Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 82-94. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Les facteurs de transcription Lmx1a et Lmx1b jouent un rôle critique dans le développement embryonnaire des progéniteurs des neurones dopaminergiques du mésencéphale, mais leur fonction dans le cerveau adulte reste peu connue. Nous montrons ici que le maintien de l’expression de Lmx1a/b est requis pour la survie des neurones dopaminergiques du mésencéphale chez l’adulte suite à l’inactivation conditionnelle de Lmx1a/b dans ces neurones post-mitotiques. Nous avons découvert que Lmx1a/b contrôlent l’expression de gènes du fonctionnement mitochondrial et que leur ablation entraine un affaiblissement de l’activité de la chaine respiratoire, en une augmentation du stress oxydatif et en des dommages à l’ADN mitochondrial. L’absence postnatale de Lmx1a/b induit également l’apparition d’inclusion d’alpha-synucléine suivie d’une perte progressive des neurones dopaminergiques de la SNc et de la VTA. Ces résultats révèlent le rôle de ces facteurs de transcription dans le développement et fournissent le lien mécanistique entre l’affaiblissement des fonctions mitochondriales, l’agrégation d’alpha-synucléine et la survie des neurones dopaminergiques. Cela suggère également qu’une perturbation de la fonction de Lmx1a et Lmx1b contribuerait à la pathophysiologie de la maladie de Parkinson. / The LIM-homeodomain transcription factors Lmx1a and Lmx1b play critical roles during the embryonic development of midbrain dopaminergic progenitors, but their functions in the adult brain remain poorly understood. We show here that sustained expression of Lmx1a and Lmx1b is required for the survival of adult midbrain dopaminergic neurons. Strikingly, conditional inactivation of Lmx1a and Lmx1b in postmitotic dopaminergic neurons recreates some of the early cellular features observed in Parkinson’s disease. We found that Lmx1a/b control expression of key genes involved in mitochondrial functions and their ablation results in impaired respiratory chain activity, increased oxidative stress and mitochondrial DNA damage. Postnatal Lmx1a/b deficiency caused axonal pathology characterized by the presence of alpha-synuclein positive inclusions, followed by a progressive loss of SNpc and VTA dopaminergic neurons. These results reveal the key role of these transcription factors beyond early developmental stages and provide mechanistic links between impaired mitochondrial functions, alpha-synuclein aggregation and long-term survival of dopaminergic neurons. The results also suggest the possibility that disturbed function of Lmx1a and Lmx1b contributes to Parkinson’s disease pathophysiology.

Lmx1a et Lmx1b sont des facteurs de transcription connus pour leur rôle au cours du développement des neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA). Ils ont été montrés comme essentiels à chacune des étapes de différentiation des progéniteurs en neurones dopaminergiques matures. Des études récentes ont également mis en évidence l'importance de ces deux facteurs de transcription dans les neurones dopaminergiques chez l'adulte. Lmx1a/b sont impliqués dans la régulation de gènes mitochondriaux ainsi que dans l'autophagie. Cependant, jusqu'à présent, rien n'est connu sur le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques. Le but de cette thèse est d'élucider le rôle de Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques matures. L'analyse des projections axonales dopaminergiques de souris doubles conditionnelles mutantes (cKO) pour Lmx1a/b a mis en évidence un défaut de guidage axonal confirmant le rôle essentiel de ces deux facteurs de transcription dans la formation des circuits dopaminergiques. Afin d’identifier précisément les molécules impliquées dans la régulation du système dopaminergique des techniques adaptées doivent être développées pour déterminer les principaux acteurs régulés par Lmx1a/b. À