Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les connexions entre les cellules sensorielles et les neurones primaires de l’oreille interne, appelées synapses sont essentielles à l’encodage et la transmission des informations auditives et vestibulaires vers le cerveau. C’est aussi une zone extrêmement exposée et fragile qui semble impliquée dans de nombreuses atteintes de l’audition et de l’équilibration, mais également au cours du vieillissement. Des récupérations spontanées de l’audition et de l’équilibre ont été observées suite à ces différentes atteintes chez l’Homme. Dans le cadre de ma thèse, j’ai étudié d’une part, comment des atteintes sélectives de ces synapses pouvaient générer des troubles de l’oreille interne chez l’animal, et d’autre part, comment des mécanismes de réparation spontanée de ces synapses supportent la récupération des fonctions auditives et vestibulaires. Nous avons constaté qu’il existe une hétérogénéité dans les capacités de réparations synaptiques entre la cochlée et le vestibule. L’étude des mécanismes moléculaires mis en jeu dans cette réparation synaptique pourrait ouvrir la voie au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les atteintes de l’oreille interne. / Inner ear connections between primary neurons and sensory cells, called synapses are essential for encoding and transmitting auditory and vestibular information to the brain. It is also an extremely exposed and fragile area that is involved in many hearing and balance disorders, but also during aging. Spontaneous hearing and balance recoveries have been observed following these different injuries in humans. In the context of my thesis, I studied, on the one hand, how selective lesions of these synapses could generate inner ear disorders in animals, and on the other hand, how spontaneous repair mechanisms of these synapses support auditory and vestibular functions recovery. We found that there is heterogeneity in synaptic repair capabilities between the cochlea and the vestibule. The study of the molecular mechanisms involved in this synaptic repair could pave the way for the development of new therapeutic strategies against various inner ear disorders.

Les mécanismes sous-tendant la neurodégénérescence aiguë (ischémie cérébrale) et chronique (maladie d'Alzheimer, maladie de Huntington, sclérose latérale amyotrophique), impliqueraient des altérations mitochondriales et des anomalies de transmission glutamatergique (excitotoxicité). La maladie de Huntington (MH) est caractérisée par une neurodégénérescence du striatum. Dans cette structure cérébrale, une diminution de l'activité du complexe II mitochondrial est observée chez les patients. Les mécanismes de la neurodégénérescence induite par l'inhibition du complexe II sont inconnus in vivo et nous les avons caractérisés dans un modèle de rat intoxiqué par l'acide 3-nitropropionique (3-NP). La calpaïne est la protéase majoritairement impliquée dans la mort striatale in vivo en parallèle d'une activation des caspases. De plus, les modèles murins transgéniques de la MH présentent une hyperactivation des récepteurs NMDA (R-NMDA). Les atteintes mitochondriales pourraient de manière synergique, potentialiser les effets toxiques de la dysfonction des R-NMDA. Cependant les mécanismes de cette synergie sont, in vivo, inconnus.<br />Dans la présente étude, nous avons cherché à comprendre comment la mort induite par l'injection intrastriatale de l'acide quinolinique (QA), agoniste des R-NMDA, était potentialisée par le 3-NP, inhibiteur du complexe II mitochondrial.<br />Le 3-NP subtoxique induit une potentialisation de la mort striatale lorsque l'inhibition du complexe II est supérieure à 35%. Le 3-NP seul (sans QA) produit des lésions au-delà de 50% d'inhibition. Entre 35 et 50% d'inhibition, l'utilisation de techniques biochimiques et immunohistochimiques, a permis de démontrer que le 3-NP potentialisait la mort excitotoxique par un facteur 10. Le mécanisme de la potentialisation met en jeu une activation importante de la calpaïne, protéase activée par le Ca2+. L'activation de la calpaïne traduit une élévation délétère de la concentration intracytoplasmique du Ca2+. L'origine du mécanisme calcique de la potentialisation excitotoxique par le 3-NP pouvait sous-tendre l'existence d'une hyperactivation des R-NMDA conduisant à une augmentation de l'influx calcique, et/ou une perturbation de l'homéostasie calcique. Le mécanisme d'augmentation de Ca2+ intracytoplasmique ne semble pas mettre en jeu une hyperactivation des R-NMDA. En effet, le 3-NP ne modifie pas l'entrée de glucose induite par le QA in vivo, ceci traduisant une activation similaire des R-NMDA avec ou sans 3-NP. De plus, l'entrée du 45Ca induite par le QA appliqué sur des cultures primaires de neurones striataux, n'est pas augmentée par le 3-NP, malgré un niveau de calcium intracellulaire augmenté, détecté par imagerie calcique. <br />D'après ces résultats, la potentialisation de mort induite par le QA lorsque le complexe II mitochondrial est inhibé, ne résulterait pas d'une entrée accrue de Ca2+ par les R-NMDA, mais résulterait plus probablement d'une incapacité des neurones à maintenir l'homéostasie calcique. Par ailleurs, la réduction de l'activité du complexe II mitochondrial combinée à l'excitotoxicité pourraient participer à la dégénérescence striatale dans la MH. Ainsi, l'homéostasie calcique constituerait une cible thérapeutique privilégiée.

