Objectifs : Le gène SHANK3 code pour une protéine dite d’« échafaudage » localisée dans les synapses des neurones glutamatergiques. Elle est nécessaire au bon assemblage des protéines de la densité postsynaptique et est cruciale pour une transmission synaptique efficace. Des anomalies génétiques conduisant à la diminution de la protéine SHANK3 sont impliquées dans plusieurs maladies psychiatriques, incluant des formes génétiques de troubles du spectre autistique ainsi que la schizophrénie. Les mutations étant hétérozygotes, il serait théoriquement possible d’augmenter l’expression de la protéine SHANK3 en augmentant la transcription de l’allèle sain par des traitements chimiques. Cependant, la régulation transcriptionnelle du gène SHANK3 est très peu connue dans les neurones humains par manque de modèles cellulaires pertinents. L’objectif de mon travail de thèse a été de tirer avantage des propriétés d’autorenouvellement et de pluripotence des cellules souches pluripotentes humaines (Human Pluripotent Stem Cells, hPSC) pour produire une grande quantité de neurones humains glutamatergiques in vitro puis de les utiliser comme ressource cellulaire pour développer une technique de criblage à haut débit afin d’identifier des modulateurs de la transcription du gène SHANK3. Résultats : Des précurseurs neuronaux ont été dérivés à partir d’une lignée de cellules souches embryonnaires humaines (SA001, 46 XY, Cellartis, Suède) puis différenciés pendant 14 jours, dans des plaques 384 puits, afin d’obtenir une population composée d’au moins 70 % de neurones corticaux glutamatergiques. Une méthode à haut débit automatisée et miniaturisée basée sur la technique FastLane (Qiagen) a été développée pour extraire les ARNm directement à partir des plaques 384 puits. Les variations d’ARNm de SHANK3 induites par les différents traitements ont ensuite été quantifiées par qPCR Taqman en duplex, en normalisant avec le gène de ménage Cyclophiline A, et en rapportant aux niveaux d’ARNm de neurones non traités (Méthode de 2-ΔΔCt). Un criblage sur 205 composés, incluant des inhibiteurs de kinase, des régulateurs épigénétiques et des médicaments repositionnables, a été réalisé et 28 hits augmentant de plus de 30 % l’ARNm de SHANK3 ont été découverts. Seize composés ont été confirmés par des expériences de dose réponses sur l’ARNm de SHANK3. Des expériences d’immunofluorescence par imagerie à haut contenu ont confirmées que 4 composés augmentaient de façon significative les niveaux de la protéine SHANK3 dans le réseau neuritique, incluant des inhibiteurs de la kinase cycline dépendante 5 (Cdk5) avec la roscovitine et le lithium (régulateur d’humeur), l’antiépileptique acide valproïque et l’antipsychotique fluoxétine. Des mesures fonctionnelles de flux calcique ont validé l’effet du lithium et de l’acide valproïque sur la force synaptique glutamatergique. Enfin, le potentiel de ces composés a également été exploré sur des neurones différenciés à partir de cellules souches induites à la pluripotence (Induced Pluripotent Stem Cells, iPSC) d’individus autistes portant une mutation sur le gène SHANK3. Conclusion : Cette étude démontre qu’il est possible d’identifier des voies de régulation de protéines clés synaptiques, comme SHANK3, par méthode de criblage à haut débit en utilisant des neurones humains dérivés d’hPSC, incluant des neurones représentatifs d’individus autistes avec la technologie iPSC. Cette nouvelle approche devrait permettre une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires responsable de l’autisme et la découverte de nouveaux composés thérapeutiques, personnalisables à de sous-groupes de sujets autistes classifiés en fonction du gène ou de la voie de signalisation à corriger plutôt qu’en fonction de leurs symptômes cliniques hétérogènes. / Aims: The SHANK3 gene codes for a scaffold protein located in synapses of glutamatergic neurons. It plays a crucial role in the postsynaptic density assembly and in controlling glutamatergic synaptic transmission. Genetic anomalies leading to a decrease in SHANK3 protein expression are implicated in several psychiatric conditions, including genetic forms of autism spectrum disorders and schizophrenia. Mutations