cette fin, nous avons mis au point une technique de marquage immunohistochimique rapide de la tyrosine hydroxylase (TH, enzyme nécessaire à la synthèse de la dopamine) sur des sections de mésencéphale de souris afin de délimiter la région d’intérêt. Par la suite, nous utilisons une technique de microdissection au laser afin de spécifiquement récolter les cellules dopaminergiques du mésencéphale pour réaliser un profil d'expression génique. Un premier article de méthodologie a été publié concernant cette technique. Cette procédure menée sur des souris cKO pour Lmx1a et Lmx1b et leurs contrôles associés a permis de mettre en évidence des gènes régulés par Lmx1a et Lmx1b tels que Plxnc1. Plxnc1 est une protéine de guidage axonal ayant pour ligand la sémaphorine 7a (Sema7a). Afin d'observer si la régulation de Plxnc1 par Lmx1a/b est à l'origine du défaut de guidage axonal observé chez les souris cKO pour Lmx1a/b, nous avons réalisé une analyse in vitro de l’effet de la Sema7a sur les axones d'explants mDA. Notre étude a montré un effet chimiorépulsif de la Sema7a pour les axones des neurones mDA exprimant Plxnc1. De plus, l’étude de souris Sema7a KO montre une augmentation de l’innervation DA dans la partie dorsale du striatum, partie exprimant Sema7a chez des souris contrôles. Ce phénotype met en évidence une chimiorépulsion induite par l’interaction Sema7a/Plxnc1. L’étude de souris surexprimant Plxnc1 a, quant à elle, montré une perte d’innervation DA dans la partie dorsale du striatum. En effet, la majorité des cellules du mésencéphale se mettent à exprimer Plxnc1, les rendant ainsi sensibles à la chimiorépulsion induite par Sema7a. L’ensemble de ces résultats met en évidence l’importance de la régulation de la protéine de guidage axonal Plxnc1 par Lmx1a/b pour l'innervation des cibles du mésencéphale. La répression de Plxnc1 dans les neurones dopaminergiques de la substance noire pars compacta (SNpc) semble nécessaire à l’innervation du striatum dorsal riche en Sema7a. Cette étude est la première à identifier les bases moléculaires du guidage axonal expliquant la ségrégation des voies mDA nigrostriée et mésolimbique, et devrait contribuer à améliorer l'efficacité des thérapies cellulaires pour la maladie de Parkinson. Un second article sera soumis prochainement sur le rôle des facteurs de transcription Lmx1a/b dans les neurones dopaminergiques post-mitotiques du mésencéphale. La principale caractéristique histopathologique de la maladie de Parkinson est la dégénérescence des neurones mDA de la SNpc. La thérapie de remplacement cellulaire utilisant des neurones dopaminergiques nouvellement générés à partir de cellules souches représente une thérapie prometteuse. Cependant, la mauvaise innervation des neurones nouvellement greffés limite le succès des études de transplantation. L’identification de facteurs régulant la connectivité des neurones mDA devient primordiale pour élucider les mécanismes impliqués dans la mise en place du système dopaminergique. C'est pourquoi, dans une derniere partie, afin d'illustrer cette possibilité d'amélioration d'une thérapie de remplacement cellulaire, j’ai réalisé l’implantation de cellules souches différenciées en neurones dopaminergiques dans un modèle de souris lésées à la 6-hydroxydopamine (6OHDA). Les cellules nouvellement réimplantées sont de type SNpc, en raison de l'infection par un vecteur viral induisant l'inhibition de l'expression de Plxnc1. / Lmx1a and Lmx1b are transcription factors known for their role in the development of midbrain dopamine neurons (mDA). They were shown as essential for each stage of differentiation from progenitors to mature dopaminergic neurons. Recent studies have also highlighted the importance of these two transcription factors in dopaminergic neurons in adult mice. Lmx1a/b are involved in the regulation of mitochondrial genes and in autophagy. Although some evidence suggest that they could be involved in