La leucomalacie periventriculaire est l’une des causes principales d’infirmité motrice cérébrale chez le nouveau-nés prématurés. Notre hypothèse est qu’une inflammation maternelle sensibilise le cerveau immature à des lésions de la substance blanche (SB) et neuronales excitotoxiques. Afin de la tester, des rates Sprague Dawley ont reçu de LPS d’E.coli à 19 et 20 jours de gestation. Les rates témoins ont reçu des injections de PBS. Les rats nouveau-nés ont reçu d’iboténate à P4 puis sacrifiés à P5 et P9. Dans le groupe LPS vs temoin, nous avons montré une aggravation des lésions de la substance blanche caractérisées par une activation microgliale, hypomyélinisation et astrogliose. Une diminution des neurones GABAergiques et dopaminergiques était associée aux lésions de la SB. Nous avons montré une diminution de la liaison des récepteurs dopaminergiques D1 et D2 aux ligands spécifiques. Le LPS potentialise les effets de l’Ibo en majorant les lésions cérébrales macroscopiques et diffuses. / The periventricular leucomalacia is one of the main causes of cerebral palsy in premature infants. This disorder desease is multifactorial. Our hypothesis is that maternal inflammation sensitizes the immature brain to white matter (WM) and neuronal excitotoxic lesions. To test it, Sprague Dawley rats received LPS E. Coli at 19 and 20 days of gestation. The female control have received injections of PBS. The newborn rats received iboténate at P4 and then sacrificed at P5 and P9. In LPS groups vs control groups, immunohistochemical study showed an aggravation of histological lesions of the WM characterized by microglial activation, a hypomyelinisation and astrogliose. A decrease in GABAergic neurons and dopaminergic neurons were associated with WM lesions. Autoradiographic studies also showed a decrease of dopaminergic receptors D1 and D2 binding specific ligands. In this study, we showed that the LPS potentiates the effects of the Ibo by increasing macroscopic and diffuse brain injury.

Les mécanismes physiopathologiques liés aux maladies neurodégénératives restent encore largement méconnus. Deux processus semblent être particulièrement en cause dans les phénomènes de neurodégénérescence : la neurotoxicité par afflux massif de calcium due à une activation excessive des récepteurs NMDA (GluN) et la neurotoxicité par déstabilisation du cytosquelette du neurone par le biais de la phosphorylation anormale de la protéine tau. L'imagerie moléculaire par le biais de la tomographie par émission de positons (TEP) et de radiotraceurs, en étudiant les mécanismes moléculaires in vivo, permet de détecter et quantifier ces phénomènes. Ce travail a eu pour objet d'étudier un dérivé de la mémantine, un antagoniste des GluN se fixant sur un site intra-canal accessible uniquement lorsque ces récepteurs sont activés ce qui en fait donc un vecteur d'imagerie intéressant pour étudier leur activation. Nous avons mis au point la synthèse d'un nouveau radiotraceur dérivé de la mémantine : la [18F]-FNM (Fluoroéthylnormémantine). Il s'agit d'une synthèse par substitution nucléophile d'un groupement tosylate par du [18F], suivie d'une hydrolyse acide. Cette synthèse est reproductible avec un rendement de 10%, son activité spécifique est > 355 GBq/µmol. Chez le rat, le traceur passe la barrière hémato-encéphalique et sa distribution cérébrale est bien