Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'homéostasie glutamatergique dans les fentes synaptiques régule la neurotransmission et préserve de l'excitotoxicité. Cela est particulièrement important dans l'oreille interne où il y a une libération soutenue de neurotransmetteur. Pour la plupart des cellules ciliées cochléaires et vestibulaires, la clairance du glutamate est assurée par les transporteurs du glutamate EAAT1 (GLAST) exprimés par les cellules de soutien. Un tel mécanisme n'est pas possible pour les cellules ciliées vestibulaires de type I car leur terminaison synaptique en calice empêche tout accès à la fente synaptique. Nous avons donc postulé qu'un ou plusieurs transporteurs du glutamate devaient être présents au niveau des cellules ciliées de type I ou du calice ou des deux.Grâce à des enregistrements électrophysiologiques, nous avons démontré qu'un courant anionique induit par le glutamate et bloqué par le DL-TBOA est présent dans les cellules ciliées de type I. Les techniques d'hybridation in situ et d'immunohistochimie ont révélé la présence d'EAAT4 et EAAT5. Ces deux transporteurs du glutamate, qui pourraient êtres à l'origine des courants enregistrés, sont exprimés par les cellules ciliées de type I et de type II. De plus, des expériences de RT-PCR et de microscopie électronique ont confirmé ces résultats et suggéré que ces transporteurs pourraient aussi être exprimés postsynaptiquement par le calice. Ces travaux de thèse montrent qu'EAAT4 et EAAT5, considérés respectivement comme spécifiques des tissus cérébelleux et rétiniens, ont une distribution plus large. Ces résultats posent la question des rôles potentiels de ces transporteurs dans l'homéostasie glutamatergique vestibulaire. / Glutamate homeostasis in synaptic clefts shape neurotransmission and prevent excitotoxicity. This may be particularly important in the inner ear where there is a continually high rate of neurotransmitter release. In the case of most cochlear and vestibular hair cells, clearance involves the diffusion of glutamate to supporting cells, where it is taken up by EAAT1 (GLAST), a glial glutamate transporter. A similar mechanism is unlikely to work in vestibular type I hair cells because the presence of calyx endings separates supporting cells from the synaptic zone. Based on this arrangement, we postulated that a glutamate transporter must be present in the type I hair cell, the calyx ending, or both. Using whole-cell patch-clamp recordings, we demonstrated that a glutamate-activated anion current blocked by DL-TBOA is expressed in type I hair cells. In situ hybridization and immunohistochemistry revealed that EAAT4 and EAAT5, two glutamate transporters that could support the anion current, are expressed in both type I and type II hair cells. Furthermore, RT-PCR and immunogold investigations confirmed those results and added that although preferentially expressed presynaptically, the transporters may also be present in the postsynaptic calyx membrane. Previously thought to be exclusively expressed in the cerebellum and retina respectively, this thesis work shows that EAAT4 and EAAT5 have a wider distribution. The potential role of these transporters in the glutamatergic homeostasis of the calyx synapse is then discussed.

