Résumé : LRP-1 est un récepteur d’endocytose qui fut d’abord associé à des propriétés anti-tumorales via l’internalisation et le catabolisme de protéases matricielles. Cependant, malgré ses capacités à limiter le remodelage de la matrice extracellulaire, LRP-1 peut également coordonner la balance adhérence/dé-adhérence des cellules tumorales afin de favoriser l’invasion. LRP-1 fonctionne ainsi en régulant l’organisation du cytosquelette et le renouvellement des structures d’adhérence grâce à l’activation de la voie MEK/ERK et l’inhibition concomitante de la voie MKK7/JNK. Au cours de ce travail, nous avons cherché à déterminer comment LRP-1 peut réguler le protéome membranaire des cellules tumorales. Nos données révèlent que le taux d’intégrine β1 à la surface de carcinome thyroïdien FTC-133 est augmenté en présence de RAP, un antagoniste de LRP-1. Des immunoprécipitations et des analyses par imagerie confocale montrent que LRP-1 et l’intégrine β1 coexistent au sein des mêmes complexes biomoléculaires. Des tests d’endocytose démontrent que LRP-1 constitue un récepteur d’endocytose de l’intégrine β1 dans les FTC 133 car le nombre d’endosomes contenant l’intégrine β1 est diminué de 30% quand l’endocytose dépendante de LRP-1 est inhibée. Par ailleurs, nos données indiquent que LRP-1 est principalement impliqué dans le recyclage de l’intégrine β1 mais pas dans son ciblage au lysosome. Nous avons ainsi identifié une relation moléculaire privilégiée et originale entre LRP-1 et l’intégrine β1 dans le contexte tumoral. Ces travaux nous ont également incités à initier le développement d’un traceur bimodal original (fluorescence/Raman) permettant de suivre l’endocytose dépendante de LRP 1. / LRP-1 is a large multifunctional endocytic receptor first associated to anti-tumor properties by carrying the uptake and catabolism of extracellular matrix-associated proteinases. However, despite its ability to limit extracellular matrix remodeling, LRP-1 may also coordinate the adhesion/deadhesion balance in malignant cells to support invasion. LRP-1 acts so by regulating the cytoskeleton organization and adhesion structure turnover through the activation of MEK/ERK and concomitant inhibition of MKK7/JNK pathway.During this study, we investigated how LRP-1 is able to regulate the cell-surface proteome in malignant cells. Our data revealed that β1-integrin level is significantly increased at the cell surface of FTC-133 thyroid carcinoma upon treatment with RAP, used as LRP-1 antagonist. Immunoprecipitation experiments and confocal analysis highlight that LRP-1 and β1 integrin coexist at the same biomolecular complexes. Biochemical endocytosis assays demonstrate LRP-1 as a mediator of β1-integrin endocytosis in FTC-133 because the number of endosomes-containing β1-integrin decreases by 30% when LRP-1-mediated endocytosis is inhibited. Moreover, our data indicate that LRP-1 is mainly involved in β1-integrin recycling, but not in lysosome targeting.Overall, we identified an original molecular way between LRP-1 and β1-integrin in the tumor context. These works also allowed to initiate the development of an original bimodal molecular tracker (using both fluorescence and Raman) to study LRP-1-mediated endocytosis.

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Le TIMP-1, inhibiteur naturel des métalloprotéinases matricielles, exerce des effets pléïotropes indépendants de l'inhibition des MMPs et participe au développement de certains cancers et maladies neurodégénératives. Ces effets cytokiniques du TIMP-1 impliquent sa liaison à des récepteurs membranaires dont certains sont caractérisés, la glycoprotéine CD63/intégrine beta 1 et le complexe pro MMP-9/CD44. Cependant les acides aminés ou les domaines du TIMP-1 se liant à ces récepteurs ne sont pas identifiés. Les travaux réalisés au cours de cette thèse mettent en évidence un nouveau récepteur du TIMP-1, la protéine LRP-1. Dans les neurones corticaux murins, le TIMP-1 se fixe aux domaines DII et DIV de LRP-1, est endocyté et induit une réduction de la taille des neurites ainsi qu'une augmentation du volume des cônes de croissance. Afin de caractériser cette interaction, nous avons utilisé une approche originale de modélisation moléculaire associant les analyses de modes normaux et la dynamique moléculaire. Ces analyses in silico ont permis d'identifier un mouvement de pince entre les domaines N et C-terminaux du TIMP-1. Nous avons muté trois résidus (F12, K47 et W105) localisés dans une région essentielle d'un point vue énergétique à l'exécution de ce mouvement. Ces trois mutants n'ont pas d'effet sur la longueur du réseau neuritique et ne sont pas endocytés par LRP-1. En revanche, ils interagissent avec les 2 autres récepteurs (CD63 et proMMP-9) et reproduisent les effets du TIMP-1 sauvage. De plus, nous avons identifié une séquence de 6 acides aminés localisée dans le domaine extracellulaire I de CD63 et essentielle à la liaison avec le TIMP-1. L'ensemble de ces travaux a permis l'identification de régions impliquées dans l'interaction du TIMP-1 avec ses différents récepteurs et pourrait permettre le développement de nouveaux outils pharmacologiques