Orientador: Gabriel Forato Anhê / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-27T14:26:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mesquita_CarolineCosta_D.pdf: 2692158 bytes, checksum: 5f07d43267a2e976f9b9818ec63ba452 (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: Os ritmos circadianos de ingestão alimentar se estabelecem com objetivo de manter a homeostasia de nutrientes no meio celular, frente a variações intrínsecas ao ciclo claro/escuro. Neste sentido, a gliconeogênese de roedores é suprimida no período noturno, no qual há ocorrência de um surto alimentar bifásico que compreende aproximadamente 90% de todo o aporte calórico diário. Estes eventos apresentam, entre si, uma relação causal, onde o próprio aumento dos nutrientes circulantes, principalmente a glicose, controla a gliconeogênese. O padrão inverso é observado na fase clara do ciclo claro/escuro. Recentes estudos têm demonstrado que, a ativação farmacológica de vias da Unfolded Protein Response (UPR), no sistema nervoso central, resulta em resistência à ação anorexigênica da insulina e, consequentemente, aumento da ingestão alimentar através de um mecanismo não completamente esclarecido. A UPR é uma resposta celular adaptativa que atenua a taxa de tradução de mRNAs, aumenta a proteólise e, deste modo, recupera o fenótipo celular. Esta reposta, quando ativada cronicamente, pode resultar em morte celular programada e resistência à insulina. No entanto, ainda não estava claro se a via do ATF6 da UPR tem, de fato, uma relação com o ritmo alimentar. Para responder a esse questionamento, realizamos análises da variação circadiana das proteínas envolvidas na via da UPR, imunoprecipitações com animais adrenalectomizados, e aplicação de dexametasona subcutânea. Os resultados demonstram que o ATF6 teve um aumento noturno atingindo o máximo de transição da fase clara para fase escura. A partir desse fato, foram realizados ensaios de imunuprecipitações em ratos adrenalectomizados para evidenciar as associações dos complexos CRTC2/ATF6 e CRTC2/CREB1. Contudo, nossos dados suportam a hipótese que os níveis fisiológicos de glicocorticóides podem reprimir a expressão CRH e estimular a ingestão de alimentos, através de uma via dependente de ATF6. Estes eventos, por consequência, poderão reduzir a atividade transcricional do CREB1, sobre o CRH, corroborando com os dados da literatura que apontam que os glicocorticóides endógenos dos roedores (principalmente a corticosterona) exercem um conhecido papel no controle da ingestão alimentar, decorrente principalmente da modulação da expressão do neurotransmissor anorexigênico CRH / Abstract: The circadian cycles of food intake have an important role in the homeostasis of cellular environment, acting over intrinsic changes to the sleep/wake cycle. Therefore, mice gluconeogenesis is suppressed at night where a food outbreak, responsible by 90% of all daily caloric ingestion, occurs. These events are connected by a causal relation, where the current nutrient increasing, mostly glucose, controls gluconeogenesis. The oppose pattern is verified during the light stage of the sleep/wake cycle. Recent studies have indicated that pharmacological activation of Unfolded Protein Response (UPR) pathways, at central nervous system, implies in resistance to the anorectic insulin effect, and, consequently, increase of the food intake activity trough a not fully explained engine. UPR is an adaptive cellular response that reduces mRNA¿s transcriptional rate, increases proteolysis, and therefore, restores cellular phenotype. This response, when constantly enabled, may induce cellular death and insulin resistance. However, it was not clear yet if the UPR¿s ATF6 pathway has, indeed, a connection with the feed rhythm. To answer to this question, we did several analysis of the circadian variation of the proteins connected to the UPR¿s pathway, adrenalectomized animals immunopreciptations and subcutaneous dexamethasone applications. The results demonstrated that ATF6 has a nightly increase and has reached the maximum of transcription rate from the light to the dark cycle. From this point, it was made immunopreciptations tests in adrenalectomized mice to evidence the association between CRTC2/ATF6 and CRTC2/CREB1 complexes. However, our data support the hypothesis that the physiological levels of glucocorticoids may suppress CHR expression and stimulate food intake trough an ATF6 dependent pathway. Those events, therefore, may reduce CREB1¿s transcriptional activity, confirming other studies data that indicates that endogenous mice glucocorticoids (mainly corticosterone) play an well-known role in food intake control, mainly due from modulation of the expression of the anorectic neurotransmitter CRH / Doutorado / Farmacologia / Doutora em Farmacologia

