Les estrogènes exercent une modulation des fonctions cérébrales, du développement au vieillissement. Nous avons d'abord étudié l'implication des récepteurs estrogéniques ERa et ERB dans l'effet de l'estradiol au cerveau dans un modèle de rattes ovariectomisées. Nous avons choisi l'approche des agonistes spécifiques des récepteurs estrogéniques. Au niveau du système dopaminergique, sur le récepteur D2 et sur le transporteur DAT, nous avons montré que ERP est le récepteur impliqué dans l'augmentation de la densité de ces marqueurs induite par l'estradiol au striatum. Au niveau du DAT, nous avons montré que le tamoxifène et le raloxifène reproduisait l'effet de l'estradiol chez des rattes ovariectomisées à long terme. Nous avons ensuite rapporté que sur le système glutamatergique, notamment sur les récepteurs ionotropiques NMDA et AMPA, ERa est le récepteur impliqué dans la diminution de la densité de AMPA et des niveaux d'ARNm de (ïluR2 au niveau du cortex, striatum et noyau accumbens. Sur NMDA, ERa est impliqué dans l'augmentation de la densité du récepteur ainsi que des niveaux d'ARNm de la sous-unité NMDAR2B induite par l'estradiol dans la sous région CA1 hippocampique. Cependant au niveau du cortex, il semble que ni ERa ni ERB ne soit impliqué dans la diminution de la densité de NMDA induite par l'estradiol. Nous avons par la suite observé que chez des rattes ovariectomisées à long ternie, ce modèle reproduisant la ménopause, l'estradiol induit une modulation de la densité et du couplage du récepteur 5-111',A au raphé, similaire à celui de certains antidépresseurs. Au niveau du cortex, l'estradiol ne module pas la densité mais le couplage du récepteur 5-HT1A. Les SERM tamoxifène et raloxifène n'ont pas reproduit l'effet de l'estradiol sur ce récepteur. A l'hippocampe l'estradiol induit des effets plus discrets. Enfin nous avons observé que l'estradiol augmente les niveaux d'ARNm de la préproenképhaline (PPE) au striatum et au noyau accumbens via ERa et ERB. Le tamoxifène et le raloxifène induisent eux aussi une augmentation des niveaux de PPE. Nous avons donc soulevé un coin du voile sur l'effet mécanistique de l'estradiol au cerveau via des effets génomiques ou non génomiques, médiés par Ella, ERB ou autre. D'autres études complémentaires permettront de compléter ces travaux.

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique. / Tardive dyskinesia (TD) is a potentially disabling and irreversible motor complication including all persistent, abnormal, involuntary movements, classicaly caused by the chronic therapy with typical antipsychotic drugs (haloperidol, fluphenazine). Atypical antipsychotic drugs like clozapine have been introduced because they showed little potential to induce TD, raising the hope to completely eradicate this complication. However, it has been later shown that these drugs have several serious metabolic side- effects and that some atypical molecules are as responsible as typical drugs for inducing TD. Besides, the typical drugs are still widely prescribed in a large spectrum of disorders. For all these reasons, TD still constitutes a major challenge for psychotic disorders treatments especially that the pathophysiology of TD remains elusive and therapeutics are difficult. Based on rodent experiments, it was proposed that dopamine D2 receptor hypersensitivity could be responsible for TD. However, this hypothesis lacks strong support in humans. We suggest, in this thesis, that TD is associated with the hypersensitivity of other receptors, than D2. To investigate the neurochemical basis of TD, we chronically exposed 23 adult capuchin monkeys to haloperidol (median 18.5 months, N=11) or clozapine (median 6 months, N=6). Six unmedicated animals were used as controls. Five haloperidol-treated animals developed mild TD movements, and no TD was observed in the clozapine group. Using receptor autoradiography, we measured dopamine D1, D2, D3 and mGluR5 receptor levels. We also examined the D3 receptor/preprotachykinin mRNA co-expression, and quantified enkephalin and Nur77 mRNA levels, in striatal sections. Unlike clozapine, haloperidol strongly induced dopamine D3 receptor binding sites in the anterior striatum, particularly in TD animals, and binding levels positively correlated with TD intensity. In contrast, D2 receptor binding was comparable to controls, and dopamine D1 receptor binding reduced in the anterior (haloperidol and clozapine) and posterior (clozapine) putamen. Preprotachykinin mRNA-labeled cell count was unaffected by either haloperidol or clozapine, enkephalin mRNA widely increased in all animals, but to a greater extent in TD-free animals. Nur77 mRNA levels in the caudate-putamen were strongly up regulated iv in animals exposed to haloperidol but were spared following clozapine treatment. Interestingly, within the haloperidol-treated group, TD-free animals showed higher Nur77 expression in putamen sub territories compared with dyskinetic animals. These results corroborate our hypersensitivity hypothesis, and indicate that an imbalance between the striatal pathways could contribute to the pathophysiology of TD.