being heterozygous, treatments that increase SHANK3 protein through transcriptional regulation may be therapeutically useful. However, little is known about SHANK3 gene transcriptional regulation in human neurons because of the lack of a relevant cellular model. Here I took advantage of the self-renewing and pluripotency properties of human pluripotent stem cells (hPSC) to produce a large amount of human glutamatergic neurons in vitro and use them as a cellular resource to develop a large-scale screening strategy to identify SHANK3 gene transcription modulators. Results: Neuronal precursors were differentiated from one human embryonic stem cell line (SA001, 46 XY, Cellartis, Sweden). Cultures containing more than 70% of neurons with a cortical glutamatergic phenotype were reproducibly obtained in 384-well plates upon 14 days of precursor differentiation. Automated and high-throughput mRNA extraction was performed using Fastlane technology (Qiagen) in 384-well plates. SHANK3 mRNA levels were quantified using duplex Taqman qPCR, normalized to Cyclophilin A mRNA levels, then to SHANK3 mRNA levels of vehicle-treated cells in order to determine SHANK3 mRNA variations induced by the compound treatment (2-ΔΔCt method). A screening assay was conducted on 205 compounds, including kinase inhibitors, epigenetic regulators and repositionable marketed drugs, and 28 compounds successfully passed the hit selection criteria yielding SHANK3 mRNA increases of at least 30% from mean control values with a statistical cut-off of 2 standard deviation. Sixteen compounds were confirmed by dose-response experiments on SHANK3 mRNA. Further immunofluorescence studies using high content imaging confirmed that 4 compounds increased levels of SHANK3 protein in the neuritic network. Thus, this screening identified as SHANK3 regulators 2 Cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) inhibitors the lead molecule, roscovitine and the mood regulator, lithium; the antiepileptic drug valproïc acid and the antipsychotic fluoxetine. In addition, functional calcium flux experiments validated lithium and valproïc acid effect on glutamatergic synaptic strength. Finally, the compounds were also tested on neurons differentiated from induced pluripotent stem cells (iPSC) of autistic patients bearing SHANK3 mutation. Conclusion: This study demonstrates that cellular pathways regulating a key synaptic protein, SHANK3, can be explored on a large scale using hPSC-derived neurons, including autistic individuals neurons using iPSC technology. This approach should help improving knowledge of the molecular mechanisms responsible of autism and promote the discovery of new therapeutic compounds, personalized to autistic subgroups of individuals stratified according to gene or pathway dysfunction rather than according to clinical heterogeneous symptoms.

Les maladies neurodégénératives se caractérisent par une déconnexion synaptique et une dégénérescence des axones (DA) précoces, menant à la mort spécifique d’une population neuronale. Les niveaux intracellulaires de NAD+, co-facteur essentiel dans le maintien de l’intégrité axonale, sont fortement diminués lors de ces pathologies. L’augmentation des taux de NAD+ est ainsi une stratégie thérapeutique dans la prévention de ces maladies. La capacité du nicotinamide riboside (NR) à retarder la DA dans le système nerveux périphérique (SNP) ainsi que la récente mise en évidence d'une conversion extracellulaire du NAD+ en NR dans des lignées cellulaires et dans le SNP soulignent l'intérêt de ce précurseur du NAD+. Mon projet de thèse repose sur la caractérisation des effets du NAD+ et du NR lors de la DA dans des neurones du système nerveux central (SNC). A partir d'un modèle d'excitotoxicité mis au point en dispositifs microfluidiques, nous montrons pour la première fois que le NR protège de la DA dans des neurones corticaux de manière plus efficace que le NAD+. Cet effet différentiel a également été validé dans un modèle ischémique in vivo. De manière surprenante, lors d'une neurodégénérescence induite par une déplétion aigüe en NAD+, un effet protecteur total à la fois du NAD+ et du NR a été mis en évidence. L'analyse