de tumorigênese em melanomas, ainda não há tratamento eficaz para melanomas metastáticos. Esta ineficácia terapêutica pode estar relacionada com a adaptação e seleção de células de melanoma à indução de estresse de RE. Ultrapassar os níveis sustentados de estresse de RE, interferindo nas vias de adaptação a este estresse, foi o alvo deste estudo na tentativa de propor uma nova estratégia terapêutica para sensibilizar células de melanoma a morte induzida por cisplatina. Mostramos que GADD153, um dos componentes da via de UPR (Unfolded Protein Response) responsável por induzir apoptose em reposta ao estresse de RE, está excluída do núcleo em melanomas primários, metástases ganglionares e viscerais. Este dado sugere que a localização citoplasmática do fator de transcrição GADD153 possa estar envolvida na resposta adaptativa de melanomas ao estresse de RE, uma vez que se sabe que GADD153 se acumula no núcleo em resposta a este estresse. Investigamos se a indução de estresse de RE seria capaz de induzir a translocação de GADD153 para o núcleo e resultar na sensibilização de células de melanoma a morte induzida por cisplatina (CDDP). Realizamos o tratamento de células de melanoma (SbCl2, Mel85, SK-MEL- 29, SK-MEL-28 e SK-MEL-147) com tunicamicina (Tuni), indutor clássico de estresse de RE, previamente ao tratamento com CDDP. Demonstramos que em todas as linhagens exceto em SK-MEL-29, houve um aumento na porcentagem de células hipodiploides (>50%) no tratamento combinado (Tuni>CDDP) comparado ao tratamento com CDDP. As células SK-MEL-147 se mostraram mais sensíveis à indução de estresse de RE e as células SK-MEL-29 mais resistentes. Algumas diferenças entre estas linhagens como a expressão de GRP78 de superfície e presença de oligossacarídeos ?1-6 ligados de superfície podem estar relacionadas com esta resposta diferencial ao estresse de RE. Em todas as linhagens verificamos a acúmulo dos marcadores de UPR, GRP78 e GADD153, após o tratamento com tunicamicina. Além disso, GADD153 foi direcionada para o núcleo em reposta ao tratamento com tunicamicina. O acúmulo de vacúolos acídicos, da proteína autofágica LC3-II e de ROS após o tratamento com Tuni>CDDP, sugerem que tanto a autofagia quanto o estresse oxidativo parecem estar envolvidos na resposta de sensibilização. A inibição de autofagia com cloroquina aumentou a morte induzida por Tuni>CDDP, sugerindo que autofagia desempenha função protetora neste esquema terapêutico. Testamos um segundo agente genotóxico, temozolomida (TMZ), uma droga equivalente à dacarbazina, e a mesma capacidade de sensibilização foi observada pelo prévio tratamento com tunicamicina. A validação deste conceito in vivo foi dificultada pela acentuada toxicidade apresentada por tunicamicina. Avaliamos alguns candidatos a agentes estressores do RE que poderiam apresentar menor toxicidade celular, como swainsonina, atorvastatina, metformina e o composto de cobre [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4. No entanto, não obtivemos resultados promissores com nenhum destes candidatos. Estes resultados mostram que as células tumorais podem ser pré-condicionadas à morte celular se expostas a um prévio estressor de RE, como Tuni, o que leva ao comprometimento da resposta adaptativa a indutores de morte celular como CDDP e TMZ. No entanto, ainda é necessário o estudo de agentes indutores de estresse de RE pouco tóxicos para que esta estratégia terapêutica possa ser utilizada em pacientes com melanoma / Melanoma is among the most aggressive malignancies with increasing worldwide incidence and there is no effective treatment for the metastatic disease. The absence of an effective therapy may be due to adaptation and selection of melanoma cells to endoplasmic reticulum (ER) stress. We showed that GADD153, one of the components of the ER stress-mediated apoptosis pathway, was mostly excluded from the nucleus of primary and metastatic melanoma cells compared to nevus cells. These data suggest that the unexpected GADD153 cellular localization could be involved in melanoma cell adaption to ER stress, since GADD153 accumulates in the nucleus during ER stress. Unfolded protein response (UPR) signaling induced in response to ER stress, is a dual process that induces a protective response to restore ER homeostasis or cell death if ER stress is severe or persistent. We investigated if induction of ER stress was a potential strategy to chemosensitize melanoma cells to a second insult by surpassing the adaptive levels to ER stress. We first treated human melanoma cells (SbCl2, SK-MEL-28, Mel85, SK-MEL-29 and SK-MEL-147) with tunicamycin (Tuni), an ER stress inducer, before cisplatin (CDDP) treatment. CDDP is a low cost chemotherapeutic drug currently used in Brazil as a second line for melanoma treatment, especially in youngsters. All cell lines, except SK-MEL-29, demonstrated an >50% increase in the percentage of hypodiploid cells with Tuni>CDDP treatment when compared to CDDP only. The same results were obtained with temozolomide (TMZ), equivalent drug to the active form of dacarbazine, the first line of cytotoxic treatment of melanomas. UPR markers, GRP78 and nuclear translocation of GADD153 were induced by Tuni. Differences between SK-MEL-29 and SK-MEL-147 as cell surface GRP78 and ?1-6 oligossacharides can be related with the differential ER stress sensitization observed in these cells. One of the cellular mechanisms that are