (Nicotiana tabacum) e de eucalipto. / Biotechnology is revolutionazing human activity in several fields. In forestry, new technologies like transgenies, genomics, proteomics and bioinformatics have been quickly consolidated. Assossiating these technologies with conventional forestry breeding will accelerate the process of obtaining new trees with specific wood properties for the paper and pulp industry. UDP-glucose pyrophosphorylase (UGPase, EC 2.7.7.9) is a key enzyme producing UDP-glucose, an important intermediate in carbohydrate interconversion involved in various metabolic processes like sucrose and cellulose synthesis. In this work, it was cloned the cDNA that encodes UGPase. This cDNA was synthetized through RT-PCR using RNA extracted from potato (Solanum tuberosum L.) tuber. The UGPase primers were designed based on the conserved sequences of hortologous genes, already available in public data banks. The cDNA was cloned into pENTR-D TOPO vector and introduced into Escherichia coli competent cells, by chemically transforming. The plasmid DNA was purified and the insert PCR amplified. The presence of 1402 bp insert was confirmed after sequencing. The alignment of the derived amino acids sequence with other UGPases revealed high homology to UGPases from potato and other plant species. Along the cDNA sequence N-glicolisation sites, Lysyl residues and conserved domain were identified, which probably are involved in substrate binding capacity, as well as catalytic ativity of the enzyme. Southern blot analysis was carried to confirm the presence of this gene in potato and eucalypt (Eucalyptus grandis) genomic DNA. The cloned cDNA will be used to evaluate the impact of overexpression on celullose and hemicelluloses biosynthesis and in the tobacco (Nicotiana tabacum) and eucalypt plant development.

Com o propósito de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência sistêmica adquirida (SAR) em plantas suscetíveis contra fitopatógenos, foram conduzidos estudos na interação Coffea arabica-Hemileia vastatrix. A indução de atividade de quitinases e b-1,3-glucanases e o envolvimento dessas enzimas na resistência sistêmica adquirida contra H. vastatrix foram avaliados em cafeeiro suscetível cultivar Mundo Novo (MN) após o tratamento com acibenzolar-S-metil (ASM) (200 mg de i.a./mL). O produto induziu aumento local e sistêmico das atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nos tecidos foliares, a partir do primeiro e segundo dia da aplicação do indutor, respectivamente. As atividades enzimáticas atingiram níveis máximos de aumento nas plantas tratadas em relação ao controle, sete dias após a aplicação do ASM. Resistências local e sistêmica ao patógeno foram induzidas a partir do primeiro dia após o tratamento com ASM. A proteção e atividades enzimáticas foram detectadas até 35 dias, após aplicação do indutor. A indução de resistência local contra a ferrugem atingiu um nível máximo de 87% entre 7 e 14 dias. Níveis máximos de proteção sistêmica de 53 a 68% foram observados entre 2 e 21 dias após o tratamento de cafeeiro com o indutor. Neste intervalo de tempo foi observado, também, um aumento sistêmico máximo de atividade enzimática. Os resultados sugerem que o aumento de atividade dessas hidrolases está relacionado com a resistência local e sistêmica, induzida por ASM, em cafeeiro MN contra a ferrugem. Genes relacionados à SAR foram identificados em cafeeiro através de hibridização subtrativa por supressão (HSS), a partir de mRNAs isolados de plantas suscetíveis cv. MN, 72 h após o tratamento com ASM (200 mg i.a./mL). Os mecanismos de respostas de defesa associados à SAR ativada em MN foram comparados, através do isolamento de genes por HSS, com a resistência raça-cultivar específica observada no cafeeiro resistente Híbrido de Timor (HT), 72 h após a inoculação com H. vastatrix. Através da HSS, produziram-se duas bibliotecas de cDNAs subtraídas, enriquecidas de fragmentos de genes induzidos em MN pelo ASM (MN-ASM) ou ativados em HT pelo patógeno (HT-Hv). Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal, síntese de proteínas relacionadas à patogênese, metabolismo de lipídeos e degradação controlada de proteínas. Foi identificado em HT-Hv um número maior de genes implicados em mecanismos de defesa (22%), do que em MN-ASM (16%). Na interação HT-Hv foi detectado um número maior de genes implicados na percepção e transdução de sinal (44%), do que em MN-ASM (30%). Entretanto, o número de genes codificadores de proteínas antimicrobianas foi maior no MN com resistência induzida (22%), do que no cafeeiro resistente HT inoculado com o patógeno (6%). Foram isolados de HT-Hv e MN-ASM, genes codificadores de b-1,3-glucanases e as seqüências completas puderam ser determinadas através da técnica RACE. Os resultados obtidos sugerem que a resistência em HT-Hv e MN-ASM ocorre através de mecanismos distintos. / Studies on the interaction Coffea arabica-Hemileia vastatrix were performed