Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Introduction : L'hybridation in situ en fluorescence (FISH) est souvent utilisée pour l'étude des populations microbiennes hétérogènes. Toutefois, cette méthode n'est pas adaptée pour détecter des bactéries sous forme de spores, vue leur grande résistance aux traitements de perméabilisation conventionnels. Cependant, les bactéries formant des spores ont un rôle écologique, économique et médical important. Le but de cette étude est de développer des protocoles de perméabilisation rapides afin de détecter des spores de Bacillus par FISH. Méthodes : Un protocole pour les spores de B. megaterium a été adapté et optimisé pour les modèles choisis (B. cereus, B. atrophaeus et B. megaterium). Des sondes universelles et spécifiques ont été utilisées lors de l'hybridation. L'effet du traitement de perméabilisation a été évalué à Laide de la microscopie électronique à transmission et à balayage. Par la suite, les protocoles ont été adaptés pour permettre l'entrée de grosses molécules (comme la streptavidine) afin de permettre l'utilisation de méthode d'amplification de signal. Résultats : Avec les protocoles développés, les spores de Bacillus ont été détectées avec des sondes par FISH. La microscopie électronique à balayage a permis d'observer les différences de surface entre les spores traitées et non traitées. Des spores de Bacillus ont été détectées avec les protocoles adaptés pour la streptavidine. Conclusion : Des protocoles efficaces ont été développés pour détecter rapidement des spores de Bacillus par FISH. En utilisant cette technique, il est possible de détecter des spores de Bacillus en moins d'une heure.

La cytogénétique est une branche de la génétique qui étudie les chromosomes et leur intégrité ainsi que les conséquences de leur transmission et de leur expression. Plusieurs syndromes et maladies ont pu être expliqués par cette discipline. Certaines anomalies chromosomiques de structure ont d'ailleurs contribué à identifier des gènes, des fonctions de gènes ou à caractériser des structures chromosomiques. Dans cet ordre d'idées, nous avons utilisé deux isodicentriques du bras long du chromosome Y (idic(Y)(p11.3)) pour étudier la fonction d'une protéine du kinétochore, CENP-B, dans le mécanisme d'inactivation de kinétochore. Pour ce faire, nous avons premièrement fait une caractérisation cytogénétique des deux idic(Y)(p11.3) à l'aide des techniques de cytogénétique classique et de cytogénétique moléculaire. Nous avons ainsi déterminé approximativement le point de cassure des deux isodicentriques, soit en Yp11.3. Comme les deux chromosomes avaient une structure très semblable, mais que les patients présentaient un phénotype clinique très différent, nous avons investigué les niveaux de mosaïcisme dans différents tissus chez les deux patients. Il est connu qu'un chromosome possédant deux centromères capables de former le kinétochore peut être très instable lors des divisions cellulaires. Ainsi, la cellule a mis au point un mécanisme permettant d'inactiver un des kinétochores du chromosome dicentrique. Une récente revue a proposé que la protéine CENP-B jouerait un rôle dans ce mécanisme. Cependant, comme le chromosome Y ne possède pas la séquence d'ADN liant cette protéine, il était intéressant de vérifier si une inactivation des kinétochores avait eu lieu dans nos idic(Y)(p11.3). À l'aide d'un anticorps dirigé contre la protéine CENP-C, connue comme un marqueur de kinétochore actif, nous avons montré que plus de 40% des chromosomes dicentriques avaient subi une inactivation d'un de leur kinétochore. Enfin, la présence de la protéine CENP-B dans ces kinétochores a été étudiée. Nous avons montré que la protéine CENP-B était présente à tous les autres centromères, sauf ceux de l'idic(Y)(p11.3). Ainsi, nous proposons que la protéine CENP-B n'est pas impliquée directement dans le mécanisme d'inactivation de kinétochore du chromosome Y. Par contre, nous ne pouvons pas exclure qu'elle joue un rôle indirect, soit par une interaction protéine/protéine, soit à une étape en amont dans le mécanisme d'inactivation.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

La tolérance au froid est une propriété importante pour la survie des plantes dans les régions nordiques. Plusieurs études montrent que des gènes inductibles collectivement par le froid sont impliqués dans l'adaptation à la croissance à basse température et à l'amélioration de la tolérance au gel du blé. La caractérisation des gènes COR (gènes régulés par le froid) nous renseigne sur leurs fonctions dans l'acclimatation au froid. Les facteurs CBF (C-repeat Binding Factor) jouent un rôle important dans la régulation de l'expression de gènes par le froid. Plus de 25 différents facteurs CBF ont été identifiés chez le blé, classifiés en 10 groupes avec une origine phylogénétique commune et des caractéristiques structurales différentes. Une