regulated by ER stress is autophagy. Accordingly, we observed an increase in the acidic vesicular organelles and accumulation of LC3II in response to Tuni>CDDP treatment. Autophagy inhibition with chloroquine increased Tuni>CDDP induced-cell death, suggesting that autophagy plays a protective role in this response. Oxidative stress can be involved in this scenario since we demonstrated an accumulation of reactive oxygen species in response to Tuni>CDDP. Tunicamycin was cytotoxic in vivo and we investigated alternatives to this antibiotic as swainsonine, atorvastatin, metformin and [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4 but we did not observed ER stress induction. These results indicate that tumor cells could be preconditioned to cell death if exposed to a first ER stressor, such as Tuni, which would compromise an effective adaptive response to a cell death inducer, as CDDP and TMZ. This combined approach may be a promising strategy for melanoma therapy but further studies are necessary to find noncytotoxic alternatives to tunicamycin

O melanoma é o tipo de câncer de pele mais letal, apesar de ser o menos incidente. Em virtude de sua alta letalidade e de sua crescente incidência, estudos sobre melanoma são de fundamental importância nos dias de hoje. Assim como células tumorais em geral, células de melanoma apresentam características metabólicas diferenciadas, como, por exemplo, altos níveis de espécies reativas de oxigênio e alta taxa de síntese proteica. Essas modificações no metabolismo dispararam vias de resposta a estresse, como a \"Unfolded Protein Response\" (UPR), contudo, essas células se adaptam a esse estresse constante, que não culmina com a morte das mesmas. Além disso, o padrão de glicosilação em células tumorais também é sabidamente alterado, entre outros motivos, pela expressão diferencial de enzimas da via de glicosilação, como a N-acetilglicosaminiltransferase 5 (MGAT5). Relacionando essas duas características de células de melanoma, propusemo-nos a avaliar se a alta expressão de MGAT5A ( e/ou MGAT5B) funcionaria como uma resposta adaptativa de células de melanoma ao estresse de retículo endoplasmático, e seria, portanto, responsável por manter o equilíbrio diferenciado nessas células. Durante o desenvolvimento desse estudo, foi possível comprovar que a indução de estresse de retículo por meio de tratamento com tunicamicina, um inibidor da N-glicosilação e indutor clássico de UPR, sensibilizou as células de melanoma ao posterior tratamento com cisplatina. Contudo, o tratamento com swainsonina, um inibidor do processamento dos N-glicanos que ocorre no complexo de Golgi, não foi capaz nem de disparar \"Unfolded Protein Response\" nem de induzir morte nessas células e, talvez por esse motivo, não apresentou efeito sensibilizador frente à cisplatina. Além disso, foi observado que as linhagens tumorigênicas apresentam maior expressão de MGAT5A em comparação à linhagem não-tumorigênica melan-a. As tentativas de realização de silenciamento de MGAT5A não foram exitosas. Informações relacionando estresse de retículo e N-glicosilação aberrante em células tumorais ainda serão foco de estudo em nosso grupo. Com os resultados apresentados, é possível concluir que o equilíbrio diferencial dos níveis de estresse de retículo em que se encontram as linhagens tumorigênicas do nosso modelo é importante para a sobrevivência das mesmas. Além disso, é de nosso interesse avaliar a dependência de células tumorais das vias ativadas pela superexpressão de MGAT5A, caso ela realmente exista / Melanoma is the most lethal skin cancer, despite being the least prevalent. Due to its lethality and resistance to a variety of known chemotherapeutic drugs, studies on melanoma are paramount. Tumor cells in general, and melanoma cells particularly, commonly present a disturbed metabolic rate, e.g., altered metabolism of reactive oxygen species and increased rates of protein synthesis. Altogether these perturbations trigger the Unfolded Protein Response (UPR); however, tumor cells are adapted to these conditions and are able to survive. Besides, glycosylation of tumor cells is commonly altered, due to differentiated expression rates of N-glycosylation enzymes, like N-acetylglucosaminyltransferase 5 (MGAT5). Considering these information together, we proposed that the sustained overexpression of MGAT5A (and/or MGAT5B) observed in Tm1 and Tm5 melanoma cells is part of an adaptive response to reticulum stress, maintaining an unstable equilibrium in tumor cells. In this work, we observed that the induction of endoplasmic reticulum stress caused by tunicamycin treatment, a N-glycosylation inhibitor and UPR inducer, sensitized melanoma cells to further cisplatin treatment. In contrast, swainsonine treatment, an inhibitor of Golgi N-glycan processing pathway, did not cause cell death nor UPR signaling, and this may be the reason why this treatment did not sensitize cells to cisplatin treatment. MGAT5A silencing was not successful yet. Altogether, the results above show that the unstable equilibrium under which Tm1 and Tm5 tumor cells are seems necessary for their survival. Therefore, it seems that upon malignant transformation, melanoma cells present dependence of MGAT5A expression. Its our interest exploit this melanoma model to understand the concept of oncogenic dependence for MGAT5A expression in the case of melanomas, if it exists