in order to contribute to the elucidation of biochemical and molecular mechanisms involved in systemic acquired resistance (SAR) developed in susceptible plants against pathogens. Induction of chitinase and b-1,3-glucanase activities and their involvement in systemic acquired resistance against H. vastatrix were evaluated in susceptible coffee plants cultivar "Mundo Novo" (MN) after treatment with acibenzolar-S-methyl (ASM) (200 mg a.i./mL). The product induced local and systemic increases in chitinase and b-1,3-glucanase activities in leaf tissues, starting from the first and second days after inducer application, respectively. The increases in enzymatic activity reached their maximum levels in treated plants compared to control seven days after application of ASM. Induction of local and systemic resistance against pathogen was detected one day after ASM treatment. Protection and increases in enzyme activities were detected up to 35 days after product application. Induction of local resistance against coffee leaf rust reached a highest level of 87% between 7 and 14 days. Highest levels of systemic protection ranging from 53% to 68% were observed in coffee plants between 2 and 21 days after inducer treatment. During the same time frame maximum increases in systemic enzymatic activity were also observed. Results suggest that the increases in these hydrolase activities were correlated with the local and systemic resistance induced by ASM in coffee plants against coffee leaf rust. Genes related to SAR were identified in coffee plants by suppression subtractive hybridization (SSH), from mRNA isolated from susceptible plants cv. MN 72 h after treatment with ASM (200 mg a.i./mL). The mechanisms of defense responses associated with SAR activated in MN were compared through the isolation of genes by SSH, with the race-specific resistance observed in the resistant coffee plant "Híbrido de Timor" (HT) 72 h after the inoculation with H. vastatrix. By SSH technique two subtracted cDNA libraries were constructed enriched for gene fragments induced in MN by ASM (MN-ASM) or activated in HT by pathogen infection (HT-Hv). The isolated genes were involved in different processes related to resistance against pathogens, such as: production of active oxygen species, hypersensitive response, programmed cell death, synthesis and transport of antimicrobial metabolites, signal perception and transduction, synthesis of pathogenesis-related proteins, lipid metabolism and selective degradation of proteins. It was identified in HT-Hv a higher number of defense-related genes (22 %) than in MN-ASM (16 %). The incompatible interaction HT-Hv showed a higher number of genes implicated in the signal perception and transduction (44 %) than MN-ASM (30 %). However, the number of genes encoding antimicrobial proteins was higher in the susceptible cultivar MN with induced resistance (22 %) than in the resistant coffee plant HT inoculated with the incompatible pathogen (6 %). Genes encoding b-1,3-glucanases were isolated from HT-Hv and MN-ASM and their complete sequences could be obtained by RACE procedure. Results suggest that distinct recognition events and defense pathways are involved in the expression of resistance in HT-Hv and MN-ASM.

Com o propósito de contribuir para o esclarecimento dos mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na resistência sistêmica adquirida (SAR) em plantas suscetíveis contra fitopatógenos, foram conduzidos estudos na interação Coffea arabica-Hemileia vastatrix. A indução de atividade de quitinases e b-1,3-glucanases e o envolvimento dessas enzimas na resistência sistêmica adquirida contra H. vastatrix foram avaliados em cafeeiro suscetível cultivar Mundo Novo (MN) após o tratamento com acibenzolar-S-metil (ASM) (200 mg de i.a./mL). O produto induziu aumento local e sistêmico das atividades de quitinases e b-1,3-glucanases nos tecidos foliares, a partir do primeiro e segundo dia da aplicação do indutor, respectivamente. As atividades enzimáticas atingiram níveis máximos de aumento nas plantas tratadas em relação ao controle, sete dias após a aplicação do ASM. Resistências local e sistêmica ao patógeno foram induzidas a partir do primeiro dia após o tratamento com ASM. A proteção e atividades enzimáticas foram detectadas até 35 dias, após aplicação do indutor. A indução de resistência local contra a ferrugem atingiu um nível máximo de 87% entre 7 e 14 dias. Níveis máximos de proteção sistêmica de 53 a 68% foram observados entre 2 e 21 dias após o tratamento de cafeeiro com o indutor. Neste intervalo de tempo foi observado, também, um aumento sistêmico máximo de atividade enzimática. Os resultados sugerem que o aumento de atividade dessas hidrolases está relacionado com a resistência local e sistêmica, induzida por ASM, em cafeeiro MN contra a ferrugem. Genes relacionados à SAR foram identificados em cafeeiro através de hibridização subtrativa por supressão (HSS), a partir de mRNAs