ciblant les activités cytokiniques du TIMP-1. / TIMP-1, a natural inhibitor of matrix metalloproteinases, exerts pleiotropic effects independent of MMP inhibition and thus participates to the development of some cancers and neurodegenerative disorders. These cytokine-like activities require TIMP-1 binding to membrane receptors. Up to date two receptors, CD63/integrin beta 1 and proMMP-9/CD44, have been characterized. Nevertheless, TIMP-1 residues or regions binding these receptors remain unknown. In this work, we have identified the protein LRP-1 as a new receptor for TIMP 1. In mouse cortical neurons, TIMP-1 preferentially binds DII and DIV domains of LRP-1, is internalized via a LRP-1-dependent endocytosis, reduces neurite length and increases growth cone volume. To go deeper into TIMP-1/LRP-1 interaction, we used an original molecular modeling approach which combined normal mode analysis and molecular dynamic. These in silico studies allow us to point out a clamp movement between the N- and C-terminal domains of TIMP-1. Three residues localized in a region that seems essential for the movement have been mutated (F12, K47 and W105) and single mutants have been produced. These mutants do not reduce neurite outgrowth and are not internalized by LRP-1. In contrast, they interact with the two others receptors proMMP-9 and CD63 and induce associated biological effects. Furthermore, we have identified a sequence of six residues localized in the CD63 extracellular domain I and essential for TIMP 1 binding. The set of our data highlighted new regions of TIMP-1 interacting with its receptors and could lead to design novel therapeutic agents targeting the TIMP-1 cytokine like activities.

Le récepteur low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP-1) est capable d’internaliser des protéases impliquées dans la progression du cancer, et constitue donc une cible thérapeutique prometteuse. Cependant, LRP-1 peut également réguler certaines protéines membranaires. Son ciblage dans une stratégie de modulation de la protéolyse pourrait donc affecter l’adhésion et la dynamique du cytosquelette. Dans ce travail, nous avons étudié l’influence de l’invalidation de LRP-1 sur des paramètres originaux corrélés au potentiel invasif de cellules cancéreuses par microscopie à force atomique (AFM). Cette invalidation induit des changements dans la dynamique d’adhérence des cellules et dans la morphologie, tels qu’un renforcement des fibres de stress et un étalement plus prononcé, causant une augmentation de la surface et de la circularité cellulaires. L’analyse des propriétés mécaniques par AFM a montré que ces différences sont acccompagnées par une augmentation du module d’Young. De plus, les mesures montrent une diminution globale de la motilité cellulaire et une perturbation de la persistance directionnelle. Une augmentation de la force d’adhésion entre cellules invalidées pour LRP-1 et une bille fonctionnalisée à la gélatine a également été observée. Enfin, nos données de spectroscopie de force enregistrées à l’aide d’une pointe fonctionnalisée par un anticorps anti-sous-unité d’intégrine β1 montrent que l’invalidation de LRP-1 modifie la dynamique des intégrines. Dans leur ensemble, nos résultats montrent que des techniques classiquement utilisées dans l’investigation de cellules cancéreuses peuvent être couplées à l’AFM pour ouvrir l’accès à des paramètres complémentaires, pouvant faciliter la discrimination entre différents degrés de potentiel invasif. / The low-density lipoprotein receptor-related protein 1 (LRP-1) can internalize proteases involved in cancer progression and is thus considered a promising therapeutic target. However, it has been demonstrated that LRP-1 is also able to regulate membrane-anchored proteins. Thus, strategies that target LRP-1 to modulate proteolysis could also affect adhesion and cytoskeleton dynamics. Here, we investigated the effect of LRP-1 silencing on parameters reflecting cancer cells’ invasiveness by atomic force microscopy (AFM). The results show that LRP-1 silencing induces changes in the cells’ adhesion behavior, particularly the dynamics of cell attachment. Clear alterations in morphology, such as more pronounced stress fibers and increased spreading, leading to increased area and circularity, were also observed. The determination of the cells’ mechanical properties by AFM showed that these differences are correlated with an increase in Young’s modulus. Moreover, the measurements show an overall decrease in cell motility and modifications of directional persistence. An overall increase in the adhesion force between the LRP-1-silenced cells and a gelatin-coated bead was also observed. Ultimately, our AFM-based force spectroscopy data, recorded using an antibody directed against the β1 integrin subunit, provide evidence that LRP-1 silencing modifies integrin dynamics. Together, our results show that techniques traditionally used for the investigation of cancer cells can be coupled with AFM to gain access to complementary phenotypic parameters that can help discriminate between specific phenotypes associated with different degrees of invasiveness.