Made available in DSpace on 2016-04-25T18:39:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Armando Cesar Oka.pdf: 906064 bytes, checksum: be230dec20e823ef7d6c3f6d173ade7b (MD5) Previous issue date: 2012-06-11 / This study, entitled Cash Flow Management by the Double Entry Bookkeeping System and Accrual Basis Accounting and conducted by Armando César Oka, aims at filling the existing gap on Cash Flow exposing the issue of its construction by applying the Double Entry Bookkeeping System and Accrual Basis Accounting under the hypothesis of a single electronic database for building Cash Flow, Balance Sheet and Income Statement for the year. It shows the accountants the Cash Flow as an object of study due to the importance given to this instrument by public and private entities as well as rescuing liquidity of the leading for profit accounting. Carrying on the academic work and the exploratory researches conducted by the researcher of this study, it exposes the reason for the application of the Double Entry Bookkeeping System and Accrual Basis Accounting to the Cash Flow and for its experiment in a legal entity, getting result by using the Cash Flow Statement. The experiment led the researcher to look for clarification, in the existing literature, regarding the results obtained in the Cash Flow Statement. It also led him to make a structural comparison to the Balance Sheet and Income Statement for the year due to the application of the Double Entry Bookkeeping System and Accrual Basis Accounting in the last two instruments. The conclusion of this study is that it is possible to apply the Double Entry Bookkeeping System and Accrual Basis Accounting in Cash Flow by getting an evidence with liquidity characteristics / Este estudo, efetuado por Armando César Oka, intitulado Fluxo de Caixa Gerencial pelo Método das Partidas Dobradas e Regime de Competência , tem como objetivo a pretensão de preencher a lacuna existente sobre o Fluxo de Caixa, expondo a questão de sua construção mediante a aplicação do Método das Partidas Dobradas e Regime de Competência, sob a hipótese de utilização de um só banco de dados eletrônico para a construção do Fluxo de Caixa, do Balanço Patrimonial e da Demonstração de Resultado do Exercício (DRE). Vem mostrar aos contadores o Fluxo de Caixa como objeto de estudo em virtude da importância dada para este instrumental pelas entidades públicas e privadas, resgatando a liquidez da preponderante contabilidade voltada ao lucro. Em continuidade ao trabalho de formação acadêmica e pesquisas exploratórias efetuadas por este pesquisador, expõe a razão da aplicação do Método das Partidas Dobradas e Regime de Competência ao Fluxo de Caixa e de seu experimento em uma entidade jurídica, obtendo o resultado mediante a Demonstração de Fluxo de Caixa. O experimento levou este pesquisador a buscar na literatura existente esclarecimentos dos resultados obtidos na Demonstração de Fluxo de Caixa e uma comparação estrutural ao Balanço Patrimonial e Demonstração do Resultado do Exercício em virtude da aplicação, nestes dois últimos instrumentais, do Método das Partidas Dobradas e Regime de Competência. A conclusão alcançada é que é possível aplicar o Método das Partidas Dobradas e Regime de Competência no Fluxo de Caixa, obtendo-se uma evidenciação com características voltadas à liquidez

Made available in DSpace on 2016-04-28T14:16:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 HCS - Orlando Corregio.pdf: 681532 bytes, checksum: b6664251cd560b9e19aa10b1562cec29 (MD5) Previous issue date: 2006-10-19 / This research shows the importance and the great contribution of Luca Pacioli to Accounting area, referring to double-entry that, as we know, makes merchant operations easiest to be controlled. In the first chapter, we present a brief historic throughout main aspects of Accounting History, that, on certain way, have relations to our work development. In the second chapter, both part A and B, we analyze part of Luca Pacioli main work and demonstrate, effectively, by our analyzes, Frei contributions which will be thefundamental parameters to Accounting until today. / Esta pesquisa demonstra a importância e a grande contribuição de Luca Pacioli para a área contábil, no que se refere às partidas dobradas, que, conforme se sabe, tornaram as operações mercantis mais fáceis de serem controladas. No primeiro capítulo faremos um breve histórico ao longo da história dos principais aspectos da Contabilidade, que de certa forma, possuem relações com o desenvolvimento de nosso trabalho. No segundo capítulo, tanto na parte A como na parte B, analisamos parte da principal obra de Luca Pacioli e demonstramos, efetivamente, por intermédio de nossas análises, as contribuições do Frei que têm sido parâmetros fundamentais para a Contabilidade até os dias de hoje.