corrélée avec la localisation des GluN (r=0.622, p<0.0001). Sa cinétique de fixation (40 minutes) est compatible avec son utilisation en TEP. En ce qui concerne les tauopathies, la protéine tau stabilise l'organisation microtubulaire. Lors d'une phosphorylation anormale, l'interaction avec les microtubules diminue et les protéines tau vont s'accumuler en formant des Paires de Filaments en Hélice (PHF). Nous avons optimisé la radiosynthèse de l' [18F]-AV1451 ciblant les PHF. Notre rendement de synthèse est de 30% et l'activité spécifique du traceur > 10 GBq/µmol. Nous avons réalisé des autoradiographies sur des coupes de cerveaux atteints de tauopathie et nous avons constaté la capacité du traceur à différencier les coupes saines des coupes malades. La production de cet outil dans notre centre va nous permettre d'étudier la présence de PHF chez le marmouset, un primate particulièrement intéressant dans l'étude du vieillissement. Nous avons donc réalisé la synthèse de deux radiotraceurs innovants : la [18F]-FNM et le [18F]-AV1451, les synthèses sont reproductibles et les rendements compatibles avec des productions de doses en recherche pré-clinique et clinique. / The pathophysiological mechanisms associated with neurodegenerative diseases remain largely unknown. Two processes appear to be particularly involved in the phenomena of neurodegeneration: neurotoxicity induced by massive influx of calcium caused by excessive activation of NMDA receptors (GluN) and neurotoxicity by destabilization of neuron cytoskeleton through abnormal protein tau phosphorylation. Molecular imaging through positron emission tomography (PET) and radiotracers, by studying the molecular mechanisms in vivo, allows to detect and quantify these phenomena. This work was intended to study a memantine derivative, a GluN antagonist. We chose to develop a ligand that selectively binds to the ion channel in the open and active state which therefore makes it an interesting vector to study their overactivation. We have developed the synthesis of a new memantine analogue radiotracer: the [18F]-FNM (Fluoroéthylnormémantine). This is a synthesis by nucleophilic substitution of a tosylate with [18F], followed by acid hydrolysis. This synthesis is reproducible with a yield of 10%, its specific activity was> 355 GBq / µmol. In rats, the tracer cross the blood-brain barrier and brain distribution correlates well with the location of GluN (r = 0.622, p <0.0001). The binding kinetics (40 minutes) is compatible with its use in PET. Regarding tauopathies, the tau protein stabilizes microtubule organization. During abnormal phosphorylation, interaction with microtubules and tau proteins decreases and tau will accumulate to form Paired helical Filament (PHF). We optimized the radiosynthesis of [18F] AV1451 targeting 3 tau PHF. Our yield of synthesis is 30% and the specific activity of the tracer> 10 GBq / µmol. We made autoradiography on brains sections and have shown tracer ability to differentiate healthy and pathological slices. This tool will allow us to study the presence of PHF in marmosets, a particularly interesting primate in the study of aging. So we performed the synthesis of two innovative radiotracers: the [18F]-FNM and [18F]-AV1451, syntheses are reproducible and yields compatible with doses manufacturing in pre-clinical and clinical research.

