Este estudo visou quantificar requerimentos térmicos durante a dormência de gemas de macieiras contrastantes em necessidade de frio hibernal (Castel Gala e Royal Gala), para desenvolver um modelo biológico teórico de predição da brotação, em condições subtropicais. Brindilas de macieiras foram coletadas em pomares de Papanduva-SC, de março a julho de 2009, 2010 e 2011. As estacas foram submetidas a diversas condições térmicas controladas, para determinar as exigências de intensidade e duração de frio (3, 6, 9 e 12°C, em 2009), o efeito de ciclos diários de temperatura (3/15°C, por 6/18h, 12/12h ou 18/6h, em 2010) e ondas de calor no período hibernal (1 ou 2 dias por semana a 25°C ou 7 dias a 25°C no início ou meio da endodormência, em 2011). Periodicamente, parte das estacas de cada tratamento foi transferida para 25°C, para avaliação diária da brotação das gemas apicais e laterais. Os dados de brotação foram analisados pelos parâmetros de brotação máxima, precocidade e uniformidade, estimados pela função de Gompertz. A temperatura base (Tb) de ambas cultivares foi determinada avaliando a brotação a 3, 5, 7, 9, 10, 11 e 12°C, após 1.512 horas de frio (HF). As gemas laterais foram controladas, principalmente, pela paradormência. A entrada em endodormência das gemas apicais foi mais efetiva em temperaturas oscilantes (3/15°C) que em frio constante (3°C), necessitando 48 a 72 HF em „Castel Gala‟ e 120 a 165 HF em „Royal Gala‟. A dormência foi mais superficial em „Castel Gala‟ (40% de brotação no período de máxima endodormência) que em „Royal Gala‟ (brotação mínima nula ou próxima de zero). A saída da endodormência ocorreu com 300 HF em „Castel Gala‟ e 600 HF em „Royal Gala‟, com faixas ótimas de temperaturas de 3 a 12°C e 3 a 6°C, respectivamente. Ondas de calor com mais de 36 h na endodormência causaram aumento da necessidade de HF, anulando parte do frio acumulado. A precocidade e uniformidade de brotação foram mais regulares depois de suprido o frio exigido por cada genótipo. A Tb para estimar soma térmica na ecodormência de ambas cultivares é de 3 a 5°C. Desenvolveu-se um modelo teórico biológico do processo de dormência considerando, em conjunto, as respostas de indução e superação da endodormência e de ecodormência, em gemas de macieira. / The objective of this work was to quantify the thermal requirements during the dormancy of apple tree buds with contrasting winter chill needs (Castel Gala and Royal Gala), in order to develop a theoretical biological model for predicting budburst under subtropical conditions. Apple twigs were collected from an orchard in Papanduva-SC, from March to July of 2009, 2010 and 2011. The twigs were exposed to various controlled experimental conditions, in order to determine the requirements of intensity and duration of chilling (3, 6, 9 and 12°C, in 2009), the effect of different daily cycles of temperature (3/15°C for 6/18h, 12/12h or 18/6h, in 2010) and heat waves during the winter period (one or two days per week at 25°C, or 7 days at 25 °C at the beginning or middle of dormancy, in 2011). Periodically, a portion of twigs in each treatment was transferred to 25°C, for budburst evaluation in apical and lateral buds. Budburst data were evaluated through maximum budburst, precocity and uniformity, estimated by the Gompertz function. The base temperature of both cultivars was determined by budburst at 3, 5, 7, 9, 10, 11 and 12 °C, after a period of 1,512 chilling hours (CH). The results showed that the lateral buds were controlled mainly by paradormancy. The onset of apical bud endodormancy was more effective under fluctuating thermal conditions (3/15°C), when compared to constant chill (3°C), requiring 48-72 CH for Castel Gala and 120-165 CH for „Royal Gala‟. Dormancy of „Castel Gala‟ was more superficial (40% budburst at maximum endodormancy depth) than that of „Royal Gala‟ (zero or near zero minimum budburst). „Castel Gala‟ buds overcame endodormancy after approximately 300 CH, while „Royal Gala‟ buds required 600 CH. Optimum chill temperature ranged between 3 and 6°C in „Royal Gala‟, but may be up to 12°C in „Castel Gala‟. Heat waves lasting over 36 h during endodormancy resulted in an increase of CH, canceling part of the accumulated chill. Budburst precocity and uniformity were more regular after the chill requirements of each genotype were met. The base temperature for thermal sum during ecodormancy is between 3 and 5°C for both cultivars. A theoretical biological model of the dormancy process in apple buds was developed, including details of the onset and overcoming stages of endodormancy and ecodormancy in apple buds. 2