[pt] O presente trabalho tem por objetivo estudar o comportamento crítico e pós-crítico de placas dobradas. Placas dobradas, tanto de aço quanto de concreto, têm sido usadas com grande freqüência em obras de engenharia, particularmente como paredes portantes e coberturas de grandes vãos. Neste último caso, placas dobradas têm uma aplicação semelhante a de cascas esbeltas, sendo, porém, mais simples de construir, dado que são compostas de superfícies planas. Neste trabalho utiliza-se o software ABAQUS para análise de placas dobradas compostas de duas placas formando um dado ângulo entre si. Estuda-se o uso destas placas como paredes portantes sob compressão, sendo conduzido um estudo paramétrico para determinar a influência dos diversos parâmetros geométricos e condições de contorno nas cargas críticas e modos críticos da placa dobrada. A seguir são determinados os caminhos pós-críticos e estuda-se a influência dos diversos parâmetros na rigidez pós-crítica e sensibilidade a imperfeições. Finalmente, estuda-se o comportamento não-linear destas placas sob flexão, sendo investigados os fenômenos de perda de estabilidade associados a este problema. / [en] The aim of the present work is to study the buckling and post-buckling behavior of folded plates. Folded plates, made of steel or concrete, have been widely used in engineering construction as load-bearing walls designed to carry floor and roof loads or roofs for large spaces. In the last case, folded plates work as a thin shell, being however easier to build since they are formed by flat surfaces joined along the fold lines. In this work the software ABAQUS is used to study the behavior of V-shaped folded plates. Initially it is analyzed the behavior of these plates when used as load-bearing walls under axial compression. A detailed parametric analysis is conducted to identify the influence of the geometrical parameters and boundary conditions on critical loads and modes. The influence of these parameters on the post-buckling response, post-critical stiffness and imperfection sensitivity is also investigated. Finally, the non-linear response of V-shaped folded plates under flexure is investigated and the possible instabilities under these loading conditions are analyzed.

O melanoma é o tipo de câncer de pele mais letal, apesar de ser o menos incidente. Em virtude de sua alta letalidade e de sua crescente incidência, estudos sobre melanoma são de fundamental importância nos dias de hoje. Assim como células tumorais em geral, células de melanoma apresentam características metabólicas diferenciadas, como, por exemplo, altos níveis de espécies reativas de oxigênio e alta taxa de síntese proteica. Essas modificações no metabolismo dispararam vias de resposta a estresse, como a \"Unfolded Protein Response\" (UPR), contudo, essas células se adaptam a esse estresse constante, que não culmina com a morte das mesmas. Além disso, o padrão de glicosilação em células tumorais também é sabidamente alterado, entre outros motivos, pela expressão diferencial de enzimas da via de glicosilação, como a N-acetilglicosaminiltransferase 5 (MGAT5). Relacionando essas duas características de células de melanoma, propusemo-nos a avaliar se a alta expressão de MGAT5A ( e/ou MGAT5B) funcionaria como uma resposta adaptativa de células de melanoma ao estresse de retículo endoplasmático, e seria, portanto, responsável por manter o equilíbrio diferenciado nessas células. Durante o desenvolvimento desse estudo, foi possível comprovar que a indução de estresse de retículo por meio de tratamento com tunicamicina, um inibidor da N-glicosilação e indutor clássico de UPR, sensibilizou as células de melanoma ao posterior tratamento com cisplatina. Contudo, o tratamento com swainsonina, um inibidor do processamento dos N-glicanos que ocorre no complexo de Golgi, não foi capaz nem de disparar \"Unfolded Protein Response\" nem de induzir morte nessas células e, talvez por esse motivo, não apresentou efeito sensibilizador frente à cisplatina. Além disso, foi observado que as linhagens tumorigênicas apresentam maior expressão de MGAT5A em comparação à linhagem não-tumorigênica melan-a. As tentativas de realização de silenciamento de MGAT5A não foram exitosas. Informações relacionando estresse de retículo e N-glicosilação aberrante em células tumorais ainda serão foco de estudo em nosso grupo. Com os resultados apresentados, é possível concluir que o equilíbrio diferencial dos níveis de estresse de retículo em que se encontram as linhagens tumorigênicas do nosso modelo é importante para a sobrevivência das mesmas. Além disso, é de nosso interesse avaliar a dependência de células tumorais