the formation of mDa circuit formation, their role in post-mitotic mDA neurons remains unknown. The aim of this thesis is to elucidate the role of Lmx1a/b in post-mitotic dopaminergic neurons. Analysis of dopaminergic axonal projections of double conditional mutant (cKO) mice for Lmx1a/b showed an axon guidance defect confirming the essential role of these transcription factors in the formation of dopaminergic circuits. In order to precisely identify the molecules involved in the regulation of the dopamine system, suitable techniques must be developed to identify the main genes that are regulated by Lmx1a/b. To this end we developed a new technique allowing gene profiling of brain sub-population. By combining rapid immunolabeling of mDA neurons with laser capture microdissection we manage to extract RNA from two sub-regions of mDA neurons such as ventral tegmental area (VTA) and substantia nigra pars compacta (SNpc). The advantage of this technique is to compare quickly the regulation of genes expression by studying controls and mutant mice. A first methodological article has been published regarding this procedure. We then applied this technique on cKO mice for Lmx1a/b and their associated controls to identify genes regulated by Lmx1a and Lmx1b. Among these genes, we identified Plxnc1, an axon guidance receptor for the semaphorin 7a (Sema7a). In order to verify whether the regulation of Plxnc1 by Lmx1a/b is at the origin of the axon guidance defect observed in double conditional mutant for Lmx1a/b, we have made an in vitro analysis of the effect of Sema7a on mDA explants. Our study showed a chemorepulsive effect of Sema7a on Plxnc1 positives axons. In addition, the study of knockout mice for Sema7a shows an increase of DA innervation in the dorsal part of the striatum which is the region expressing Sema7a in control mice. This phenotype reveals a chemorepulsion induced by Sema7a/Plxnc1 interaction. The study of mice overexpressing Plxnc1 shows a loss of DA innervation in the dorsal striatum. Indeed, by overexpressing Plxnc1, the majority of midbrain cells begin to express this axon guidance protein instead of only mDA neurons from the VTA. Thus, all mDA neurons including neurons from the SNpc express Plxnc1 making them sensitive to Sema7a. This interaction Sema7a/Plxnc1 leads to a chemorepulsion of axons guided away from the dorsal striatum. Overall these results highlight the importance of the regulation of the axon guidance protein Plxnc1 by Lmx1a/b for the innervation of midbrain targets. The repression of Plxnc1 expression in dopaminergic neurons of the SNpc appears necessary for the innervation of dopaminergic axons in the dorsal striatum, rich in Sema7a. This study is the first to identify the molecular basis of the development of the dopaminergic system explaining the segregation of the nigrostriatal and mesolimbic pathways. These results should help to improve the effectiveness of cell therapies for Parkinson's disease. A second article will be submitted soon about the role of Lmx1a/b transciption factors in post-mitotic midbrain dopaminergic neurons. The main histopathological feature of Parkinson's disease (PD) is the degeneration of SNpc neurons. The cell replacement therapy using newly generated dopaminergic neurons from stem cells represents a promising therapy. However, a poor innervation of the newly grafted neurons limits the success of transplantation studies. The identification of factors regulating neuronal connectivity of mDA neurons becomes essential to elucidate the mechanisms involved in the establishment of the dopaminergic system. Therefore, in a final section of this thesis, I report preliminary study about cell replacement therapy in PD mouse model. I differentiated DA neurons from stem cells, knock-down Plxnc1 expression and performed grafting in 6-hydroxydopamine (6OHDA) mouse model to illustrate the possibility of improving a cell replacement therapy.