Nos travaux ont porté sur la mise au point de synthèse de nouveaux dérivés β-substitués β-hydroxy aspartates : Inhibiteurs du transport du glutamate dans le système nerveux centrale (SNC). Ces analogues d'aspartates ont été caractérisés par différentes méthodes spectroscopiques (RMN-1H, RMN-13C et HRMS) et leur pureté énantiomérique a été confirmée par analyses HPLC chirale et des mesures de pouvoir rotatoire. Ce manuscrit est organisé en trois chapitres : la première partie présente un point bibliographique sur le système glutamatergique dans le SNC, en rappelant les différents récepteurs et transporteurs du glutamate dans ce système ainsi leurs agonistes et antagonistes spécifiques.Puis, nous avons décrit un aperçu sur les différentes synthèses de dérivés aspartates β-substitués et leurs activités inhibitrices vers les transporteurs du Glu dans le SNC.Afin d'avoir une grande diversité dans la structure les dérivés β-substitués β-hydroxy aspartates et réduire le temps de préparation et le nombre d'étapes de synthèse, nous avons développé dans la troisième partie de ce manuscrit deux stratégies originales et récentes pour préparer des dérivés -substitués -hydroxy aspartates via une aminohydroxylation asymétrique de Sharpless, qui est considérée comme l'étape clé dans cette synthèse.Enfin, Les résultats préliminaires de tests biologiques sur les dérivés β-substitués β-hydroxy aspartates protégés montrent que ces composés ne présentent aucune toxicité vers les cellules nerveuses de l'hippocampe de rat. L'étude de la cytotoxicité et l'activité inhibitrice de dérivés β-substitués β-hydroxy aspartates totalement déprotégés vis à vis du transport du glutamate dans le SNC sont actuellement en cours. / Our work focused on the development of synthesis of originals β-substituted β-hydroxy aspartates derivatives: Inhibitors of glutamate transport in the central nervous system (CNS).These analogs of aspartate have been characterized by various spectroscopic methods (1H-NMR, 13C-NMR and HRMS) and their enantiomeric purity was confirmed by chiral HPLC analysis and D measurement.This manuscript is organized into three chapters: the first part presents a bibliographical point of the glutamatergic system in CNS, recalling the different receptors and glutamate transporters in this system and their specific agonists and antagonists.Then, we described an overview of the various syntheses of β-substituted aspartates derivatives and their inhibitory activities toward glutamate transporters in CNS.In order, to have a great diversity in the structure of β-substituted β-hydroxy aspartates derivatives and reduce preparation time and the number of synthetic steps, we have developed in the third part of this manuscript two recent and original strategies for prepare β-substituted β-hydroxy aspartates derivatives via asymmetric aminohydroxylation Sharpless, who is considered the key step in this synthesis. Finally, preliminary results of biological tests on optically pure aspartates derivatives showed no toxicity to nerve cells of the rat hippocampus. The study of the inhibitory activity of these derivatives towards transport of glutamate in CNS is currently underway.

Les astrocytes participent activement au fonctionnement cérébral. Ils réalisent des échanges métaboliques et trophiques avec les neurones et exercent un contrôle sur l'entrée des substrats énergétiques dans le parenchyme cérébral. Ils sont aussi res ponsables -par le biais de leurs transporteurs GLAST et GLT-1- de la recapture et du recyclage du glutamate, le principal neurotransmetteur excitateur qui a aussi un potentiel neurotoxique. Les astrocytes répondent à des situations pathologiques variées en devenant réactifs. Ils apparaissent hypertrophiques et surexpriment certaines protéines comme les filaments intermédiaires. Bien que cette modification du phénotype astrocytaire soit connue depuis longtemps, ses conséquences fonctionnelles sont toujours débattues. S'agit-il d'un mécanisme de protection et d'adaptation à des conditions pathologiques ou, au contraire, d'un processus délétère participant à la dégénérescence neuronale ? Nous avons développé un modèle in vivo d'activation astrocytaire en utilisant un lentivirus (lenti-CNTF) pour induire une surexpression dans le striatum de rat du Ciliary Neurotrophic Factor (CNTF), un activateur endogène des astrocytes. Grâce à ce modèle d'activation stable et reproductible des astrocytes, nous avons pu mettre en évidence des modifications profondes du métabolisme énergétique cérébral avec une augmentation de l'utilisation des corps cétoniques au dépend du glucose. Par ailleurs, l'activation astrocytaire par le CNTF induit de nombreux changements dans la machinerie de recapture du glutamate. Les transporteurs astrocytaires sont hyperglycosylés et sont enrichis dans les microdomaines membranaires rafts. En conditions excitotoxiques, la gestion du glutamate, l'apport énergétique et la survie neuronale sont significativement améliorés dans le groupe lenti-CNTF. Ces résultats soulignent le rôle bénéfique des astrocytes activés qui présentent un phénotype et un fonctionnement favorables à la survie des neurones. Cette étude permet à la fois de mieux cerner le rôle et l'intérêt de la réponse astrocytaire dans les processus pathologiques et également de caractériser les effets du CNTF , qui est un candidat thérapeutique pour différentes maladies neurodégénératives.