das vias ativadas pela superexpressão de MGAT5A, caso ela realmente exista / Melanoma is the most lethal skin cancer, despite being the least prevalent. Due to its lethality and resistance to a variety of known chemotherapeutic drugs, studies on melanoma are paramount. Tumor cells in general, and melanoma cells particularly, commonly present a disturbed metabolic rate, e.g., altered metabolism of reactive oxygen species and increased rates of protein synthesis. Altogether these perturbations trigger the Unfolded Protein Response (UPR); however, tumor cells are adapted to these conditions and are able to survive. Besides, glycosylation of tumor cells is commonly altered, due to differentiated expression rates of N-glycosylation enzymes, like N-acetylglucosaminyltransferase 5 (MGAT5). Considering these information together, we proposed that the sustained overexpression of MGAT5A (and/or MGAT5B) observed in Tm1 and Tm5 melanoma cells is part of an adaptive response to reticulum stress, maintaining an unstable equilibrium in tumor cells. In this work, we observed that the induction of endoplasmic reticulum stress caused by tunicamycin treatment, a N-glycosylation inhibitor and UPR inducer, sensitized melanoma cells to further cisplatin treatment. In contrast, swainsonine treatment, an inhibitor of Golgi N-glycan processing pathway, did not cause cell death nor UPR signaling, and this may be the reason why this treatment did not sensitize cells to cisplatin treatment. MGAT5A silencing was not successful yet. Altogether, the results above show that the unstable equilibrium under which Tm1 and Tm5 tumor cells are seems necessary for their survival. Therefore, it seems that upon malignant transformation, melanoma cells present dependence of MGAT5A expression. Its our interest exploit this melanoma model to understand the concept of oncogenic dependence for MGAT5A expression in the case of melanomas, if it exists

de tumorigênese em melanomas, ainda não há tratamento eficaz para melanomas metastáticos. Esta ineficácia terapêutica pode estar relacionada com a adaptação e seleção de células de melanoma à indução de estresse de RE. Ultrapassar os níveis sustentados de estresse de RE, interferindo nas vias de adaptação a este estresse, foi o alvo deste estudo na tentativa de propor uma nova estratégia terapêutica para sensibilizar células de melanoma a morte induzida por cisplatina. Mostramos que GADD153, um dos componentes da via de UPR (Unfolded Protein Response) responsável por induzir apoptose em reposta ao estresse de RE, está excluída do núcleo em melanomas primários, metástases ganglionares e viscerais. Este dado sugere que a localização citoplasmática do fator de transcrição GADD153 possa estar envolvida na resposta adaptativa de melanomas ao estresse de RE, uma vez que se sabe que GADD153 se acumula no núcleo em resposta a este estresse. Investigamos se a indução de estresse de RE seria capaz de induzir a translocação de GADD153 para o núcleo e resultar na sensibilização de células de melanoma a morte induzida por cisplatina (CDDP). Realizamos o tratamento de células de melanoma (SbCl2, Mel85, SK-MEL- 29, SK-MEL-28 e SK-MEL-147) com tunicamicina (Tuni), indutor clássico de estresse de RE, previamente ao tratamento com CDDP. Demonstramos que em todas as linhagens exceto em SK-MEL-29, houve um aumento na porcentagem de células hipodiploides (>50%) no tratamento combinado (Tuni>CDDP) comparado ao tratamento com CDDP. As células SK-MEL-147 se mostraram mais sensíveis à indução de estresse de RE e as células SK-MEL-29 mais resistentes. Algumas diferenças entre estas linhagens como a expressão de GRP78 de superfície e presença de oligossacarídeos ?1-6 ligados de superfície podem estar relacionadas com esta resposta diferencial ao estresse de RE. Em todas as linhagens verificamos a acúmulo dos marcadores de UPR, GRP78 e GADD153, após o tratamento com tunicamicina. Além disso, GADD153 foi direcionada para o núcleo em reposta ao tratamento com tunicamicina. O acúmulo de vacúolos acídicos, da proteína autofágica LC3-II e de ROS após o tratamento com Tuni>CDDP, sugerem que tanto a autofagia quanto o estresse oxidativo parecem estar envolvidos na resposta de sensibilização. A inibição de autofagia com cloroquina aumentou a morte induzida por Tuni>CDDP, sugerindo que autofagia desempenha função protetora neste esquema terapêutico. Testamos um segundo agente genotóxico, temozolomida (TMZ), uma droga equivalente à dacarbazina, e a mesma capacidade de sensibilização foi observada pelo prévio tratamento com tunicamicina. A validação deste conceito in vivo foi dificultada pela acentuada toxicidade apresentada por