Les neurones dopaminergiques du mésencéphale (mDA) sont impliqués dans une variété de fonctions clefs du système nerveux central, incluant le mouvement volontaire, les processus affectifs, la récompense, l’attention, la mémoire de travail et l’apprentissage. La spécification des neurones mDA, de même que l’établissement des circuits dopaminergiques, sont finement régulés au cours du développement et requièrent l’activation spatiotemporelle complexe de facteurs de transcription et de leurs gènes cibles. La dégénérescence ou une perturbation de l’activité des neurones mDA peut mener au développement de troubles neurodégénératifs ou neuropsychiatriques graves, tels la maladie de Parkinson (PD), la schizophrénie (SCZ) et les troubles du spectre obsessif compulsif (OCD). Les facteurs de transcriptions Lmx1a et Lmx1b sont des déterminants précoces de la destinée dopaminergique, essentiels à la différenciation et à la spécification des neurones mDA. Des polymorphismes de LMX1A/B ont précédemment été associés à la SCZ et aux troubles du spectre OCD. Parmi les gènes développementaux sous le contrôle transcriptionnel de Lmx1a/b, nous avons identifié deux membres de la famille Slit et Trk (Slitrk), Slitrk2 et Slitrk5, comme contrôlant la formation des synapses excitatrices et inhibitrices afférentes aux neurones mDA. Des mutations de SLITRK2 et SLITRK5 furent également associées au développement de divers désordres neuropsychiatriques. Nous présentons ici le rôle de Lmx1a/b dans la régulation de l’activité électrophysiologique des neurones mDA, par leur régulation transcriptionnelle de Slitrk2 et Slitrk5. En utilisant un modèle de culture primaire de neurones mDA, nous avons identifié un rôle de Slitrk2 et de Slitrk5 dans la régulation postsynaptique de la synaptogénèse excitatrice et inhibitrice, respectivement. La perturbation de l’activité électrique des neurones mDA résultant de la perte ou du gain de fonction de Slitrk2/5 pourrait possiblement résulter en une perturbation de la libération de la dopamine aux noyaux cibles des neurones mDA, menant ainsi au développement de comportements pathologiques associés aux troubles neuropsychiatriques humains. / Mesodiencephalic dopaminergic (mDA) neurons regulate key functions of the mammalian central nervous system, including voluntary movement, affection, reward, attention, working memory and learning. The specification of mDA neurons and dopaminergic circuitry’s establishment are finely regulated during development and require specific and complex spatial and temporal activation of transcription factors and target genes. The degeneration of mDA pathways or their dysfunction can lead to severe neurodegenerative or neuropsychiatric disorders, including Parkinson’s disease (PD), schizophrenia (SCZ) and obsessive-compulsive disorder (OCD). Lmx1a and Lmx1b transcription factors are early determinants of the dopaminergic fate, essential to mDA neurons differentiation and specification. Polymorphisms of LMX1A/B were previously linked to SCZ and OCD. Within the transcriptional targets of Lmx1a/b, we identified to members of the Slit and Trk (Slitrk) family, Slitrk2 and Slitrk5, controlling excitatory and inhibitory afferent synapses formation of mDA neurons. Mutations of SLITRK2 and SLITRK5 were also previously linked to various neuropsychiatric diseases. We here present the role of Lmx1a/b in the regulation of the electrophysiological activity of mDA neurons, by their transcriptional regulation of Slitrk2 and Slitrk5. Using a mDA neurons’ primary cell culture paradigm, we identified a role of Slitrk2 and Slitrk5 in the post-synaptic regulation of excitatory and inhibitory synaptogenesis, respectively. The perturbation of mDA neurons’ electrophysiological activity, resulting from Slitrk2/5 loss or gain of function could lead to an alteration in dopamine release to mDA neurons target nuclei, and thus to the development of pathological behaviours associated with human neuropsychiatric diseases.

Les récepteurs nucléaires orphelins Nurrl et Nur77 sont des facteurs de transcription qui remplissent des fonctions différentes au sein des systèmes dopaminergiques adultes. Cela dit, ils sont tous deux impliqués dans les réponses comportementales imputables à ces systèmes. L'objectif de l'étude était de déterminer la possibilité d'une interaction fonctionnelle entre les deux récepteurs en comparant différentes souches de souris transgéniques. Nous avons observé que la suppression du gène Nur77 et la réduction partielle de Nurrl mènent à l'expression d'un phénotype particulier chez les animaux Double Knockout (Nurrl (+/-); Nur77 (-/-))dans divers protocoles expérimentaux évaluant l' activité locomotrice en conditions basales ou sous l' influence d' agents pharmacologiques. Nous avons également mesuré les niveaux d'expression de certaines neuropeptides, l' enképhaline et la dynorphine, qui sont également modulés différemment chez les animaux Double Knockout dans un contexte de stimulation et de blocage des récepteurs dopaminergiques. Nos résultats suggèrent qu'une interaction fonctionnelle et dépendante du contexte entre Nurrl et Nur77 existe.