de la voie de conversion extracellulaire a ainsi révélée une adaptation du métabolisme du NAD+ et de sa conversion en NR en fonction du paradigme neurotoxique. En conclusion, ce travail démontre un fort effet protecteur du NR dans le SNC et ouvre de nouvelles voies thérapeutiques dans la prévention des processus neurodégénératifs. / Synaptic and axonal degeneration (AxD) are major events in neurodegenerative diseases. Levels of NAD+, an important coenzyme for axonal integrity, are strongly reduced in different degeneration models so enhancing cellular NAD+ is one of the numerous therapeutic strategies against neuronal pathologies. Nicotinamide riboside (NR) is a good NAD+ precursor as it has already been shown to delay AxD in peripheral nervous system (PNS) and extracellular NAD+ conversion to NR was previously described in cell lines and in PNS. During my thesis project, we analyzed the role of NR metabolism to prevent degeneration processes in cortical neurons. Using an excitotoxicity model developed in microfluidic devices, we showed for the first time that both NAD+ and NR delay AxD in cortical neurons, with a more potent effect for NR. We confirm this differential effect in an in vivo ischemic model. Moreover, NR effect is mainly restricted to the axonal compartment and intracellular NAD+ depletion is reverted after NR application, suggesting that axonal integrity is totally dependent on NAD+ local metabolism. Furthermore, in a complete NAD+ depletion paradigm, NAD+ and NR have surprisingly the same strong effect, protecting equally neuronal death and AxD. Examination of the extracellular pathway suggest that NAD+ conversion to NR is limited in excitotoxicity but effective in the NAD+ depletion model. These results reveal that NR and NAD+ metabolism depend on the neurotoxic paradigm. Our results demonstrate that NR has a strong and local neuroprotective effect on AxD in several neurotoxic processes. These findings open new therapeutic strategies to prevent neurodegenerative diseases.

Le TIMP-1, inhibiteur naturel des métalloprotéinases matricielles, exerce des effets pléïotropes indépendants de l'inhibition des MMPs et participe au développement de certains cancers et maladies neurodégénératives. Ces effets cytokiniques du TIMP-1 impliquent sa liaison à des récepteurs membranaires dont certains sont caractérisés, la glycoprotéine CD63/intégrine beta 1 et le complexe pro MMP-9/CD44. Cependant les acides aminés ou les domaines du TIMP-1 se liant à ces récepteurs ne sont pas identifiés. Les travaux réalisés au cours de cette thèse mettent en évidence un nouveau récepteur du TIMP-1, la protéine LRP-1. Dans les neurones corticaux murins, le TIMP-1 se fixe aux domaines DII et DIV de LRP-1, est endocyté et induit une réduction de la taille des neurites ainsi qu'une augmentation du volume des cônes de croissance. Afin de caractériser cette interaction, nous avons utilisé une approche originale de modélisation moléculaire associant les analyses de modes normaux et la dynamique moléculaire. Ces analyses in silico ont permis d'identifier un mouvement de pince entre les domaines N et C-terminaux du TIMP-1. Nous avons muté trois résidus (F12, K47 et W105) localisés dans une région essentielle d'un point vue énergétique à l'exécution de ce mouvement. Ces trois mutants n'ont pas d'effet sur la longueur du réseau neuritique et ne sont pas endocytés par LRP-1. En revanche, ils interagissent avec les 2 autres récepteurs (CD63 et proMMP-9) et reproduisent les effets du TIMP-1 sauvage. De plus, nous avons identifié une séquence de 6 acides aminés localisée dans le domaine extracellulaire I de CD63 et essentielle à la liaison avec le TIMP-1. L'ensemble de ces travaux a permis l'identification de régions impliquées dans l'interaction du TIMP-1 avec ses différents récepteurs et pourrait permettre le développement de nouveaux outils pharmacologiques ciblant les activités cytokiniques du TIMP-1. / TIMP-1, a natural inhibitor of matrix metalloproteinases, exerts pleiotropic effects independent of MMP inhibition and thus participates to the development of some cancers and neurodegenerative disorders. These cytokine-like activities require TIMP-1 