des hypothèses émises pour expliquer le nombre élevé de gènes CBF chez le blé est qu'il existe une spécialisation au niveau de leur expression tissulaire et cellulaire. Afin de répondre à cette possibilité, nous avons utilisé la technique sensible d'hybridation in situ pour examiner la distribution de l'expression des gènes CBF durant un traitement au froid. Des expériences préliminaires avec les gènes contrôles LTP (Lipid Transfer Protein) et Srub (Small subunit rubisco) ont permis d'optimiser la technique et de détecter l'expression de ces gènes dans les tissus appropriés. L'observation de Srub a aussi montré que les variations d'expression dépendaient du développement du tissu. La localisation du gène TaCBFIVd-B4 montre qu'il est exprimé dans les tissus vasculaires de feuilles, de coléoptiles et de collet chez les plantes exposées à 4°C tandis qu'il est présent seulement dans les tissus vasculaires de collet chez des plantes contrôles exposées à 20°C. Une augmentation d'expression a été observée particulièrement dans les cellules du mésophylle de feuilles matures à 4°C comparativement aux plantes à 20°C. La localisation des autres gènes CBF par hybridation in situ permettra de connaître leurs distributions et d'assigner des rôles spécifiques ou synergiques pour certains CBF dans le développement de la tolérance au froid d'un tissu où type cellulaire donné. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Facteur de transcription, CBF, Tolérance au froid, Hybridation in situ, Optimisation.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2008. / Bibliogr.: f. 32-36. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèses (M.Sc.)--Université de Sherbrooke (Canada), 2001. / Titre de l'écran-titre (visionné le 20 juin 2006). Publié aussi en version papier.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les bactéries, organismes les plus abondants de notre planète, ont un rôle fondamental dans le fonctionnement des écosystèmes. En dépit de leur importance, la caractérisation des communautés bactériennes (microbiotes) demeure encore aujourd’hui très incomplète. Ceci a pour origine l’impossibilité de complètement décrypter taxonomiquement et fonctionnellement les microbiotes de ces écosystèmes et donc à appréhender la diversité bactérienne dans son ensemble que ce soit par des approches culturales (avec seulement 1% de bactéries cultivables) ou par des approches metagénomiques limitées par les biais d’extraction, de séquençage et d’analyse. Les travaux entrepris dans le cadre de cette thèse visent à développer une nouvelle voie exploratoire passant par le fractionnement des microbiotes afin d’en étudier séparément les génomes des différentes populations ou groupes de populations, leur somme devant permettre de reconstituer un metagénome complet. Cet objectif requiert le développement d’un outil pour la sélection spécifique de bactéries (sur des critères taxonomiques ou fonctionnels) et leur isolement du reste des microorganismes non ciblés. Les travaux de thèse ont porté sur le développement d’une approche de marquage magnétique des bactéries basée sur l’hybridation moléculaire (hybridation in situ) complétée par celui d’un outil de tri microfluidique. Deux méthodes ont été développées, MISH et HCR, ciblant le gène de l’ARNr 23S, chacune reposant sur la formation, lors du processus d’hybridation, d’une structure secondaire en arborescence (MISH) ou ordonnée (HCR) permettant le greffage de nanoparticules magnétiques. Les résultats obtenus illustrent le potentiel des deux approches d’abord pour le marquage spécifique de bactéries cibles (E.coli et Pseudomonas putida) en conditions de culture au laboratoire puis dans un second temps dans des échantillons de sol. Le tri microfluidique a également été optimisé par le développement d’un nouveau dispositif de tri magnétique permettant la séparation des cellules marquées sous flux continu faisant appel à l’injection d’un polymère composite magnétique pour intégrer au fond du microcanal une série de bandes parallèles magnétiques. La fonctionnalité du dispositif a été démontrée, sa simplicité de fabrication en faisant un outil de choix pour une application en routine dans les laboratoires d’écologie microbienne. En dépit de résultats prometteurs toute cette nouvelle approche d’étude de la diversité bactérienne environnementale nécessite encore de nombreuses étapes d’optimisation. / Bacteria, the most abundant organisms on our planet, have a fundamental role in ecosystem functioning. Despite their importance, the characterization of bacterial communities is today still incomplete. This is due to the impossibility of completely decomposing taxonomically and functionally the microbial communities of these ecosystems and as a consequence to apprehend the whole bacterial diversity, either by cultural approaches (with only 1% of culturable bacteria) or by metagenomic, a limited approaches