La dépression majeure est un trouble de l'humeur très courant, qui se caractérise particulièrement par une humeur triste et une anhédonie. C'est une des causes majeures d'incapacité chez l'homme. L'exposition prolongée à un environnement stressant entraine la mise en place de stratégies d'adaptation. L'anhédonie est associée à une altération du système dopaminergique pouvant expliquer la survenue d'une dépression induite par le stress. Ceci est corroboré par une réduction de la complexité dendritique au niveau des projections dopaminergiques au sein de la voie mésocorticale, chez des souris susceptibles au stress chronique de la défaite sociale. Ces modifications affectent l'activité cellulaire et synaptique via une altération de la translation locale. Celle-ci consiste à acheminer des ARNm au niveau des dendrites et des axones, afin de produire localement les protéines nécessaires au bon fonctionnement de la cellule ou d'adapter les besoins protéiques suite au stress induit à long-terme. Cette recherche s'intéresse à ce mécanisme afin de comprendre comment il est affecté au sein des neurones dopaminergiques constituant la voie mésocorticolimbique chez des souris soumises à un stress chronique de défaite sociale. Les données transcriptomiques des neurones dopaminergiques mettent en lumière des gènes différentiellement exprimés de manière spécifique au sexe, au phénotype et à la région neuronale. Parmi ceux-ci, les gènes qui induisent des changements morpho-fonctionnels sont particulièrement intéressants. L'objectif de cette recherche est de définir le rôle de ces gènes dans le contrôle de la plasticité synaptique de manière spécifique et de révéler leur contribution à l'expression du phénotype, soit susceptible soit résilient au stress social. En conclusion, le paradigme de la défaite sociale induit des phénotypes distincts, comme les tests comportementaux l'attestent. Les analyses bio-informatiques doivent être approfondies afin de pouvoir déterminer avec précision les gènes d'intérêts chez la souris pour *in fine* moduler l'expression de ces gènes cibles *in vivo* et *in vitro*. / Major depression is a very common mood disorder, particularly characterized by sad mood and anhedonia. It is one of the major causes of disability in humans. Prolonged exposure to a stressful environment leads to the implementation of coping strategies. Anhedonia is associated with an alteration of the dopaminergic system which may explain the occurrence of stress-induced depression. This is corroborated by a reduction in dendritic complexity at the level of dopaminergic projections within the mesocortical pathway, in mice susceptible to chronic stress of social defeat. These modifications affect cellular and synaptic activity through an alteration of local translation. This consists of transporting mRNAs within dendrites and axons, to locally produce the proteins necessary for the proper functioning of the cell or to adapt protein needs following the induction of long-term stress. This research focuses its interest on this mechanism in order to understand how it is affected within the dopaminergic neurons forming the mesocorticolimbic pathway in mice subjected to chronic stress of social defeat. Transcriptomic data from dopamine neurons highlight genes differentially expressed in a sex-, phenotype-, and neuronal region-specific manner. Among these, we are particularly interested in those which induce morpho-functional changes. The goal of this research is to define the role of these genes in the control of synaptic plasticity in a specific manner and to reveal their contribution to the expression of the phenotype, either susceptible or resilient to social stress. In conclusion, the social defeat paradigm induces distinct phenotypes, as demonstrated by behavioral assessments. Bioinformatics analyzes must be in-depth in order to be able to precisely determine the genes of interest in mice and ultimately modulate the expression of these target genes both *in vivo* and *in vitro*.