binding to membrane receptors. Up to date two receptors, CD63/integrin beta 1 and proMMP-9/CD44, have been characterized. Nevertheless, TIMP-1 residues or regions binding these receptors remain unknown. In this work, we have identified the protein LRP-1 as a new receptor for TIMP 1. In mouse cortical neurons, TIMP-1 preferentially binds DII and DIV domains of LRP-1, is internalized via a LRP-1-dependent endocytosis, reduces neurite length and increases growth cone volume. To go deeper into TIMP-1/LRP-1 interaction, we used an original molecular modeling approach which combined normal mode analysis and molecular dynamic. These in silico studies allow us to point out a clamp movement between the N- and C-terminal domains of TIMP-1. Three residues localized in a region that seems essential for the movement have been mutated (F12, K47 and W105) and single mutants have been produced. These mutants do not reduce neurite outgrowth and are not internalized by LRP-1. In contrast, they interact with the two others receptors proMMP-9 and CD63 and induce associated biological effects. Furthermore, we have identified a sequence of six residues localized in the CD63 extracellular domain I and essential for TIMP 1 binding. The set of our data highlighted new regions of TIMP-1 interacting with its receptors and could lead to design novel therapeutic agents targeting the TIMP-1 cytokine like activities.

Les Troubles du Spectre Autistique (TSA) affectent un individu sur 100 en France et sont caractérisés par des déficits de la communication et des interactions sociales ainsi que par la présence d’intérêts restreints et de comportements répétitifs. Le laboratoire a démontré l’implication de protéines synaptiques dans le développement des TSA et en particulier celle des protéines SHANK. Ces protéines sont des protéines d’échafaudage présentes au niveau de la densité post-synaptique (PSD) des neurones glutamatergiques et interagissant avec différents partenaires. Dans le cadre de mon projet de thèse, nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine SHANK3. Des mutations au sein du gène SHANK3 ont été détectées chez environ 1 à 2% des patients, selon le degré de sévérité du retard mental. Un déficit de SHANK3 altère le fonctionnement synaptique. En effet, des analyses sur modèles de souris invalidées pour le gène SHANK3 ont montré une diminution de la densité des épines dendritiques, de la taille de la densité post-synaptique et de l’expression des partenaires protéiques de SHANK3. Mon modèle principal d’analyse a consisté en la reprogrammation de fibroblastes en cellules pluripotentes induites (iPSC « induced pluripotent stem cells »). Les iPSCs ont ensuite été sélectivement dérivées en neurones corticaux. Nos études se sont focalisées sur l’analyse des conséquences fonctionnelles de mutations de novo du gène SHANK3 retrouvées chez 4 patients à l’état hétérozygote et présentes au sein de l’exon 21. Ces mutations conduisent à un codon stop prématuré. En parallèle, nous avons obtenu des cellules de 4 individus témoins ne présentant aucun trouble psychiatrique identifié. L’analyse a porté d’une part sur des aspects morphologiques et d’autre part sur des aspects fonctionnels. Nous avons étudié l’effet des mutations sur la maturation et les caractéristiques morphologiques des épines dendritiques. Nous avons établi un protocole permettant une analyse détaillée de la morphologie en 3D des épines dendritiques et suivi leur maturation. Un résultat majeur est l’observation d’une diminution de la densité des épines sur les dendrites des neurones pyramidaux issus des patients par rapport aux témoins. Comme attendu, la maturation des épines n’est pas complètement achevée mais varie peu dans son évolution d’un individu à l’autre (témoins vs. patients). Nous avons poursuivi ces études par deux approches fonctionnelles : l’imagerie calcique et des études d’électrophysiologie. Les données électrophysiologiques sont en cours d’analyse. En conclusion, nous avons pu obtenir des cultures de neurones corticaux glutamatergiques et les maintenir en culture durant 40 jours pour effectuer différentes analyses à un stade de maturation suffisant pour la mise en évidence