Les maladies neurodégénératives se caractérisent par une déconnexion synaptique et une dégénérescence des axones (DA) précoces, menant à la mort spécifique d’une population neuronale. Les niveaux intracellulaires de NAD+, co-facteur essentiel dans le maintien de l’intégrité axonale, sont fortement diminués lors de ces pathologies. L’augmentation des taux de NAD+ est ainsi une stratégie thérapeutique dans la prévention de ces maladies. La capacité du nicotinamide riboside (NR) à retarder la DA dans le système nerveux périphérique (SNP) ainsi que la récente mise en évidence d'une conversion extracellulaire du NAD+ en NR dans des lignées cellulaires et dans le SNP soulignent l'intérêt de ce précurseur du NAD+. Mon projet de thèse repose sur la caractérisation des effets du NAD+ et du NR lors de la DA dans des neurones du système nerveux central (SNC). A partir d'un modèle d'excitotoxicité mis au point en dispositifs microfluidiques, nous montrons pour la première fois que le NR protège de la DA dans des neurones corticaux de manière plus efficace que le NAD+. Cet effet différentiel a également été validé dans un modèle ischémique in vivo. De manière surprenante, lors d'une neurodégénérescence induite par une déplétion aigüe en NAD+, un effet protecteur total à la fois du NAD+ et du NR a été mis en évidence. L'analyse de la voie de conversion extracellulaire a ainsi révélée une adaptation du métabolisme du NAD+ et de sa conversion en NR en fonction du paradigme neurotoxique. En conclusion, ce travail démontre un fort effet protecteur du NR dans le SNC et ouvre de nouvelles voies thérapeutiques dans la prévention des processus neurodégénératifs. / Synaptic and axonal degeneration (AxD) are major events in neurodegenerative diseases. Levels of NAD+, an important coenzyme for axonal integrity, are strongly reduced in different degeneration models so enhancing cellular NAD+ is one of the numerous therapeutic strategies against neuronal pathologies. Nicotinamide riboside (NR) is a good NAD+ precursor as it has already been shown to delay AxD in peripheral nervous system (PNS) and extracellular NAD+ conversion to NR was previously described in cell lines and in PNS. During my thesis project, we analyzed the role of NR metabolism to prevent degeneration processes in cortical neurons. Using an excitotoxicity model developed in microfluidic devices, we showed for the first time that both NAD+ and NR delay AxD in cortical neurons, with a more potent effect for NR. We confirm this differential effect in an in vivo ischemic model. Moreover, NR effect is mainly restricted to the axonal compartment and intracellular NAD+ depletion is reverted after NR application, suggesting that axonal integrity is totally dependent on NAD+ local metabolism. Furthermore, in a complete NAD+ depletion paradigm, NAD+ and NR have surprisingly the same strong effect, protecting equally neuronal death and AxD. Examination of the extracellular pathway suggest that NAD+ conversion to NR is limited in excitotoxicity but effective in the NAD+ depletion model. These results reveal that NR and NAD+ metabolism depend on the neurotoxic paradigm. Our results demonstrate that NR has a strong and local neuroprotective effect on AxD in several neurotoxic processes. These findings open new therapeutic strategies to prevent neurodegenerative diseases.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

L'excitotoxicité est un mécanisme pathologique qui résulte généralement du relargage massif de glutamate par les neurones en souffrance et qui conduit à la destruction des réseaux neuronaux ainsi qu'à des pertes cellulaires qui peuvent sévèrement impacter les fonctions cognitives et motrices. Au niveau du système nerveux central la séquence d'évènements qui supportent ce processus a bien été décrite et sert aujourd'hui de base au développement d'approches thérapeutiques ciblés pour limiter les conséquences du phénomène. Au niveau de l'oreille interne, les processus excitotoxiques pourraient également être impliqués dans différents types d'atteintes des fonctions auditives et vestibulaires tels que les traumas acoustiques, les surdités brusques, la neurite vestibulaire ou encore les vertiges d'origines ischémiques. Bien que les mécanismes moléculaires qui supportent ce type d'atteinte aient été bien explorés au niveau cochléaire, ils restent peu documentés au niveau du vestibule. De récentes études réalisées par notre équipe ont mis en évidence la participation des récepteurs du glutamate à la neurotransmission vestibulaire en conditions normales et ont également démontré les conséquences histologiques et fonctionnelles d'une atteinte excitotoxique du vestibule. Elles ont par ailleurs mis en évidence le fort potentiel de réparation spontané des synapses vestibulaires après déafférentation. Dans le présent travail de thèse, nous avons voulu identifier les effecteurs cellulaires qui contrôlent les phénomènes de déafférentation et de réafférentation. Dans ce but, nous avons mis au point un modèle d'étude original, qui permet un suivi histologique et fonctionnel de la séquence des évènements biologiques mis en jeu dans ces processus. En combinant des approches en immunohistochimie, microscopie électronique, électrophysiologie moléculaire et pharmacologie nous démontrons que les récepteurs glutamatergiques de types AMPA et NMDA sont tous deux impliqués dans les processus de déafférentation. Les