Les neurones dopaminergiques (DA) du mésencéphale sont la principale source de dopamine dans le cerveau. Les neurones moyens épineux (MSN) du striatum reçoivent la majorité de la dopamine. Cette dopamine se lie à des récepteurs DAergiques qui existent principalement sous deux formes : ceux de type D1 (DrD1) ou de type D2 (DrD2). En se liant à DrD1 ou DrD2, la dopamine exerce des effets opposés, respectivement excitateurs ou inhibiteurs. De précédentes études de traçage neuronal ont fait état d'une innervation différentielle à travers le cerveau des MSN du striatum dorsal (DSt) pour l'un et l'autre type de récepteur DA. Nous **prévoyons** que les MSN du noyau accumbens (NAc) du striatum ventral (VSt) ont également une innervation différentielle pour chaque type de récepteur DA. Par ailleurs, les neurones DA du mésencéphale ne sont pas homogènes et possèdent des profils génétiques et projections axonales distincts. L'identification de nouveaux sous-types de neurones DA nous mène à émettre **l'hypothèse** que certains d'entre eux cibleraient spécifiquement les MSN DrD1+ ou DrD2+. Nous avons développé une **approche** de marquage neuronal utilisant des vecteurs viraux trans-synaptiques afin de visualiser les sous-circuits ciblant les récepteurs DA du NAc. Pour marquer les neurones ciblant DrD1 ou DrD2, nous utilisons des souris transgéniques qui expriment les recombinases Cre et Flippase (Flp) dans les neurones DrD1 et DrD2 respectivement. À l'aide d'AAV dépendants de Cre ou de Flip, nous forçons l'entrée d'un second vecteur viral rabique (RabV) exprimant des protéines fluorescentes. Cette approche nous permet de marquer sélectivement les neurones établissant des synapses avec les MSN du NAc exprimant DrD1 ou DrD2. Afin de caractériser les sous-types de neurones DA ciblant les MSN DrD1+ ou DrD2+, nous utilisons des techniques de marquage immunohistochimique spécifiques aux différents sous-types de neurones DA. Nos résultats suggèrent qu'il existe des régions du cerveau ciblant de manière préférentielle les MSN exprimant DrD1 ou DrD2 dans le NAc. D'autre part nous nous sommes retrouvés confrontés à une toxicité accrue des neurones DA du mésencéphale marqués par le vecteur RabV. Cette toxicité de RabV a grandement altéré l'identification de sous-types DA marqués et ne nous permet pas de tirer de conclusions satisfaisantes En **conclusion**, la réalisation de ce projet sert de base à l'établissement d'une cartographie des sous-circuits dopaminergiques du NAc. Notre modèle pourrait être appliqué à des études fonctionnelles et à d'autres régions cérébrales afin de mieux caractériser des sous-circuits du cerveau qui demeurent encore inconnus. / The midbrain dopaminergic (DA) neurons are the main source of dopamine in the brain. The medium spiny neurons (MSNs) of the striatum receive most of the dopamine. This dopamine binds to DA receptors, which mainly exist in two forms: type D1 (DrD1) and type D2 (DrD2). By binding to DrD1 or DrD2, dopamine exerts opposite effects, respectively, excitatory, or inhibitory. Previous neuronal tracing studies have reported differential innervation across the brain of dorsal striatum (DSt) for each type of MSN DA receptor. We **hypothesize** that the MSNs of the nucleus accumbens (NAc) in the ventral striatum (VSt) also have a differential innervation for each type of DA receptor. Moreover, midbrain DA neurons are not homogeneous and have distinct genetic profiles and axonal projections. The identification of new DA neuron subtypes leads us to **hypothesize** that some of them specifically target DrD1+ or DrD2+ MSNs. We have developed a neuronal tracing **approach** using trans-synaptic viral vectors to visualize the brain sub-circuits targeting specific DA receptors in the NAc. To label the neurons targeting those expressing DrD1 or DrD2, we used transgenic mice whose MSNs express Cre recombinase (DrD1) and Flip recombinase (DrD2). Using Cre- or Flip-dependent AAV vectors, we induce the entry of a rabies (RabV) viral vector expressing fluorescent proteins. This approach allows us to selectively label neurons that form synapses with NAc MSNs expressing DrD1 or DrD2. To characterize the subtypes of DA neurons targeting DrD1+ or DrD2+ MSNs, we use immunohistochemical techniques using antibodies to specifically mark the different subtypes of DA neurons. Our results suggest that there are regions across the brain that preferentially form synapses with MSNs expressing DrD1 or DrD2 in the NAc. On the other hand, we encountered increased toxicity in midbrain DA neurons labeled by the RabV vector. This RabV toxicity significantly impaired the identification of labeled DA subtypes and does not allow us to draw satisfactory conclusions. In **conclusion**, this project serves as a basis for establishing a mapping of the dopaminergic sub-circuits of the NAc. Our model could be applied to functional studies and to other brain regions to better characterize brain sub-circuits that remains unknown.