Le glutamate est le principal neurotransmetteur excitateur du système nerveux central des vertébrés, et le codage de l’information cérébrale repose en partie sur des modulations de l’amplitude et de la fréquence des transmissions synaptiques glutamatergiques. De ce fait, la résolution spatiale et temporelle de ces transmissions nécessite un contrôle fin de la présence de glutamate dans la fente synaptique. Cette durée de vie du glutamate dans les synapses dépend directement de l’action de transporteurs spécifiques exprimés à la surface des astrocytes, en particulier les transporteurs de type GLT-1, qui retirent le neurotransmetteur et permettent ainsi de « nettoyer » la fente synaptique avant la survenue d’un nouvel épisode de neurotransmission. / A classic understanding of neurotransmitter clearance at glutamatergic synapses is that, in order to ensure sufficient glutamate uptake on a fast timescale, it is necessary to have high numbers of glutamate transporters in the vicinity of release sites to compensate for their slow transport kinetics. Using a combination of single molecule imaging and electrophysiological approaches, we now challenge this view by first demonstrating that GLT-1 transporters are not static but highly mobile at the surface of astrocytes, and that their surface diffusion is dependent upon both neuronal and glial cell activities. In the vicinity of glutamate synapses, GLT-1 dynamics are strongly reduced favoring their retention within this strategic location. Remarkably, glutamate uncaging at synaptic sites instantaneously increases GLT-1 diffusion, displacing the glutamate-bound transporter away from this compartment. Functionally, impairment of the transporter lateral diffusion through an antibody-based surface cross linking, both in vitro and in vivo, significantly slows the kinetics of excitatory postsynaptic currents. Taken together, these data reveal the unexpected and major role of the astrocytic surface GLT-1 fast dynamics in shaping glutamatergic synaptic transmission.Keywords:

La caractéristique neuropathologique majeure de la maladie de Parkinson (MP) est la perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) de la substance noire (SN). Nous avons examiné si un dysfonctionnement aigu des EAATs pourrait contribuer au cercle vicieux entretenant la progression des pertes DA. Les effets du PDC, un inhibiteur substrat des EAATs, ont été analysés chez le rat. L'analyse cinétique (4-120 jours) des effets d'une seule injection intranigrale de PDC montre une perte progressive spécifique des neurones DA, avec une évolution unilatérale vers bilatérale et caudo-rostrale. Le processus dégénératif associe déplétion en glutathion et augmentation de l'activité de la γ-glutamyltranspeptidase, stress oxydatif, processus excitotoxiques, autophagie et réactivités gliales. L'antioxydant N-acétylcystéine et les antagonistes des récepteurs NMDA ifenprodil et mémantine exercent un effet neuroprotecteur. Des effets compensatoires transitoires au niveau de marqueurs de la fonction DA dans la SN et le striatum accompagnent la perte cellulaire et des dystrophies axonales. Des troubles moteurs apparaissent de façon tardive lorsque la perte neuronale ipsilatérale avoisine les 50%. Ces résultats montrent un lien fonctionnel entre dysfonctionnement des EAATs et plusieurs mécanismes pathogéniques ainsi que des caractéristiques neuropathologiques majeures de la MP, et fournissent le premier modèle progressif de la maladie induit de façon aiguë. / Parkinson's disease (PD) is characterized by the progressive degeneration of substantia nigra (SN) dopaminergic neurons. Central players in PD pathogenesis, including mitochondrial dysfunction and oxidative stress, might affect the function of excitatory amino acid transporters (EAATs). Here, we investigated whether acute EAATs dysfunction might in turn contribute to the vicious cycles sustaining the progression of dopamine neuron degeneration. PDC application on nigral slices triggered sustained glutamate-mediated excitation selectively in dopamine neurons. In vivo time-course study (4-120 days) revealed that a single intranigral PDC injection triggers progressive degeneration of exclusively dopamine neurons with unilateral to bilateral and caudorostral evolution. This degenerative process associates GSH depletion and specific increase in γ-glutamyltranspeptidase activity, oxidative stress, excitotoxicity, autophagy and glial reaction. The anti-oxidant N-acetylcysteine and the NMDA receptor antagonists ifenprodil and memantine provided significant neuroprotection Transient compensatory changes in dopamine function markers in SN and striatum accompanied cell loss and axonal dystrophy. Motor abnormalities (hypolocomotion and forelimb akinesia) showed late onset, when ipsilateral neuronal loss exceeded 50%. These findings outline a functional link between EAATs dysfunction and several PD pathogenic mechanisms and pathological hallmarks, and provide the first acutely-triggered rodent model of progressive parkinsonism.