isolados de plantas suscetíveis cv. MN, 72 h após o tratamento com ASM (200 mg i.a./mL). Os mecanismos de respostas de defesa associados à SAR ativada em MN foram comparados, através do isolamento de genes por HSS, com a resistência raça-cultivar específica observada no cafeeiro resistente Híbrido de Timor (HT), 72 h após a inoculação com H. vastatrix. Através da HSS, produziram-se duas bibliotecas de cDNAs subtraídas, enriquecidas de fragmentos de genes induzidos em MN pelo ASM (MN-ASM) ou ativados em HT pelo patógeno (HT-Hv). Os genes encontrados estão envolvidos em diversos processos relacionados à resistência contra fitopatógenos como: formação de espécies de oxigênio reativas, resposta de hipersensibilidade, morte celular programada, síntese e transporte de metabólitos antimicrobianos, percepção e transdução de sinal, síntese de proteínas relacionadas à patogênese, metabolismo de lipídeos e degradação controlada de proteínas. Foi identificado em HT-Hv um número maior de genes implicados em mecanismos de defesa (22%), do que em MN-ASM (16%). Na interação HT-Hv foi detectado um número maior de genes implicados na percepção e transdução de sinal (44%), do que em MN-ASM (30%). Entretanto, o número de genes codificadores de proteínas antimicrobianas foi maior no MN com resistência induzida (22%), do que no cafeeiro resistente HT inoculado com o patógeno (6%). Foram isolados de HT-Hv e MN-ASM, genes codificadores de b-1,3-glucanases e as seqüências completas puderam ser determinadas através da técnica RACE. Os resultados obtidos sugerem que a resistência em HT-Hv e MN-ASM ocorre através de mecanismos distintos. / Studies on the interaction Coffea arabica-Hemileia vastatrix were performed in order to contribute to the elucidation of biochemical and molecular mechanisms involved in systemic acquired resistance (SAR) developed in susceptible plants against pathogens. Induction of chitinase and b-1,3-glucanase activities and their involvement in systemic acquired resistance against H. vastatrix were evaluated in susceptible coffee plants cultivar "Mundo Novo" (MN) after treatment with acibenzolar-S-methyl (ASM) (200 mg a.i./mL). The product induced local and systemic increases in chitinase and b-1,3-glucanase activities in leaf tissues, starting from the first and second days after inducer application, respectively. The increases in enzymatic activity reached their maximum levels in treated plants compared to control seven days after application of ASM. Induction of local and systemic resistance against pathogen was detected one day after ASM treatment. Protection and increases in enzyme activities were detected up to 35 days after product application. Induction of local resistance against coffee leaf rust reached a highest level of 87% between 7 and 14 days. Highest levels of systemic protection ranging from 53% to 68% were observed in coffee plants between 2 and 21 days after inducer treatment. During the same time frame maximum increases in systemic enzymatic activity were also observed. Results suggest that the increases in these hydrolase activities were correlated with the local and systemic resistance induced by ASM in coffee plants against coffee leaf rust. Genes related to SAR were identified in coffee plants by suppression subtractive hybridization (SSH), from mRNA isolated from susceptible plants cv. MN 72 h after treatment with ASM (200 mg a.i./mL). The mechanisms of defense responses associated with SAR activated in MN were compared through the isolation of genes by SSH, with the race-specific resistance observed in the resistant coffee plant "Híbrido de Timor" (HT) 72 h after the inoculation with H. vastatrix. By SSH technique two subtracted cDNA libraries were constructed enriched for gene fragments induced in MN by ASM (MN-ASM) or activated in HT by pathogen infection (HT-Hv). The isolated genes were involved in different processes related to resistance against pathogens, such as: production of active oxygen species, hypersensitive response, programmed cell death, synthesis and transport of antimicrobial metabolites, signal perception and transduction, synthesis of pathogenesis-related proteins, lipid metabolism and selective degradation of proteins. It was identified in HT-Hv a higher number of defense-related genes (22 %) than in MN-ASM (16 %). The incompatible interaction HT-Hv showed a higher number of genes implicated in the signal perception and transduction (44 %) than MN-ASM (30 %). However, the number of genes encoding antimicrobial proteins was higher in the susceptible cultivar MN with induced resistance (22 %) than in the resistant coffee plant HT inoculated with the incompatible pathogen (6 %). Genes encoding b-1,3-glucanases were isolated from HT-Hv and MN-ASM and their complete sequences could be obtained by RACE procedure. Results suggest that distinct recognition events and defense pathways are involved in the expression of resistance in HT-Hv and MN-ASM.