La caractéristique neuropathologique majeure de la maladie de Parkinson (MP) est la perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire (SN). Nous avons examiné si un dysfonctionnement aigu des EAATs pourrait contribuer au cercle vicieux entretenant la progression des pertes DA. Les effets du PDC, un inhibiteur substrat des EAATs, ont été analysés chez le rat. L'analyse cinétique (4-120 jours) des effets d'une seule injection intranigrale de PDC montre une perte progressive spécifique des neurones DA, avec une évolution unilatérale vers bilatérale et caudo-rostrale. Le processus dégénératif associe déplétion en glutathion et augmentation de l'activité de la γ-glutamyltranspeptidase, stress oxydatif, processus excitotoxiques, autophagie et réactivités gliales. L'antioxydant N-acétylcystéine et les antagonistes des récepteurs NMDA ifenprodil et mémantine exercent un effet neuroprotecteur. Des effets compensatoires transitoires au niveau de marqueurs de la fonction DA dans la SN et le striatum accompagnent la perte cellulaire et des dystrophies axonales. Des troubles moteurs apparaissent de façon tardive lorsque la perte neuronale ipsilatérale avoisine les 50%. Ces résultats montrent un lien fonctionnel entre dysfonctionnement des EAATs et plusieurs mécanismes pathogéniques ainsi que des caractéristiques neuropathologiques majeures de la MP, et fournissent le premier modèle progressif de la maladie induit de façon aiguë. / Parkinson's disease (PD) is characterized by the progressive degeneration of substantia nigra (SN) dopaminergic neurons. Central players in PD pathogenesis, including mitochondrial dysfunction and oxidative stress, might affect the function of excitatory amino acid transporters (EAATs). Here, we investigated whether acute EAATs dysfunction might in turn contribute to the vicious cycles sustaining the progression of dopamine neuron degeneration. PDC application on nigral slices triggered sustained glutamate-mediated excitation selectively in dopamine neurons. In vivo time-course study (4-120 days) revealed that a single intranigral PDC injection triggers progressive degeneration of exclusively dopamine neurons with unilateral to bilateral and caudorostral evolution. This degenerative process associates GSH depletion and specific increase in γ-glutamyltranspeptidase activity, oxidative stress, excitotoxicity, autophagy and glial reaction. The anti-oxidant N-acetylcysteine and the NMDA receptor antagonists ifenprodil and memantine provided significant neuroprotection Transient compensatory changes in dopamine function markers in SN and striatum accompanied cell loss and axonal dystrophy. Motor abnormalities (hypolocomotion and forelimb akinesia) showed late onset, when ipsilateral neuronal loss exceeded 50%. These findings outline a functional link between EAATs dysfunction and several PD pathogenic mechanisms and pathological hallmarks, and provide the first acutely-triggered rodent model of progressive parkinsonism.

A travers ce projet de recherche nous avons exploré différents aspects d’une dérégulation du système dopaminergique sur les troubles du repos, en prenant pour exemple deux maladies neurologiques : la maladie de Willis-Ekbom (MWE) et la maladie de Parkinson (MP). La MWE est une maladie neurologique sensorimotrice caractérisée par des douleurs dans les membres inférieurs, s’accompagnant d’un besoin irrépressible de bouger et ce, suivant un profil circadien. Ainsi, le premier volet de ces travaux s’est appliqué à reproduire chez le macaque, les principales altérations du métabolisme du fer et de celui de la dopamine reportées dans la MWE. Tout d’abord, nous avons établit les bases physiologiques des variations circadiennes des concentrations du fer et de ses biomarqueurs au niveau central et périphérique. Puis, nous avons développé un protocole simple, uniquement basé sur des prélèvements sanguins répétés, permettant d’induire efficacement une déplétion en fer sérique et de ses protéines associées. Finalement, ce protocole nous a permis d’explorer les liens entre l’altération de l’homéostasie du fer au niveau du système nerveux central, les perturbations neurochimiques dans différentes structures cérébrales ainsi que les modifications locomotrices qui en résultent. Le second volet de cette thèse a testé l’impact des agonistes des récepteurs dopaminergiques de type D1 (SKF38393) et D2 (quinpirole), sur les troubles du sommeil dans un modèle macaque de la MP, à l’aide d’enregistrements polysomnographiques. Pour cela, nous avons évalué les effets de ces agents pharmacologiques sur l’émergence de la somnolence diurne et sur l’altération du sommeil paradoxal, induits par une intoxication au MPTP. Nos résultats mettent en évidence que le quinpirole est inefficace pour restaurer les niveaux de base de ces deux paramètres. En revanche, le SKF38393 permet une