Φυσιολογικά επίπεδα της αγρίου τύπου απολιποπρωτεϊνης Ε (apoE) στο πλάσμα διαμεσολαβούν στην κάθαρση των αθηρογενετικών λιποπρωτεϊνών ενώ υψηλότερα επίπεδα από τα φυσιολογικά προκαλούν υπερτριγλυκεριδαιμία. Αυτή η ιδιότητα της αγρίου τύπου apoE μειώνει σημαντικά την θεραπευτική της αξία ως ένα πιθανό βιολογικό φάρμακο για την αντιμετώπιση της δυσλιπιδαιμίας. Πρόσφατα, έχει δημιουργηθεί και μελετηθεί μια μεταλλαγμένη μορφή της apoE, apoE4 [ L261A, W264A, F265A, L268A, V269A ] (apoE4mut1) με βελτιωμένες βιολογικές ιδιότητες. Συγκεκριμένα, αυτή η μεταλλαγμένη μορφή μπορεί να φέρει τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης σε φυσιολογικές τιμές χωρίς να προκαλέσει υπερτριγλυκεριδαιμία ακόμα και όταν υπερεκφράζεται. Στην παρούσα μελέτη, πραγματοποιήθηκε φαρμακοδυναμική και φαρμακοκινητική ανάλυση της apoE4mut1 σε πειραματόζωα. Με γονιδιακή μεταφορά μέσω ιού σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στον LDL υποδοχέα (LDLr-/-) και σε ποντίκια που είχαν έλλειψη στην apoE (apoE-/-), δείχθηκε οτι η δράση της apoE4mut1 ( μείωση της χοληστερόλης ) εξαρτάται από την έκφραση ενός λειτουργικού κλασσικού LDL υποδοχέα. Εφάπαξ έγχυση της apoE4mut1 συνδεδεμένης με λιποσώματα σε apoE-/- ποντίκια που ήταν σε δίαιτα δυτικού τύπου για 6 εβδομάδες αποκάλυψε οτι η εξωγενώς συντιθέμενη apoE4mut1 διατηρεί άθικτη την ικανότητά της να κανονικοποιεί τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης αυτών των ποντικιών με μια μέγιστη φαρμακολογική απόκριση που παρατηρείται σε μόλις 10 ώρες μετά την έγχυση. Ενδιαφέρον παρουσίασε το γεγονός οτι τα επίπεδα χοληστερόλης του πλάσματος παρέμειναν σημαντικώς μειωμένα για τις επόμενες 24 ώρες μετά την έγχυση της apoE4mut1- λιποσώματα. Μετρήσεις συγκεντρώσεων της apoE έδειξαν οτι η apoE4mut1 στην μορφή των πρωτεολιποσωμάτων που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχει χρόνο ημίσειας ζωής 15.8 h. Τα δεδομένα αυτά οδηγούν στο συμπέρασμα οτι η καθαρή apoE4mut1 μπορεί να αποτελέσει ένα νέο υποψήφιο φάρμακο για την άμεση αντιμετώπιση της υπερχοληστερολαιμίας σε άτομα που εκφράζουν έναν λειτουργικό LDL υποδοχέα. / Physiological levels of wild-type (wt) apolipoprotein E (apoE) in plasma mediate the clearance of cholesterol-rich atherogenic lipoprotein remnants while higher than normal plasma apoE concentrations fail to do so and trigger hypertriglyceridemia. This property of wt apoE reduces significantly its therapeutic value as a potential biological drug for dyslipidemia. Recently, we reported the generation of a recombinant apoE variant, apoE4 [L261A, W264A, F265A, L268A, V269A] (apoE4mut1) with improved biological functions. Specifically, this variant can normalize high plasma cholesterol levels without triggering hypertriglyceridemia, even at supraphysiological levels of expression. In the present study we performed pharmacodynamic and pharmacokinetic analysis of apoE4mut1 in experimental mice. Using adenovirus-mediated gene transfer in LDL receptor deficient (LDLr-/-) and apoE deficient (apoE-/-) mice, we show that the cholesterol lowering potential of apoE4mut1 is dependent on the expression of a functional classical LDLr. Bolus infusion of apoE4mut1-containing proteoliposomes in apoE-/- mice fed western-type diet for 6 weeks indicated that exogenously synthesized apoE4mut1 maintains intact its ability to normalize the high cholesterol levels of these mice with a maximum pharmacological effect obtained at only 10 hours post-treatment. Interestingly, plasma cholesterol levels remained significantly reduced even 24 hours following intravenous infusion of apoE4mut1 proteoliposomes. Measurements of plasma apoE levels indicated that apoE4mut1 in the form of proteoliposomes used in the study has a half-life of 15.8 h. Our data suggest that purified apoE4mut1 may be an attractive new candidate for the acute correction of hypercholesterolemia in subjects expressing functional LDL receptor.