tunicamicina. Avaliamos alguns candidatos a agentes estressores do RE que poderiam apresentar menor toxicidade celular, como swainsonina, atorvastatina, metformina e o composto de cobre [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4. No entanto, não obtivemos resultados promissores com nenhum destes candidatos. Estes resultados mostram que as células tumorais podem ser pré-condicionadas à morte celular se expostas a um prévio estressor de RE, como Tuni, o que leva ao comprometimento da resposta adaptativa a indutores de morte celular como CDDP e TMZ. No entanto, ainda é necessário o estudo de agentes indutores de estresse de RE pouco tóxicos para que esta estratégia terapêutica possa ser utilizada em pacientes com melanoma / Melanoma is among the most aggressive malignancies with increasing worldwide incidence and there is no effective treatment for the metastatic disease. The absence of an effective therapy may be due to adaptation and selection of melanoma cells to endoplasmic reticulum (ER) stress. We showed that GADD153, one of the components of the ER stress-mediated apoptosis pathway, was mostly excluded from the nucleus of primary and metastatic melanoma cells compared to nevus cells. These data suggest that the unexpected GADD153 cellular localization could be involved in melanoma cell adaption to ER stress, since GADD153 accumulates in the nucleus during ER stress. Unfolded protein response (UPR) signaling induced in response to ER stress, is a dual process that induces a protective response to restore ER homeostasis or cell death if ER stress is severe or persistent. We investigated if induction of ER stress was a potential strategy to chemosensitize melanoma cells to a second insult by surpassing the adaptive levels to ER stress. We first treated human melanoma cells (SbCl2, SK-MEL-28, Mel85, SK-MEL-29 and SK-MEL-147) with tunicamycin (Tuni), an ER stress inducer, before cisplatin (CDDP) treatment. CDDP is a low cost chemotherapeutic drug currently used in Brazil as a second line for melanoma treatment, especially in youngsters. All cell lines, except SK-MEL-29, demonstrated an >50% increase in the percentage of hypodiploid cells with Tuni>CDDP treatment when compared to CDDP only. The same results were obtained with temozolomide (TMZ), equivalent drug to the active form of dacarbazine, the first line of cytotoxic treatment of melanomas. UPR markers, GRP78 and nuclear translocation of GADD153 were induced by Tuni. Differences between SK-MEL-29 and SK-MEL-147 as cell surface GRP78 and ?1-6 oligossacharides can be related with the differential ER stress sensitization observed in these cells. One of the cellular mechanisms that are regulated by ER stress is autophagy. Accordingly, we observed an increase in the acidic vesicular organelles and accumulation of LC3II in response to Tuni>CDDP treatment. Autophagy inhibition with chloroquine increased Tuni>CDDP induced-cell death, suggesting that autophagy plays a protective role in this response. Oxidative stress can be involved in this scenario since we demonstrated an accumulation of reactive oxygen species in response to Tuni>CDDP. Tunicamycin was cytotoxic in vivo and we investigated alternatives to this antibiotic as swainsonine, atorvastatin, metformin and [Cu2(apyhist)2(dpam)](ClO4)4 but we did not observed ER stress induction. These results indicate that tumor cells could be preconditioned to cell death if exposed to a first ER stressor, such as Tuni, which would compromise an effective adaptive response to a cell death inducer, as CDDP and TMZ. This combined approach may be a promising strategy for melanoma therapy but further studies are necessary to find noncytotoxic alternatives to tunicamycin

Introdução: O hiperparatireoidismo primário (HP) é a terceira maior causa de doenças endocrinológicas na população, sendo a principal causa de hipercalcemia. Caracteriza-se por hipersecreção do paratormônio (PTH) pelas células principais da paratireoide, levando a um distúrbio da homeostase do cálcio (Ca). O adenoma de paratireoide é a principal causa do HP, com 80-85% dos casos, sendo o objeto deste estudo. Mutações genéticas podem corresponder a mais de 11% da origem deste tumor benígno hipersecretor. Apesar dos avanços dos métodos de diagnóstico, o tratamento é essencialmente cirúrgico, havendo carência de tratamentos alternativos eficientes, que podem ser aprimorados com maior conhecimento fisiopatológico. Como as células do adenoma são hipersecretoras de proteínas, possuem abundante quantidade de retículo endoplasmático (RE), onde as proteínas sofrem dobramento, adquirindo sua conformação nativa. Em células hipersecretoras