diminution notable de la somnolence diurne ainsi qu’une restauration du sommeil paradoxal. Finalement, les perturbations monoaminergiques liées à la déplétion en fer ouvrent de multiples perspectives de recherche sur la physiopathologie de la MWE. De même, l’amélioration des troubles veille-sommeil par l’agoniste des récepteurs D1, offre de nouvelles pistes thérapeutiques quant à la prise en charge des troubles du repos dans la MP. L’ensemble de nos résultats apporte un niveau de compréhension supplémentaire quant au rôle de la dopamine dans les altérations du repos. / During this thesis project we explored several aspects of the impact of a dopaminergic system dysregulation on the rest alterations, through two neurological diseases: the Willis-Ekbom’s disease (WED) and Parkinson’s diseases (PD). The WED is a neurological sensorimotor disorder mainly characterized by pain in lower limbs. It preferentially appears in the evening and transiently and partially is alleviated by motor activity. Thus, the first part of this work aimed at reproducing the main dysfunctions of the iron and dopaminergic metabolisms observed in WED, in the macaque monkey. We first established the circadian variations of iron-indicator concentrations in serum and cerebrospinal fluid. Then we developed a rapid protocol based on repeated blood withdrawals, allowing to efficiently induce serum iron depletion. Finally, this protocol enabled us to investigate the relationship between iron metabolism dysfunctions, neurochemical alterations and the subsequent locomotor behavioural changes. In the second part, of this research project we examined the impact of selective D1 (SKF38393) and D2 (quinpirole) receptor agonists on the sleep impairments in a macaque model of PD using the polysomnographic recording technique. Thus we investigated the effects of these two pharmacological compounds on the daytime sleepiness and on the paradoxical sleep induced by MPTP intoxication. Our results demonstrated the inefficacy of quinpirole to restore these two altered sleep parameters. By contrast, SKF38393 significantly decreased daytime napping and substantially restored paradoxical sleep. Finally, the monoaminergic dysregulations, induced by iron depletion, may offer multiple perspectives to unravel the WED pathophysiology. In the same line, the beneficial effects exhibited by the D1 receptor agonist bring new therapeutic avenues to treat sleep-wake disorders in PD. Together, the global results bring new insights in the underlying mechanisms of sleep impairment involving dopamine.

Le gène split end (spen) est impliqué dans de nombreuses voies de signalisation et processus biologiques. Durant ma thèse j'ai étudié le rôle de spen dans la mort cellulaire au cours du développement de la rétine de la Drosophile. L'œil de Drosophile est composé de centaines d'unités appelées ommatidies. Chaque ommatidie est composée de huit photorécepteurs entourés de cellules accessoires comprenant quatre cellules cônes et deux cellules pigmentaires primaires, ainsi que douze cellules interommatidiales. Les cellules interommatidiales adoptent une structure hexagonale parfaitement régulière. Des cellules interommatidiales en excès doivent être éliminées par apoptose au cours du développement. J'ai montré que la modulation de spen modifiait radicalement le patron des cellules interommatidiales. L'inactivation de spen conduit à un défaut de cellules interommatidiales alors que sa surexpression entraîne un excès de ces cellules. Ces résultats témoignent d’un rôle anti-apoptotique de spen. Nous avons aussi montré que la perte des cellules interommatidiales dans un contexte mutant pour spen pouvait être entièrement sauvée en exprimant la protéine p35 connue pour bloquer l'activité des caspases. Comme spen est exprimé de manière ubiquitaire, nous avons cherché à déterminer dans quelles cellules spen jouait son rôle de régulateur de la mort cellulaire. Grâce à une analyse clonale, nous avons pu montrer que c'est au niveau des cellules cônes que spen agit. L'inactivation de spen dans les autres cellules accessoires de l'œil n'influence pas la mort des cellules interommatidiales. Nous avons en outre, montré que spen avait un rôle dans la formation des soies de chaque ommatidie. Ces travaux mettent en évidence un rôle de spen dans le contrôle de la mort cellulaire des cellules interommatidiales dans les cellules cônes. Nos résultats montrent, par ailleurs, que spen serait requis pour le relarguage du facteur de survie Spitz (le ligand activateur de la voie EGF) à partir des cellules cônes. En parallèle, nous avons étudiés le rôle de survie de spen dans un modèle neurodégénératif. Nous avons montré que spen était nécessaire dans les cellules gliales pour la résistance au stress oxydatif. De manière intéressante, nous avons trouvé que l'inactivation de spen dans la glie