L’excitotoxicité est un mécanisme physiopathologique majeur impliqué dans la pathogenèse de la déficience en thiamine (DT). Dans les régions cérébrales vulnérables à la DT, on observe une mort cellulaire induite par excitotoxicité dont l’origine semble être la conséquence d’une perturbation du métabolisme énergétique mitochondrial, d’une dépolarisation membranaire soutenue et d’une diminution de l’absorption du glutamate par les astrocytes suite à la diminution de l’expression des transporteurs EAAT1 et EAAT2. Il est clairement établi que le glutamate joue un rôle central dans l’excitotoxicité lors de la DT. Ainsi, la mise en évidence des mécanismes impliqués dans la diminution de l’expression des transporteurs du glutamate est essentielle à la compréhension de la physiopathologie de la DT. L’objectif de cette thèse consiste en l’étude de la régulation des transporteurs astrocytaires du glutamate et la mise au point de stratégies thérapeutiques ciblant la pathogenèse de l’excitotoxicité lors de l’encéphalopathie consécutive à la DT. Les principaux résultats de cette thèse démontrent des perturbations des transporteurs du glutamate à la fois dans des modèles animaux de DT et dans des astrocytes en culture soumis à une DT. La DT se caractérise par la perte du variant d’épissage GLT-1b codant pour un transporteur du glutamate dans le thalamus et le colliculus inférieur, les régions cérébrales affectées lors d’une DT, en l’absence de modification des niveaux d’ARNm. Ces résultats suggèrent une régulation post-transcriptionnelle de l’expression des transporteurs du glutamate en condition de DT. Les études basées sur l’utilisation d’inhibiteurs spécifiques des facteurs de transcription NFkB et de l’enzyme nucléaire poly(ADP)ribose polymérase-1 (PARP-1) démontrent que la régulation de l’expression du transporteur GLT-1 est sous le contrôle de voies de signalisation NFkB dépendantes de PARP-1. Cette étude démontre une augmentation de l’activation de PARP-1 et de NFkB dans les régions vulnérables chez le rat soumis à une DT et en culture d’astrocytes DT. L’inhibition pharmacologique du facteur de transcription NFkB par le PDTC induit une augmentation des niveaux d’expression de GLT-1, tandis que l’inhibition de PARP-1 par le DPQ conduit à l’inhibition de l’hyperactivation de NFkB observée lors de DT. L’ensemble de ces résultats met en évidence un nouveau mécanisme de régulation des transporteurs du glutamate par l’activation de PARP-1. L’accumulation de lactate est une caractéristique de la DT. Un traitement avec le milieu de culture d’astrocytes en condition de DT sur des cultures d’astrocytes naïfs induit une diminution de l’expression de GLT-1 ainsi qu’une inhibition de la capacité d’absorption du glutamate par les astrocytes naïfs. En revanche, l’administration de lactate exogène ne modifie pas le niveau d’expression protéique de GLT-1. Ainsi, des facteurs solubles autres que le lactate sont sécrétés par des astrocytes en condition de perturbation métabolique et peuvent potentiellement réguler l’activité des transporteurs du glutamate et contribuer à la pathogenèse du syncytium astroglial. En outre, la ceftriaxone, un antibiotique de la famille des β-lactamines, augmente de façon différentielle l’expression du variant-d’épissage GLT-1 dans le colliculus inférieur chez le rat DT et en culture d’astrocytes DT. Ces résultats suggèrent que la ceftriaxone peut constituer une avenue thérapeutique dans la régulation de l’activité des transporteurs du glutamate lors de DT. Pour conclure, la mort cellulaire d’origine excitotoxique lors de DT survient en conséquence d’une dysfonction mitochondriale associée à une perturbation du métabolisme énergétique cérébral. La modification de l’expression des transporteurs du gluatamate est sous le contrôle des voies de signalisation NFkB dépendantes du facteur PARP-1. De plus, l’inhibition métabolique et l’augmentation des sécrétions de lactate observées lors de DT peuvent également constituer un autre mécanisme physiopathologique expliquant la diminution d’expression des transporteurs de glutamate. Enfin, la ceftriaxone pourrait représenter une stratégie thérapeutique potentielle dans le traitement de la régulation de l’expression des transporteurs du glutamate et de la perte neuronale