de phénotypes morphologiques et fonctionnels. Nous avons principalement observé une diminution de des densités synaptiques et de maturation des épines dendritiques au sein des neurones issus de patients liée à des altérations d’oscillations calciques spontanées. / Autism Spectrum Disorders (ASD) is a neurodevelopmental disorder affecting 1% of population ; characterised by impairments in social interaction and reciprocal communication as well as repetitive and stereotyped behaviors. The work of the laboratory lead to the identification of several genes associated with ASD, among which genes of the synaptic pathway such as SHANK. The SHANK proteins are scaffolding proteins of the post-synaptic density (PSD) of glutamatergic neurons and interact with several partners. In my thesis project, we were particularly interested in SHANK3 mutations. First, Shank3 mutations represent up to 2.12% of ASD cases with moderate to high ID. A SHANK3 deficit leads to the alteration of the synaptic functioning. Indeed, studies of mice KO for SHANK3 gene showed a decrease of the dendritic spines density, of the PSD size and of the expression of SHANK3 partners. My principal model of analysis consisted in the reprogrammation of fibroblasts into induced pluripotent stem cells (iPSCs). Then, the iPSCs were selectively derived into cortical neurons. Our studies were focus on the analysis of functional consequences of SHANK3 de novo mutations found within 4 patients. These mutations are heterozygous and within the exon 21. They result in a premature stop codon. In parallel, we obtained cells from 4 healthy individuals. The work was about the morphological and functional aspects. We analysed the mutations effects on the maturation and morphological caracteristics of the dendritic spines. We finalized a protocol that enabled a detailed analysis of the spine dendritic 3D morphology and their maturation follow-up. A important result was the observation of a decrease of the spine density on pyramidal neurons dendrites from patients compared to those from controls. Moreover, spines maturation was not fully accomplished but was not much different in its evolution between individuals (controls vs patients). Then, we used two functional skills : calcium imaging and electrophysiological experiments. The electrophysiological data are in progress. To conclude, we succeeded in the obtention of glutamatergic cortical neurons and to maintain them in culture during 40 days in order to realize some analysis at a sufficient maturation stage to observe morphological and functional phenotypes. We mainly observed a decrease of the dendritic spines density and maturation for the neurons from patients, with alterations of the spontaneous calcium oscillations.

La synaptogenèse est un processus biologique aboutissant à la mise en place d’un réseau de connexions neuronales, par la genèse de synapses. La mise en place de ce réseau de connexions est essentielle au développement du système nerveux central (SNC) et de ses fonctions. Tout comme les autres étapes du développement du SNC, la synaptogenèse est régulée par une multitude de signaux cellulaires, et le système endocannabinoïde en fait partie. Les dérivés du cannabis tel que le Δ-9-tétrahydrocannabinol (THC) et le cannabidiol (CBD) sont capables de traverser la barrière placentaire et de se retrouver dans le lait maternel. Par leur interaction avec le SNC, entre autres, ces phytocannabinoïdes sont capables d’influencer son développement. Le récepteur couplé à une protéine G 55 (GPR55) est catégorisé comme récepteur atypique du système endocannabinoïde, et il est capable d’être antagonisé par le CBD. Il a été prouvé par de précédentes études qu’il est lui aussi impliqué dans le développement du SNC, notamment dans le guidage et la croissance des axones durant les périodes fœtale et périnatale. Dans la littérature, il est souvent rapporté que les signaux impliqués dans le guidage axonal le sont aussi dans la synaptogenèse. C’est pourquoi le présent mémoire vise à examiner le rôle du récepteur GPR55 et l’effet de sa modulation par le CBD dans la formation de contacts synaptiques. Le modèle utilisé pour cette étude est la culture