diminuait l'activité de la voie de signalisation NOTCH. Cette résistance pourrait se faire via la modulation de gènes antioxydants. De manière générale, nos travaux démontrent un rôle du gène split ends dans la survie cellulaire. Ce facteur agit de manière non-autonome à partir des cellules supports de différents organes. / In metazoan, the successful development of many organs requires the elimination of supernumerary cells by apoptosis. For example, the elimination of about two thousand interommatidial cells (IOCs) during Drosophila eye development allows the precise rearrangement of ommatidia in a perfect hexagonal array. Maximal apoptosis occurs during pupal life and the remaining IOCs differentiate into secondary and tertiary pigment cells. The precise removal of unwanted IOCs requires coordinated activation of Notch (pro-death) and EGF (pro-survival) pathways. IOCs undergoing apoptosis express the IAP inhibitor Hid, which leads to the activation of initiator and effector caspases. However, the mechanisms that coordinate the death and survival pathways for timed and precise IOC removal are poorly understood.Here, we report that spen encodes a nuclear protein expressed in the pupal eye that is required for IOC survival. We showed that the inhibition of spen, by either RNAi or in spen mutant clones resulted in disorganized ommatidia with missing IOCs. Moreover, overexpression of spen leads to extra IOCs. These results indicate that spen expression promotes IOC survival during eye development. Importantly blocking apoptosis prevents the loss of IOC in a spen mutant retina. Spen is a protein known to be ubiquitous in tissue during development. Indeed, we have shown using an enhancer trap line that spen is expressed in all the cells in the eye pupal disk. To better understand where spen is acting from in this tissue to regulate cell death, we performed a clonal analysis. We found that the inactivation of spen in the cone cells was causing the loss of IOC, indicating that spen is required non-autonomously in cone cell for IOC survival. In parallel we have shown that the inactivation of spen was disrupting eye bristles morphology. Even if studies discuss the role of bristles in the regulation of developmental apoptosis in this context, our clonal analysis excluded this possibility. Furthermore, we found that spitz, the EGFR ligand, accumulate in cone cells upon spen inactivation. Our current hypothesis is that spen is likely to be required for the release of Spitz from the cone cells in order to active the survival signaling pathway EGFR in the IOCs. Also, we examined the protective role of spen in a chemical model of Parkinson disease (paraquat treatment). We showed that the glial expression of spen is protective in this context, which suggest against that spen acts non-autonomously. Interestingly we found that the inactivation of spen in glia downregulates the Notch signaling pathway. Spen is likely to be a key factor integrating cues from different signaling pathways to promote cell survival.

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont pluripotentes et ont donc le potentiel de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, ainsi qu'en cellules de la lignée germinale. Ces propriétés en font un modèle pour l'étude des mécanismes de prolifération et de différenciation. Le facteur de transcription Lmx1b est impliqué dans la maintenance du phénotype différencié des neurones dopaminergiques mésencéphaliques. Et il a aussi été montré comme un facteur clef dans la différenciation et la maintenance des neurones sérotoninergiques du rhombencéphale générés dans les noyaux du Raphé. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux capacités de Lmx1b d'influencer la différenciation des cellules ES de souris en neurones sérotoninergiques. La première stratégie adoptée a résulté en une expression ectopique stable de Lmx1b dans les cellules ES et leurs dérivés. Le niveau d'expression de Lmx1b a fortement influencé les capacités de différenciation neuronale des cellules. Puis, l'analyse de marqueurs de différenciation spécifiques a montré une augmentation de l'expression des marqueurs sérotoninergiques, au contraire des marqueurs dopaminergiques ou de neurones moteur. La seconde stratégie a consisté en une surexpression inductible de Lmx1b dans les précurseurs neuraux dérivés de cellules ES pour mimer l'expression physiologique de Lmx1b. Après induction, Lmx1b était bien exprimé dans les cellules durant toutes les étapes de différenciation neuronale. L'activation de l'expression de Lmx1b au stade des colonies neuroépithéliales a aussi résulté en une amélioration de la différenciation sérotoninergique. Les résultats de ce travail soulignent les capacités de Lmx1b à diriger la différenciation des précurseurs neuraux dérivés de cellules ES vers la voie sérotoninergique in vitro.