cause by biases in extraction, sequencing and analysis. The work undertaken in this thesis aims to develop a new exploratory pathway through the fractionation of microbiota in order to study separately genomes of different populations or groups of populations. Their sum should enable reconstitution of complete metagenome. This objective requires the development of a tool for the specific selection of bacteria (on taxonomic or functional criteria) and their isolation from the rest of the non-target microorganisms. The thesis work focused on the development of a magnetic labeling approach for bacteria based on molecular hybridization (in situ hybridization) complete by development of a microfluidic cell-sorting tool. Two methods have been developed, MISH and HCR, targeting the 23S rRNA gene, each based on the formation, during the hybridization process, of a secondary random structure (MISH) or organized structure (HCR) enabling binding to magnetic nanoparticles. Results obtained illustrate the potential of the two approaches initially for the specific labeling of target bacteria (E.coli and Pseudomonas putida) under laboratory conditions and then in soil samples. The microfluidic sorting was also optimized by the development of a novel magnetic cell-sorting device allowing the separation of the labeled cells under continuous flow using the injection of a magnetic composite polymer to integrate a series of magnetic parallel strips at the bottom of the microchannel. The proper functioning of the sorting device has been demonstrated, its simple production making it a tool of choice for a routine application in laboratories of microbial ecology. Despite promising results all this new approach for studying environmental bacterial diversity is still requiring many optimization steps.

L'ennoyage est un phénomène courant qui se répercute sur les végétaux en diminuant leur croissance, leur développement et leur régénération. Il entraîne une forte diminution du taux d'oxygène (hypoxie) dans le compartiment racinaire résultat de l'excès d'eau dans le sol. Face à ce stress, certaines plantes sont capables intensifier leur métabolisme anaérobie et développer des adaptations morphologiques (lenticelles hypertrophiées, aérenchymes, racines adventives). Le chêne sessile (Quercus petraea Matt L.) et le chêne pédonculé (Quercus robur L.) présentent une différence de tolérance à l'ennoyage du sol mais sont génétiquement proches. Cependant, il existe peu de connaissances sur les processus physiologiques mis en place par ces deux espèces durant ce stress. La croissance ainsi que certains changements morphologiques, anatomiques et physiologiques étudiés chez les deux espèces en réponse à un ennoyage, ont confirmé que le chêne sessile était davantage sensible à ce stress. Le chêne pédonculé, espèce plus tolérante, parvient à maintenir son statut hydrique de même que son activité photosynthétique plus longtemps et à des niveaux moins critiques que le sessile. L'hémoglobine non-symbiotique améliore la survie des plantes en conditions d'hypoxie en interagissant avec le monoxyde d'azote (NO). Le clonage d'une hémoglobine non-symbiotique chez le chêne sessile a permis d'isoler le gène QpHb1 codant pour une protéine de 161 acides aminés et présentant toutes les caractéristiques communes aux hémoglobines non-symbiotiques de classe 1. Chez les deux espèces, QpHb1 est davantage exprimé dans les racines que dans la tige ou les feuilles, suggérant un rôle particulier dans ce tissu. L'expression de QpHb1 analysée par Northern blotting a montré une chute d'expression dans les racines dès les premières heures de stress chez le chêne sessile qui se poursuit durant toute la durée de l'expérience (28 jours). Alors que chez le chêne pédonculé, l'expression de QpHb1 suit un schéma plus complexe : on observe un pic d'expression après 1h d'ennoyage suivi d'une forte inhibition après 3h. Cette régulation pourrait être synonyme d'une implication de l'hémoglobine non-symbiotique dans la signalisation rapide du stress et par conséquent dans la mise en place de la tolérance. D'ailleurs sa localisation par hybridation in situ au niveau racinaire a montré que QpHb1 se situait au niveau des cellules du protoderme, pouvant suggérer un rôle dans la détection des modifications de la rhizosphère mais aussi au niveau du protoxylème qui pourrait lui permettre de participer à la signalisation entre l'appareil racinaire et l'appareil aérien via la S-nitrosylation. Dans la réponse à un ennoyage de plusieurs semaines, le chêne pédonculé met en place des adaptations (aérenchymes, lenticelles hypertrophiées et racines adventives) et exprime davantage QpHb1 que le chêne sessile notamment dans les racines adventives. La régulation spatio-temporelle de QpHb1 pourrait être impliquée dans la capacité de tolérance ainsi que dans la cascade de signalisation menant au développement de ces adaptations.