de neurones corticaux issus d’embryons de souris de génotypes gpr55+/+ et gpr55-/-. Pour comprendre le rôle physiologique de GPR55 dans la synaptogenèse nous avons étudié l’effet de la délétion du récepteur GPR55 à deux temps, Day In Vitro (DIV) 9-10 au début de la synaptogenèse, et à DIV14-15 un temps plus avancé. Ensuite pour comprendre comment le CBD est capable d’influencer la formation de contacts synaptiques de manière dépendante ou non de GPR55, les cultures de neurones corticaux de chaque génotype ont été exposées à DIV9 pour 24h à différentes concentrations du CBD (0,3uM ou 0,6uM ou 1uM). Les effets sur la formation de contacts synaptiques ont été étudiés en immunocytochimie, en immunobuvardage et en électrophysiologie de type patch clamp. Les résultats montrent que la délétion de GPR55 entraine à DIV14-15 une augmentation de la densité des contacts synaptiques, mais une réduction de leur aire et de l’expression de la synaptophysine, en affectant l’activité synaptique. L’exposition au CBD 0,6uM et 1uM entrainent de manière dépendante ou partiellement dépendante à GPR55, une augmentation de la densité des contacts synaptiques sans affecter leur aire, l’expression de protéines synaptiques ainsi que l’activité synaptique. La fréquence de décharge des neurones est diminuée de manière dépendante de GPR55 après l’exposition au CBD 1uM. Ces résultats suggèrent que GPR55 pourrait être un signal important pour l’arrêt de la formation de nouvelles synapses et un signal d’induction pour la maturation des synapses existantes. / Synaptogenesis is a biological process that leads to the establishment of a network of neuronal connections through the genesis of synapses. The formation of this network of connections is essential for the development of the central nervous system (CNS) and its functions. Like other stages of CNS development, synaptogenesis is regulated by multiple cellular signals, and the endocannabinoid system is part of it. Cannabis derivatives such as Δ-9-tetrahydrocannabinol (THC) and cannabidiol (CBD) can cross the placental barrier and be present in breast milk. Through their interaction with the endocannabinoid system, among others, these phytocannabinoids can influence CNS development. The G protein-coupled receptor 55 (GPR55) is categorized as an atypical receptor of the endocannabinoid system, and it can be antagonized by CBD. Previous studies have shown that GPR55 is also involved in CNS development, particularly in the guidance and growth of axons during fetal and perinatal periods. It is often reported in the literature that the signals involved in axonal guidance are also involved in synaptogenesis. Therefore, this study investigates the role of the GPR55 receptor and the effect of its modulation by CBD in the formation of synaptic contacts. The model used for this study consists of cortical neuron cultures from mouse embryos gpr55+/+ and gpr55-/- . To understand the physiological role of GPR55 in synaptogenesis, we studied the effect of gpr55 deletion at two-time points: Day In Vitro (DIV) 9- 10 at the beginning of synaptogenesis, and DIV14-15 at a later time point. Then, to understand how CBD can influence the formation of synaptic contacts, whether dependent or independent of GPR55, cortical neuron cultures of each genotype were exposed to different concentrations of CBD (0.3µM or 0.6µM or 1µM) at DIV9 for 24 hours. The effects on the formation of synaptic contacts were studied through immunocytochemistry, western blot, and patch clamp electrophysiology. The results show that gpr55 deletion leads to an increase in synaptic contact density at DIV14-15 but a reduction in their area and synaptophysin expression, by affecting synaptic activity. Exposure to 0.6µM and 1µM CBD results in a GPR55-dependent or partially dependent increase in synaptic contact density without affecting their area, expression of synaptic proteins, and synaptic activity. The firing frequency of neurons is decreased in a GPR55- dependent manner after exposure to 1µM CBD. These results suggest that GPR55 could be an important signal for stopping the formation of new synapses and an induction signal for the maturation of existing synapses.