Les dyskinésies tardives (DT) sont des troubles moteurs associés à l’utilisation chronique des antagonistes des récepteurs dopaminergiques D2 tels que les antipsychotiques et le métoclopramide. Ces dyskinésies correspondent à une incoordination motrice portant préférentiellement sur la musculature oro-faciale. La gestion des DT s'est imposée comme défi de santé publique surtout en l’absence d’une alternative thérapeutique efficace et abordable. L’hypothèse classiquement avancée pour expliquer la physiopathologie des DT inhérente au traitement par les antipsychotiques s’articule autour de l’hypersensibilité des récepteurs dopaminergiques D2, cibles principales de ces molécules. Néanmoins, plusieurs données remettent la véracité de cette hypothèse en question. Hypothèse: nous proposons que le blocage chronique des récepteurs dopaminergiques soit effectivement responsable d’un phénomène d’hypersensibilisation mais contrairement à l’hypothèse classique, cette hypersensibilisation porterait sur des paramètres de la transmission dopaminergique autres que les récepteurs D2. De même nous postulons que cette hypersensibilisation se traduirait par des altérations des cascades signalétiques au niveau des cellules du striatum. Ces altérations aboutissent à des changements portant sur le récepteur nucléaire (Nur77), qui est hautement associé au système dopaminergique; l’induction de ces récepteurs déclencherait des cascades associées à la compensation ou à la genèse des DT. Matériels et méthodes: 23 femelles Cebus apella, réparties en 3 groupes: groupe halopéridol, groupe clozapine, et groupe contrôle, ont été exposées aux traitements respectifs pendant 6-36 mois. Après l’analyse comportementale, les animaux ont été décapités et leurs cerveaux isolés pour fin d’analyse. Hybridation in situ: nous avons fait appel à cette technique pour mesurer l’expression de l’ARNm de Nur77 et du neuropeptide enképhaline. Hybridation in situ double: nous avons exploités cette technique pour identifier les populations neuronales exprimant les récepteurs dopaminergiques D3 et localiser leur éventuelle induction. Autoradiographies des récepteurs dopaminergiques D1, D2 et D3 et autoradiographies des récepteurs i glutamatergiques mGluR5. Ces autoradiographies avaient pour objectif d’évaluer l’expression de ces différents récepteurs. Mutagenèse dirigée et transfection cellulaire: nous faisons appel à ces techniques pour reproduire le polymorphisme identifié au niveau de la région 3’UTR de l’ARNm Nur77 et évaluer l’impact que pourrait avoir ce polymorphisme sur la stabilité de l’ARNm Nur77 sinon sur l’expression de la protèine Nur77. Western Blot des kinases ERK 1 et 2: cette technique nous a servi comme moyen pour quantifier l’expression globale de ces kinases. Analyses statistiques: l’expression de l’ARNm Nur77 a été évaluée en utilisant l’analyse de la variance à un seul facteur (One way ANOVA). Nous avons procédé de la même façon pour mesurer l’expression des récepteurs D2, D3 et mGluR5. Résultats: le groupe des animaux traités par l’halopéridol montre une plus forte expression des récepteurs D3 par rapport aux sujets des autres groupes. Cette expression se produit au niveau des neurones de la voie directe. De plus, cette augmentation corrèle positivement avec la sévérité des DT. L’expression des récepteurs D2 et mGluR5 reste relativement inchangée entre les différents groupes, alors qu’un gradient d’expression a été observé pour le récepteur D1. Par ailleurs, Nur77 est induit par l’halopéridol, alors que son expression semble baisser chez les animaux traités par la clozapine. L’induction de l’expression de Nur77 par l’halopéridol est plus accrue chez les animaux non dyskinétiques. Les animaux traités par la clozapine démontrent une expression amoindrie de l’ARNm de Nur77 qui tend à être plus faible que l’expression de base. D’autre part, la présence du polymorphisme au niveau de la région 3’UTR semble affecter l’expression cellulaire de Nur77. Conclusion: ces résultats confortent notre hypothèse concernant l’existence d’un phénomène d’hypersensibilisation prenant place suite un traitement chronique par les antipsychotiques. Ce phénomène s’est traduit par une augmentation de l’expression des récepteurs D3 sans porter sur les récepteurs D2 tel que prôné classiquement. Cette hypersensibilisation des récepteurs D3 implique également l’existence d’un débalancement des voies striatales pouvant ainsi sous tendre l’apparition des DT. Ces résultats dévoilent ainsi un nouveau mécanisme qui pourrait contribuer à l’apparition des DT et pourraient permettre une meilleure gestion, nous l’espérons, des DT à l’échelle clinique. / Tardive dyskinesia (TD) is a potentially disabling and irreversible motor complication including all persistent, abnormal, involuntary movements, classicaly caused by the chronic therapy with typical antipsychotic drugs (haloperidol, fluphenazine). Atypical antipsychotic drugs like clozapine have been introduced because they showed little potential to induce TD, raising the hope to completely eradicate this complication. However, it has been later shown that these drugs have several serious metabolic side- effects and that some atypical molecules are as responsible as typical drugs for inducing TD. Besides, the typical drugs are still