Les neurones dopaminergiques mésodiencephaliques jouent un rôle central dans la régulation d'un large éventail de fonctions cérébrales allant des mouvements volontaires aux comportements associés. Ces fonctions sont régulées par des sous-types distincts de neurones dopaminergiques situés à la base du cerveau soit l'air tegmentaire ventrale et la substance noire compacte. Ces neurones innervent différentes régions du cerveau en formant les voies nigrostriatales, mésolimbiques et mésocorticales. Les mécanismes moléculaires qui régissent la formation de voies dopaminergiques dans le cerveau sont en grande partie inconnus. L'autophagie est la principale voie de renouvellement cytoplasmatique et s'est révélée importante pour le développement du système nerveux. Nous montrons ici que les protéines nécessaires à l'autophagie sont présentes dans les cônes de croissance des neurones dopaminergiques et qu'elles sont régulées temporellement pendant leur développement. En outre, le niveau d'autophagie change de façon dynamique dans les neurones dopaminergiques en réponse à des signaux de guidage chimio-répulsifs et chimio-attractifs. Pour caractériser le rôle de l'autophagie dans la croissance / guidage des axones dopaminergiques, nous avons utilisé la méthode d'édition du génome CRISPR-Cas9 ainsi qu'une souris knock-out conditionnelle (cKO) pour les gènes essentiels de l'autophagie (Atg12, Atg5) spécifiquement dans les neurones dopaminergiques. Les axones ATG5 cKO présentent des renflements axonaux et une diminution du nombre de ramifications in vitro et in vivo, probablement en raison de la formation de boucles de microtubules aberrantes. De manière frappante, la suppression de gènes liés à l'autophagie a complètement bloqué la réponse des neurones dopaminergiques aux signaux de guidage chimio-répulsifs et chimio-attractifs. Nos données démontrent que l'autophagie joue un rôle central dans la régulation du développement des neurones dopaminergiques et dans l'amélioration de notre compréhension des processus physiologiques régissant la croissance et le guidage axonal. / Mesodiencephalic dopamine neurons play a central role in the regulation of a wide range of brain functions ranging from voluntary movement to reward associated behaviours. These functions are regulated by distinct subtypes of dopamine neurons located in the ventral midbrain substantia nigra pars compacta and ventral tegmental area that project to different brain regions by forming the nigrostriatal, mesolimbic, and mesocortical pathways. The molecular mechanisms that drive the midbrain dopaminergic trajectory formation are largely unknown. Autophagy is the major cytoplasmatic turnover pathway and has been shown to be important to neural system development. Here we show that autophagy machinery is present in the growth cones of dopaminergic neurons and is temporally regulated during their growth and guidance. Furthermore, autophagy level changes dynamically in dopaminergic neurons in response to both chemo-repulsive and chemo-attractive guidance cues. To characterize the role of autophagy in dopaminergic axon growth/guidance, we used CRISPR-Cas9 gene editing as well as a conditional knock-out mice (cKO) for the essential autophagy genes (Atg12, Atg5) deleted in dopaminergic neurons. ATG5 cKO axons exhibit axonal swellings and decreased branching in vitro and in vivo, likely due to aberrant microtubule looping. Strikingly, deletion of autophagy-related genes blunted completely the response of dopaminergic neurons to chemo-repulsive and chemo-attractive guidance cues. Our data demonstrate that autophagy plays a central role to tightly regulate dopaminergic neurons development and improve our understanding about basic physiological processes orchestrating axonal growth and guidance.