Bakgrund: Deposition av fibrillär amyloid beta 1-42 (Aβ) i hjärnan är ett välkänt kännetecken för den neurodegenerativa sjukdomen Alzheimer’s (AD). Dessa ansamlingar påverkar pericyter, en celltyp involverad i blodkärlsfunktion och upprätthållande av blodhjärnbarriären (BBB). Pericyter uttrycker både receptorn low density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP-1) till vilken Aβ1-42 binder, och proteoglykanet NG2. NG2 har stor betydelse för pericyters samspel med endotelceller och i sin lösliga form (sNG2) främjar den angiogenes. Tidigare studier har visat att mängden NG2 som klyvs från pericyter förändras när de stimuleras med Aβ1-42. Syfte: Att undersöka om Aβ1-42 påverkar NG2 klyvning via LRP-1 Metod: Human brain vascular pericytes (HBVP) stimulerades med monomera, oligomera och fibrillära Aβ1-42 preparationer. Uttrycket av LRP-1 tystades med small interfering (si) LRP-1 och knockdown efficiency analyserades med Western Blot (WB). Även Aβ1-42 preparationer undersöktes med WB. Cellviabilitet mättes med laktatdehydrogenas (LDH) test och proteininnehåll med Bradford analys. Slutligen mättes mängden sNG2 i pericytmedium med hjälp av enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) baserad på electrochemiluminescence (Mesoscale). Resultat: Preparationerna med monomer och oligomer Aβ1-42 ökade NG2 klyvning. Denna Aβ1-42 inducerade ökning försvann när cellernas LRP-1 tystats. Aβ1-42 fibrillpreparationerna inhiberade däremot NG2 klyvningen oavsett närvaro av LRP-1. Aβ1-42 monomerpreparationer inducerade celldöd hos HBVP med LRP-1 men inte hos de HBVP där LRP-1 tystats, och cellviabiliteten hos HBVP ökade hos celler som stimulerats med Aβ1-42 fibrillpreparation och där LRP-1 tystats. Konklusion: Resultaten visar att Aβ1-42 monomer och oligomer påverkar NG2 klyvning via LRP-1. Däremot verkar Aβ1-42 fibrill istället påverka NG2 klyvning via en annan signalväg. Studien belyser hur Aβ1-42 kan påverka pericyter, vilket kan föreligga vaskulära förändringar kopplade till AD patologi. / Background: The deposition of fibrillar amyloid beta 1-42 (Aβ) in the brain is a well-known characteristic for the neurodegenerative Alzheimer’s disease (AD). These accumulations affect pericytes, a cell type implicated in vessel function and maintenance of the blood-brain barrier (BBB). Pericytes express both the receptor low-density lipoprotein receptor related protein 1 (LRP-1), to which Aβ1-42 binds, and the proteoglycan NG2. NG2 is important for the interaction between pericytes and endothelial cells and in its soluble form (sNG2) it promotes angiogenesis. Earlier studies have shown that the amount of NG2 shed from pericytes is altered when stimulated with Aβ1-42. Purpose: To investigate whether the Aβ1-42 influence on NG2 shedding is mediated via LRP-1. Method: Human brain vascular pericytes (HBVP) were stimulated with monomeric, oligomeric and fibrillar preparations of Aβ1-42. Expression of LRP-1 was knocked down by small interfering (si) LRP-1 silencing and knockdown efficiency was analysed with Western blot (WB). Aβ1-42 preparations were also analysed with WB. Cell viability was measured with lactate dehydrogenase (LDH) test and protein concentrations were determined with Bradford assay. Finally the amount of sNG2 in pericytemedium was measured with enzyme-linked immunosorbant assay (ELISA) baserad på electrochemiluminescence (Mesoscale) Results: Monomer and oligomer Aβ1-42 increased NG2 shedding, this Aβ1-42 induced increase was not found in HBVP with a silenced LRP-1. In contrast, fibrillar Aβ1-42 inhibited NG2 shedding regardless of LRP-1 presence. Monomer Aβ1-42 preparations induced cell death of HBVP with LRP-1 but not of HBVP without LRP-1, and cell viability of HBVP lacking LRP-1 was increased after fibrillar Aβ1-42 exposure. Conclusion: The results indicate a monomeric and oligomeric Aβ1-42 induced impact on NG2 shedding via LRP-1. However it appears as if fibrillar Aβ1-42 doesn’t affect NG2 shedding via LRP-1 but rather inhibits the process via another unknown receptor. The study highlights how Aβ1-42 can affect pericytes, which may underlie the vascular changes linked to AD pathology.