widely prescribed in a large spectrum of disorders. For all these reasons, TD still constitutes a major challenge for psychotic disorders treatments especially that the pathophysiology of TD remains elusive and therapeutics are difficult. Based on rodent experiments, it was proposed that dopamine D2 receptor hypersensitivity could be responsible for TD. However, this hypothesis lacks strong support in humans. We suggest, in this thesis, that TD is associated with the hypersensitivity of other receptors, than D2. To investigate the neurochemical basis of TD, we chronically exposed 23 adult capuchin monkeys to haloperidol (median 18.5 months, N=11) or clozapine (median 6 months, N=6). Six unmedicated animals were used as controls. Five haloperidol-treated animals developed mild TD movements, and no TD was observed in the clozapine group. Using receptor autoradiography, we measured dopamine D1, D2, D3 and mGluR5 receptor levels. We also examined the D3 receptor/preprotachykinin mRNA co-expression, and quantified enkephalin and Nur77 mRNA levels, in striatal sections. Unlike clozapine, haloperidol strongly induced dopamine D3 receptor binding sites in the anterior striatum, particularly in TD animals, and binding levels positively correlated with TD intensity. In contrast, D2 receptor binding was comparable to controls, and dopamine D1 receptor binding reduced in the anterior (haloperidol and clozapine) and posterior (clozapine) putamen. Preprotachykinin mRNA-labeled cell count was unaffected by either haloperidol or clozapine, enkephalin mRNA widely increased in all animals, but to a greater extent in TD-free animals. Nur77 mRNA levels in the caudate-putamen were strongly up regulated iv in animals exposed to haloperidol but were spared following clozapine treatment. Interestingly, within the haloperidol-treated group, TD-free animals showed higher Nur77 expression in putamen sub territories compared with dyskinetic animals. These results corroborate our hypersensitivity hypothesis, and indicate that an imbalance between the striatal pathways could contribute to the pathophysiology of TD.

Les neurones dopaminergiques (DAergiques) libèrent non seulement de la DA à partir de leurs terminaisons axonales, mais également dans le mésencéphale au niveau de la substance noire (SN) et l’aire tegmentaire ventrale (ATV). À cet endroit, un mécanisme de libération somatodendritique (STD) de DA a été proposé et impliquerait des senseurs calciques différents de ceux retrouvés du côté axonal. Au niveau axonal, la synaptotagmine 1 (Syt1) est une protéine essentielle à la libération rapide de DA. Toutefois, des études de notre laboratoire sur des knockout conditionnels (cKO) de Syt1 dans les neurones DA démontrent une diminution substantielle de la libération de DA au niveau axonal, mais aussi dans le mésencéphale. Une première hypothèse expliquant cette diminution dans le mésencéphale serait que Syt1 est impliquée dans la libération STD. Cependant, nous observons par microscopie à super-résolution que Syt1 ne se retrouve pas dans le compartiment STD des neurones DAergiques. Une autre possibilité serait la présence de collatérales axonales DAergiques dans le mésencéphale. Par imagerie confocale et électronique, nous observons que le mésencéphale contient plusieurs varicosités axonales asynaptiques et quelques varicosités axonales synaptiques. Enfin, nous avons évalué la plasticité des collatérales axonales DAergiques dans un modèle de lésion partielle des neurones DAergiques induite par la 6-OHDA. Malgré la perte de plus de 40% des neurones DA, la libération de DA dans la SN persiste 14 jours après lésion et s’accompagne d’une augmentation de l’expression axonale de Syt1, suggérant qu’un mécanisme de compensation axonale contribue à la résilience de la libération de DA. / Dopaminergic (DA) neurons not only exhibit a classic vesicular release from their axons in the striatum, but they also release DA in the midbrain in the substantia nigra (SN) and ventral tegmental area (VTA). In this region, somatodendritic (STD) release occurs and it requires different calcium sensors than those found in the axons. Of interest, synaptotagmin 1 (Syt1) has been shown to be implicated in fast DA release in the axons. However, recent research in our lab shows that in mice with conditional knockout (cKO) of Syt1 in DA neurons, there is a substantial decrease of DA release not only in the striatum, but also in the midbrain. Our first hypothesis is that Syt1 is directly involved in STD release. With super-resolution microscopy, we concluded that Syt1 is not localized in the STD compartment of DA neurons. This brings us to our second hypothesis, where local DA axon collaterals contribute to DA release in the midbrain. Through confocal and electron microscopy, we observed that the midbrain contains asynaptic varicosities as well as local DA synapses. In light of these results, we explored the contribution of axonal release to the resilience of SN DA release in a partial 6-OHDA lesion model. We observed that, following a loss of more than 40% of DA neurons, DA release in the SNc persists 14 days after lesion and that this is accompanied by an increase in Syt1 expression in DA axons which suggest that local axonal release is increased to compensate for DA loss.