Este estudo visou quantificar requerimentos térmicos durante a dormência de gemas de macieiras contrastantes em necessidade de frio hibernal (Castel Gala e Royal Gala), para desenvolver um modelo biológico teórico de predição da brotação, em condições subtropicais. Brindilas de macieiras foram coletadas em pomares de Papanduva-SC, de março a julho de 2009, 2010 e 2011. As estacas foram submetidas a diversas condições térmicas controladas, para determinar as exigências de intensidade e duração de frio (3, 6, 9 e 12°C, em 2009), o efeito de ciclos diários de temperatura (3/15°C, por 6/18h, 12/12h ou 18/6h, em 2010) e ondas de calor no período hibernal (1 ou 2 dias por semana a 25°C ou 7 dias a 25°C no início ou meio da endodormência, em 2011). Periodicamente, parte das estacas de cada tratamento foi transferida para 25°C, para avaliação diária da brotação das gemas apicais e laterais. Os dados de brotação foram analisados pelos parâmetros de brotação máxima, precocidade e uniformidade, estimados pela função de Gompertz. A temperatura base (Tb) de ambas cultivares foi determinada avaliando a brotação a 3, 5, 7, 9, 10, 11 e 12°C, após 1.512 horas de frio (HF). As gemas laterais foram controladas, principalmente, pela paradormência. A entrada em endodormência das gemas apicais foi mais efetiva em temperaturas oscilantes (3/15°C) que em frio constante (3°C), necessitando 48 a 72 HF em „Castel Gala‟ e 120 a 165 HF em „Royal Gala‟. A dormência foi mais superficial em „Castel Gala‟ (40% de brotação no período de máxima endodormência) que em „Royal Gala‟ (brotação mínima nula ou próxima de zero). A saída da endodormência ocorreu com 300 HF em „Castel Gala‟ e 600 HF em „Royal Gala‟, com faixas ótimas de temperaturas de 3 a 12°C e 3 a 6°C, respectivamente. Ondas de calor com mais de 36 h na endodormência causaram aumento da necessidade de HF, anulando parte do frio acumulado. A precocidade e uniformidade de brotação foram mais regulares depois de suprido o frio exigido por cada genótipo. A Tb para estimar soma térmica na ecodormência de ambas cultivares é de 3 a 5°C. Desenvolveu-se um modelo teórico biológico do processo de dormência considerando, em conjunto, as respostas de indução e superação da endodormência e de ecodormência, em gemas de macieira. / The objective of this work was to quantify the thermal requirements during the dormancy of apple tree buds with contrasting winter chill needs (Castel Gala and Royal Gala), in order to develop a theoretical biological model for predicting budburst under subtropical conditions. Apple twigs were collected from an orchard in Papanduva-SC, from March to July of 2009, 2010 and 2011. The twigs were exposed to various controlled experimental conditions, in order to determine the requirements of intensity and duration of chilling (3, 6, 9 and 12°C, in 2009), the effect of different daily cycles of temperature (3/15°C for 6/18h, 12/12h or 18/6h, in 2010) and heat waves during the winter period (one or two days per week at 25°C, or 7 days at 25 °C at the beginning or middle of dormancy, in 2011). Periodically, a portion of twigs in each treatment was transferred to 25°C, for budburst evaluation in apical and lateral buds. Budburst data were evaluated through maximum budburst, precocity and uniformity, estimated by the Gompertz function. The base temperature of both cultivars was determined by budburst at 3, 5, 7, 9, 10, 11 and 12 °C, after a period of 1,512 chilling hours (CH). The results showed that the lateral buds were controlled mainly by paradormancy. The onset of apical bud endodormancy was more effective under fluctuating thermal conditions (3/15°C), when compared to constant chill (3°C), requiring 48-72 CH for Castel Gala and 120-165 CH for „Royal Gala‟. Dormancy of „Castel Gala‟ was more superficial (40% budburst at maximum endodormancy depth) than that of „Royal Gala‟ (zero or near zero minimum budburst). „Castel Gala‟ buds overcame endodormancy after approximately 300 CH, while „Royal Gala‟ buds required 600 CH. Optimum chill temperature ranged between 3 and 6°C in „Royal Gala‟, but may be up to 12°C in „Castel Gala‟. Heat waves lasting over 36 h during endodormancy resulted in an increase of CH, canceling part of the accumulated chill. Budburst precocity and uniformity were more regular after the chill requirements of each genotype were met. The base temperature for thermal sum during ecodormancy is between 3 and 5°C for both cultivars. A theoretical biological model of the dormancy process in apple buds was developed, including details of the onset and overcoming stages of endodormancy and ecodormancy in apple buds. 2