récepteurs NMDA sont également essentiels au processus de réparation synaptique. Les résultats de ce travail apportent une nouvelle lumière sur le rôle des récepteurs du glutamate dans le processus de lésion/réparation des synapses vestibulaires. Cette nouvelle donne pourrait impacter directement sur les stratégies pharmacologiques de protection en cours de développement dans le domaine de la pathologie vestibulaire, mais également par extension à celui de la pathologie auditive. En outre le modèle de culture organotypique de tranche d'organe vestibulaire pourrait trouver application pour le screening de nouveaux composés à propriétés protectrices ou régénératrices. / Excitotoxicity is a pathological mechanism that usually results from the massive release of glutamate by suffering neurons and that leads to destruction of neural networks as well as cell losses that may severely impact cognitive and motor functions. In the central nervous system the sequence of events that supports this process has been extensively studied and is now the basis for the development of targeted therapeutic approaches to limit the consequences of the phenomenon. In the inner ear, excitotoxic damages may also support in different types of auditory and vestibular disorders such as acoustic traumas, sudden hearing loss, vestibular neuritis or dizziness of ischemic origin. Though the molecular mechanisms that support this type of injury have been well explored at cochlear level, they remain poorly documented in the vestibule. Recent studies by our team have confirmed the involvement of glutamate receptors in the vestibular calyx neurotransmission in normal conditions and also showed histological and functional consequences of excitotoxic damage in the vestibule. They also revealed the potential for spontaneous repair of the vestibular synapses after deafferentation. In present thesis, we aimed at identifying the cellular effectors that control the phenomena of deafferentation and reafferentation. For this purpose, we developed an original study model, which allows tracking histological and functional assessment of biological events involved in these processes. By combining approaches in immunohistochemistry, electron microscopy, molecular electrophysiology and pharmacology we demonstrate that both AMPA and NMDA type glutamate receptors are mainly involved in the process of deafferentation. NMDA receptors are also essential for synaptic repair process. The results of this work provide a new light on the role of glutamate receptors in the process of injury / repair of vestibular synapses. The novel observations could directly impact on the ongoing pharmacological protection strategies in the field of the vestibular pathology, and by extension to that of the hearing pathology. In addition, the organotypic culture model of vestibular organ slices may find application for screening new compounds with protective or regenerative properties.

La Sclérose Latérale Amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative caractérisée par une perte sélective des motoneurones et impliquant les effets neurotoxiques des astrocytes. Le but de ce travail est d’explorer les altérations du métabolisme dans les astrocytes induites par des conditions associées à la SLA. Nous avons dans un premier temps mis en place une méthodologie d’analyse spectrométrique (résonance magnétique nucléaire et spectrométries de masse) du métabolome cellulaire. Ensuite, nous avons invalidé les cellules NSC-34 comme modèle in vitro d’étude de l’excitotoxicité induite par le glutamate. Nous avons enfin étudié les altérations métaboliques dans les astrocytes primaires dans des conditions de la SLA et décrit plusieurs dysfonctionnements métaboliques dans ces cellules induits par l’expression de la mutation SOD1G93A, par la présence des motoneurones sauvages et par l’exposition au glutamate. Ce travail met en évidence les relations métaboliques entre la SLA et le métabolisme énergétique cérébral. Nos résultats contribuent à la compréhension des altérations métaboliques des astrocytes dans la SLA et pourraient aider à appréhender de nouvelles cibles thérapeutiques associées aux altérations métaboliques dans la SLA, afin de protéger les motoneurones des perturbations induites par le glutamate. / The selective degeneration of motoneuron that characterizes amyotrophic lateral sclerosis (ALS), implicates non-cell-autonomous effects of astrocytes. The aim of this work is to explore the metabolic status of astrocytes exposed to ALS-associated conditions, using metabolomics approach. We first, developed a methodology for the analysis of cellular metabolome using different analytical technologies, and then we evaluated the relevance of differentiated NSC-34 as an in vitro model for glutamate excitotoxicity studies. Finally, we evaluated metabolic alterations in astrocytes in ALS-associated conditions and we described several metabolic dysfunctions in these cells induced by the expression of a SOD1G93A mutation, the presence of wildtype motoneurons and glutamate exposition. These studies highlight major impacts of ALS on the brain energetic metabolism. This work provides novel insight for understanding the metabolic dysfunction of astrocytes in ALS conditions and opens perspective of therapeutics targets though focus on these metabolic ways, in order to protect motoneurons from glutamate injury.