Les cellules souches embryonnaires (cellules ES) sont pluripotentes et ont donc le potentiel de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, ainsi qu’en cellules de la lignée germinale. Ces propriétés en font un modèle pour l’étude des mécanismes de prolifération et de différenciation. Le facteur de transcription Lmx1b est impliqué dans la maintenance du phénotype différencié des neurones dopaminergiques mésencéphaliques. Et il a aussi été montré comme un facteur clef dans la différenciation et la maintenance des neurones sérotoninergiques du rhombencéphale générés dans les noyaux du Raphé. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux capacités de Lmx1b d’influencer la différenciation des cellules ES de souris en neurones sérotoninergiques. La première stratégie adoptée a résulté en une expression ectopique stable de Lmx1b dans les cellules ES et leurs dérivés. Le niveau d’expression de Lmx1b a fortement influencé les capacités de différenciation neuronale des cellules. Puis, l’analyse de marqueurs de différenciation spécifiques a montré une augmentation de l’expression des marqueurs sérotoninergiques, au contraire des marqueurs dopaminergiques ou de neurones moteur. La seconde stratégie a consisté en une surexpression inductible de Lmx1b dans les précurseurs neuraux dérivés de cellules ES pour mimer l’expression physiologique de Lmx1b. Après induction, Lmx1b était bien exprimé dans les cellules durant toutes les étapes de différenciation neuronale. L’activation de l’expression de Lmx1b au stade des colonies neuroépithéliales a aussi résulté en une amélioration de la différenciation sérotoninergique. Les résultats de ce travail soulignent les capacités de Lmx1b à diriger la différenciation des précurseurs neuraux dérivés de cellules ES vers la voie sérotoninergique in vitro. / Pluripotent Embryonic Stem Cells (ESC) have the potential to develop into cells of the three germ layers and of the germ line. Therefore, they are used as a model to study the proliferation and differentiation mechanisms. The LIM homeodomain transcription factor Lmx1b is involved in the maintenance of the differentiated phenotype of midbrain dopaminergic neurons. And it has been also demonstrated to be a key factor in differentiation and maintenance of hindbrain serotonergic neurons generated in the Raphe Nuclei. Here, we explored the capacity of Lmx1b to direct differentiation of mouse ESC (mESC) into serotonergic neurons. In the first approach, stable ectopic expression of Lmx1b was achieved. First, the level of Lmx1b expression was found to strongly influence the capacity of mESC to accomplish neuronal differentiation. Then, analysis of lineage-specific differentiation markers showed an increase in serotonergic markers’ expression by contrast to dopaminergic or motor neurons markers. In the second approach, Lmx1b was over-expressed in mESC-derived neural precursors by an inducible system in order to mimic the physiological onset of Lmx1b expression. After induction, Lmx1b was found to be stably expressed throughout neuronal differentiation. Activation of Lmx1b expression in neuroepithelial colonies resulted in enhancement of serotonergic differentiation, consistently with the stable system results. The results of this work highlight the capacity of Lmx1b to promote the shift of mESC-derived neural precursors toward a serotonergic fate in vitro.