Le facteur de transcription Nurrl est un récepteur nucléaire orphelin hautement impliqué dans le développement du système dopaminergique. Son expression persistante à l'âge adulte soulève toutefois de nombreuses questions quant à son rôle exact dans le cerveau mature. L'objectif de cette étude était d'évaluer les effets d'une diminution partielle du facteur de transcription Nurrl sur la transmission dopaminergique chez des souris adultes. Nous avons d'abord observé qu'une réduction partielle de Nurrl n'influence pas le comportement locomoteur des souris en conditions basales. Par contre, l'administration aiguë d'amphétamine chez les souris Nurrl (+/-) induit une brève augmentation de l'activité locomotrice précédant l'apparition marquée de mouvements verticaux et stéréotypés. La modulation de différents marqueurs tels que Nurrl, Nur77, Nor-1 et l'ENK fut également étudiée. De façon générale, nos résultats démontrent des modifications plus ou moins importantes de l'expression de ce neuropeptide et de ces récepteurs nucléaires en présence ou non du psychostimulant. Enfin, l'ensemble de ces résultats suggèrent qu'une réduction partielle de Nurrl induit des changements importants dans la transmission dopaminergique

La libération dopaminergique permet de transmettre des signaux importants sur la motivation et le contrôle moteur. Le transporteur de dopamine DAT est un acteur important de ce phénomène et implique dans sa régulation Rit2, une GTPase liée à plusieurs pathologies comme la maladie de Parkinson et la schizophrénie. La dopamine est également impliquée dans l'apprentissage par renforcement et la signalisation de stimulus appétitifs et aversifs. Nous avons mesuré, dans des modèles de surexpression et de répression génique de Rit2 dans les neurones dopaminergiques, la quantité de DAT, l'activité électrique, la signalisation dopaminergique et l'effet sur le comportement. Nous avons également observé la libération dopaminergique chez des animaux dans un paradigme de conditionnement classique avec un senseur de dopamine et la photométrie à fibre. La surexpression de RIT2 dans les neurones dopaminergiques a mené à une diminution de DAT et des neurones plus actifs et synchronisés présentant une amplitude de libération dopaminergique réduite. La répression génique de Rit2 a mené à une augmentation des niveaux de DAT et une réduction de la durée du signal dopaminergique. Finalement, la modification de l'expression de Rit2 a eu un impact sur un comportement d'apprentissage. Nos résultats montrent également une libération dopaminergique suivant la récompense dans toutes les cibles étudiées, mais une réponse hétérogène à la punition. En particulier, les cibles présentant une réponse à la punition plus grande ou égale à celle de la récompense encodaient moins l'attente de la récompense. Nos données indiquent que la modification de l'expression de Rit2 a un impact sur la signalisation dopaminergique, possiblement à travers une modification de la disponibilité de DAT. De plus, on observe que les cibles présentant une plus grande réponse à la récompense présentent une signalisation similaire à la théorie de l'erreur de prédiction de la récompense, à la différence des autres cibles étudiées. / Dopamine release allows for transmission of important signals linked to motivation and motor control. The dopamine transporter DAT is an important player in this signaling and involves in its regulation Rit2, a GTPase linked to disorders such as Parkinson's disease and schizophrenia. Dopamine is also implicated in reinforcement learning and signaling of appetitive and aversive stimuli. Here, we measured, in models of overexpression and knock-down of Rit2, the amount of DAT, the electrical activity, the dopaminergic signaling dynamics and the effect on behavior of the modification of the expression of Rit2. We also measured dopamine release with a dopamine sensor and fiber photometry in animals trained on a classical conditioning paradigm. Overexpression of Rit2 led to a reduction of DAT, and the reverse was observed in the knock-down condition. Neurons overexpressing Rit2 were more active and synchronized and showed a reduction in the amplitude of dopamine release. Knock-down of Rit2 led to a shorter dopamine signal following optogenetic stimulation. Finally, modification of the expression of Rit2 impacted learning behavior. Our results showed dopamine release following reward in all our investigated targets, but a diversity of responses to punishment in those same targets. Targets showing bigger or equal response to punishment when comparing to reward showed less encoding of reward expectation, contrary to the ones signaling more reward, who showed a stronger encoding of reward expectation. Our data show that modifying the expression of Rit2 impacts dynamics of dopamine signaling, possibly through the modification of the amount of DAT. Moreover, we observed that the targets showing a bigger response to reward presented a signaling in line with the reward prediction error, contrary to the other targets.