associés à l’excitotoxicité observée lors de DT. / Excitotoxicity has been implicated as a major pathophysiological mechanism in the pathogenesis of thiamine deficiency (TD). Excitotoxic-mediated cell death is localized in areas of focal vulnerability in TD and may occur as a consequence of impairment in mitochondrial energy metabolism, sustained cell membrane depolarization and decreased uptake of glutamate by astrocytes due to the loss of excitatory amino acid transporters, (EAAT1 and EAAT2). Over the years, a number of studies have identified glutamate as being a major contributor to excitotoxicity in the pathophysiology of TD. Thus, downregulation of astrocytic glutamate transporters resulting in excitotoxicity is a key feature of TD and understanding the regulation of these transporters is essential to understanding the pathophysiology of the disorder. The objective of the present thesis project was to examine the underlying basis of astrocytic glutamate transporter regulation during TD encephalopathy. Major findings of the studies presented in this thesis project provide evidence for glutamate transporter abnormalities in TD animal models and astrocyte cultures exposed to TD. TD results in the loss of the glutamate transporter splice variant-1b (GLT-1b) in vulnerable areas of brain, i.e. thalamus and inferior colliculus, with no significant alteration in the mRNA levels of the transporters, suggesting that glutamate transporter regulation under conditions of TD is a posttranscriptional event. Studies using a specific inhibitor of the transcription factor, Nuclear factor-kappa B (NF-κB) and a nuclear enzyme poly (ADP)ribose polymerase-1 (PARP-1) provided evidence for the regulation of GLT-1 by PARP-1 dependent NF-κB signalling pathways. The major findings of this study suggested an increase in the activation of PARP-1 and NF-κB molecule in the vulnerable areas of TD rat brain and TD astrocyte cultures. Pharmacological inhibition of NF-κB showed an increase in the levels of GLT-1, while inhibition of PARP-1 using a specific PARP-1 inhibitor, DPQ inhibited the increased activation of NF-κB that was observed during TD. Overall results of this finding provided evidence for a mechanism involving PARP-1 activation in the regulation of glutamate transporters. Given the increased lactate accumulation as a classical feature of TD, we studied the effect of soluble factors produced by astrocytes on glutamate transporter function. Treatment of naïve astrocyte cultures with TD conditioned media resulted in decreased levels of GLT-1 and inhibition of glutamate uptake capacity concomitant with a loss of mitochondrial membrane potential. Administration of exogenous lactic acid produced a similar reduction in glutamate uptake to that resulting from conditioned media. However, lactic acid treatment did not result in a change in GLT-1 protein levels. In addition, the pro-inflammatory cytokine TNF-α was shown to be increased in astrocytes treated with TD along with elevated levels of the phospho-IκB fragment, indicative of increased activation of NFκB. Inhibition of NFκB led to an amelioration of the decrease in GLT-1 that occurs in TD, along with recovery of glutamate uptake. Thus, soluble factors released from astrocytes under conditions of metabolic impairment such as lactate and TNF-α impairment appear to exert a regulatory influence on glutamate transporter function. Ceftriaxone, a β-lactam antibiotic, has the ability to differentially stimulate GLT-1b (splice-variant) expression in the inferior colliculus in TD rats and under in vitro conditions with TD astrocyte cultures. Thus, ceftriaxone may be a potential therapeutic strategy in the regulation of glutamate transporter function during TD. In summary, excitotoxic cell death in TD occurs as a consequence of mitochondrial dysfunction associated with cerebral energy impairment and abnormal glutamate transporter status. A major underlying mechanism for glutamate transporter abnormalities is mediated by PARP-1 dependent NF-κB signaling pathways. In addition, metabolic inhibition with substantial production of lactate and TNF-α may be perhaps another mechanism responsible for glutamate transporter downregulation in TD.

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