Les neurones dopaminergiques (DA) de l’aire tegmentale ventrale (VTA) sont influencés par différents stimuli comme des récompenses naturelles et d’autres stimuli moins physiologiques tels que les drogues d’abus. Ces drogues agissent en détournant les mécanismes d’apprentissage qui sous-tendent normalement la motivation pour des renforçateurs naturels. Les neurones DA, en conditions physiologiques, sont subtilement régulés par une balance entre tonus GABA et glutamatergique. Ils sont soumis à de multiples sources inhibitrices dont le noyau accumbens, les interneurones locaux ou les neurones GABA de la queue de la VTA (tVTA). Le glutamate est également important dans leur modulation. Il contrôle leur activité en bursts, qui est le mode de décharge le plus efficace pour libérer de la dopamine et coder des informations associées à la récompense. Il permet des adaptations synaptiques à long terme qui se sont révélées importantes dans la prise de drogue. La connaissance des facteurs endogènes qui contrôlent l’excitabilité des cellules DA de la VTA est essentielle à la compréhension des processus physiologiques (recherche de plaisir…) mais aussi pathologiques (addiction…). L’objectif de mon travail a été de comprendre les circuits de régulation des neurones DA en conditions physiologiques et lors de l’exposition à la morphine. Dans un premier temps, nous avons étudié les mécanismes de régulation des neurones DA par la formation hippocampique ventrale incluant le subiculum ventral et l’aire CA1 ventrale (vSUB/CA1). Grâce à l’utilisation d’approches d’électrophysiologie in vivo chez le rat anesthésié, nous avons montré que le vSUB/CA1 exerce un contrôle excitateur glutamatergique des neurones DA. Nous avons mis en évidence que cette voie vSUB/CA1-VTA est polysynaptique, faisant intervenir le BNST comme relais. J’ai aussi pu confirmer le rôle fonctionnel de la tVTA en tant que nouvelle structure GABA modulant l’activité des neurones DA, renforçant ainsi l’idée d’une balance entre tonus GABA et glutamatergique régulant les neurones DA in vivo.La deuxième partie de ma thèse a consisté en l’étude des circuits neuronaux à l’origine des effets excitateurs de la morphine sur les neurones DA de la VTA in vivo. L’hypothèse actuelle est que la morphine excite les neurones DA par un mécanisme de désinhibition en inhibant les neurones GABA de la VTA. Grâce à l’utilisation d’approches multiples, nous avons proposé un nouveau circuit expliquant les effets de la morphine. Ces effets sont la conséquence d’une modification de la balance GABA/glutamate par la morphine. Elle se traduit par une diminution du tonus GABA et d’une augmentation du tonus glutamatergique. Enfin, nous avons pu démontrer qu’une seule exposition à la cocaïne augmente l’activité de base des neurones DA. Chez ces animaux, les effets excitateurs de la morphine sont potentialisés confirmant ainsi l’hypothèse que l’amplitude de l’activation des neurones DA par la morphine dépend de leur état d’excitabilité. / Dopaminergic (DA) neurons of the ventral tegmental area (VTA) are influenced by several stimuli such as natural rewards or drugs of abuse. Drugs shunt learning mechanisms which underlie motivation for natural reinforcers. Under physiological conditions, DA neurons are regulated by a balance between GABA and glutamatergic inputs. They receive several inhibitory inputs especially from the nucleus accumbens, VTA local interneurons and GABA neurons of the tail of the VTA (tVTA). Glutamate is also important in modulating DA neuron activity. It controls their bursting activity which is the most efficient way to release dopamine and to encode reward-associated informations. It allows long term synaptic adaptations important for addiction. Knowing how these endogenous factors control VTA DA neuron excitability is essential to understand physiological (search for pleasure…) and pathological (drug addiction…) processes.In the first part of my thesis, we studied the regulation of the VTA by the hippocampal formation including the ventral subiculum and the ventral CA1 area (vSUB/CA1). Using electrophysiological approaches in anesthetized animal, we showed that the vSUB/CA1 controls VTA DA neurons and that this input is glutamatergic. We also demonstrated that the vSUB/CA1-VTA pathway is polysynaptic implicating the BNST as a relay. I also confirmed the inhibitory control of the VTA by tVTA, new GABA input to DA neurons. Thus, in vivo, DA neurons are regulated by a balance between GABA and glutamatergic inputs. The second part of my research consisted in studying the neuronal circuits underlying excitatory effects of morphine on VTA DA neurons in vivo. The actual hypothesis is that morphine excites DA neurons by a disinhibition mechanism inhibiting VTA GABA neurons. Using several approaches (electrophysiological approaches in anesthetized animal, tract-tracing methods), we proposed a new circuitry explaining morphine effects. These excitatory effects result from a modification of the balance between GABA and glutamatergic inputs with a decrease of the GABA tone and an increase of the glutamatergic tone. Finally, we demonstrated that an acute cocaine exposure increases DA neuron activity. In animals exposed to cocaine, morphine excitatory effects are potentiated. This last experiment confirms the hypothesis that the amplitude of morphine-induced activation of VTA DA neurons depends on their excitability state.