é comum o aumento da atividade da maquinaria de tratamento protéico, gerando sinais de sobrecarga no RE e citoplasma, sendo denominado de estresse do retículo endoplasmático (ERE). O ERE e as suas vias efetoras, a UPR (resposta a proteínas não-dobradas) e o ERAD (degradação associada ao retículo endoplasmático), estão presentes na fisiopatologia de diversas doenças ou de células hipersecretoras, servindo como importante alvo terapêutico. Objetivos: Analisar a atividade do ERE nas células do adenoma de paratireoide. Casuística e Métodos: Análise da expressão dos principais genes do ERE por RealTime-PCR, em 14 pacientes portadores de adenoma de paratireoide operados no Serviço de Cirurgia de Cabeça e Pesoco do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, comparando-se a expressão do adenoma em relação ao controle (tecido normal). Resultados: Houve aumento da expressão de vários genes relacionados ao ERE, ERAD e à UPR, com significância estatística, principalmente da via de PERK (Pancreatic endoplasmic reticulum kina), do ERAD e da autofagia, evidenciando um quadro de cronicidade e eficência da maquinaria do ERE, com finalidade antiapoptótica. O resultado foi compatível com a manifestação clínica do adenoma de paratireoide, que cursa com raros casos de remissão espontânea e necrose central. Conclusão: Verificou-se que há uma atividade do ERE na fisiopatologia do adenoma de paratireoide, com efetividade na síntese e seleção protéica do PTH, trazendo longevidade às células do adenoma por meio da prevalência dos mecanismos de citoproteção, em detrimento da via da apoptose. O estudo traz importantes informações que podem ser úteis na elaboração de novos tratamentos medicamentosos, fazendo com que o ERE seja um futuro alvo terapêutico também no adenoma de paratireoide, assim como já é a realidade em outras patologias. / Background: Primary Hyperparathyroidism (PHP) is the third most common cause of endocrinologic disorders in the world, and the main cause of hypercalcemia. It is manifested by PTH (parathormone) hypersecretion by the parathyroid chief cells and consecutive calcium (Ca) homeostasis disturbance. Parathyroid adenoma (PA) is present in 80-85% of patients and, for this reason, is the aim of this study. Gene mutations is associated with at least 11% of this hypersecretory benign tumor. Even though the clinical presentation is much better than the past few decades, therapeutic options beside surgery do not advance along increasing efficiency in diagnostic tools. This is partly because there are many lacks in the pathophysiology of Pas, that would give new possibilities of medical treatment. PA is composed of hypersecretory cells and rich endoplasmic reticulum cytoplasm, where the main protein treatment and selection factors are situated. Considering that PA cells have protein hypersecretory activities, it is expected an abundant ER mass, that provides the machinery to treat and fold the great amount of nascent protein, to turn it to native form. As protein traduction increases, more energy is needed to keep ER function and this may result in the endoplasmic reticulum stress (ERE) in the cells. ERE and the downstream effectors, UPR (unfolded response protein) and ERAD (endoplasmic reticulum associated degradation), are acting in the physiology of several diseases and others hypersecretory cell types, providing important treatment targets. Objectives: To analyze ERE activity in PA cells. Casuistic and Methods: Evaluation of the main ERE genes expressed with Real Time-PCR analysis, in 14 patients with PA PHP and that were treated with conventional surgery, with further comparison between PA and control groups. Results: There were significant expression elevation of ERE, UPR and ERAD related genes, with statistical significance, specially of PERK downstream, ERAD and autophagy induction, suggesting efficient, though chronic, ERE activity level, with stimulated anti-apoptosis pathway. The final results confirmed our hypothesis that there is lower pro-apoptosis activity than expected by some authors, but this is compatible with low incidence of spontaneous remission or PA necrosis. Conclusion: There is contundent ERE activity in the PA pathophysiology, with great protein metabolism effectiveness expressed by PTH bioactivity, increasing cell longevity by stimulating cytoprotection pathways, instead of pro-apoptosis one. We believe this outcome will influence others research on this challenging and gratifying field of investigation, that will certainly provide new treatment options to PA, as ERE has been playing a significant role as therapeutic target with others hypersecretory diseases.