Este estudo visou quantificar requerimentos térmicos durante a dormência de gemas de macieiras contrastantes em necessidade de frio hibernal (Castel Gala e Royal Gala), para desenvolver um modelo biológico teórico de predição da brotação, em condições subtropicais. Brindilas de macieiras foram coletadas em pomares de Papanduva-SC, de março a julho de 2009, 2010 e 2011. As estacas foram submetidas a diversas condições térmicas controladas, para determinar as exigências de intensidade e duração de frio (3, 6, 9 e 12°C, em 2009), o efeito de ciclos diários de temperatura (3/15°C, por 6/18h, 12/12h ou 18/6h, em 2010) e ondas de calor no período hibernal (1 ou 2 dias por semana a 25°C ou 7 dias a 25°C no início ou meio da endodormência, em 2011). Periodicamente, parte das estacas de cada tratamento foi transferida para 25°C, para avaliação diária da brotação das gemas apicais e laterais. Os dados de brotação foram analisados pelos parâmetros de brotação máxima, precocidade e uniformidade, estimados pela função de Gompertz. A temperatura base (Tb) de ambas cultivares foi determinada avaliando a brotação a 3, 5, 7, 9, 10, 11 e 12°C, após 1.512 horas de frio (HF). As gemas laterais foram controladas, principalmente, pela paradormência. A entrada em endodormência das gemas apicais foi mais efetiva em temperaturas oscilantes (3/15°C) que em frio constante (3°C), necessitando 48 a 72 HF em „Castel Gala‟ e 120 a 165 HF em „Royal Gala‟. A dormência foi mais superficial em „Castel Gala‟ (40% de brotação no período de máxima endodormência) que em „Royal Gala‟ (brotação mínima nula ou próxima de zero). A saída da endodormência ocorreu com 300 HF em „Castel Gala‟ e 600 HF em „Royal Gala‟, com faixas ótimas de temperaturas de 3 a 12°C e 3 a 6°C, respectivamente. Ondas de calor com mais de 36 h na endodormência causaram aumento da necessidade de HF, anulando parte do frio acumulado. A precocidade e uniformidade de brotação foram mais regulares depois de suprido o frio exigido por cada genótipo. A Tb para estimar soma térmica na ecodormência de ambas cultivares é de 3 a 5°C. Desenvolveu-se um modelo teórico biológico do processo de dormência considerando, em conjunto, as respostas de indução e superação da endodormência e de ecodormência, em gemas de macieira. / The objective of this work was to quantify the thermal requirements during the dormancy of apple tree buds with contrasting winter chill needs (Castel Gala and Royal Gala), in order to develop a theoretical biological model for predicting budburst under subtropical conditions. Apple twigs were collected from an orchard in Papanduva-SC, from March to July of 2009, 2010 and 2011. The twigs were exposed to various controlled experimental conditions, in order to determine the requirements of intensity and duration of chilling (3, 6, 9 and 12°C, in 2009), the effect of different daily cycles of temperature (3/15°C for 6/18h, 12/12h or 18/6h, in 2010) and heat waves during the winter period (one or two days per week at 25°C, or 7 days at 25 °C at the beginning or middle of dormancy, in 2011). Periodically, a portion of twigs in each treatment was transferred to 25°C, for budburst evaluation in apical and lateral buds. Budburst data were evaluated through maximum budburst, precocity and uniformity, estimated by the Gompertz function. The base temperature of both cultivars was determined by budburst at 3, 5, 7, 9, 10, 11 and 12 °C, after a period of 1,512 chilling hours (CH). The results showed that the lateral buds were controlled mainly by paradormancy. The onset of apical bud endodormancy was more effective under fluctuating thermal conditions (3/15°C), when compared to constant chill (3°C), requiring 48-72 CH for Castel Gala and 120-165 CH for „Royal Gala‟. Dormancy of „Castel Gala‟ was more superficial (40% budburst at maximum endodormancy depth) than that of „Royal Gala‟ (zero or near zero minimum budburst). „Castel Gala‟ buds overcame endodormancy after approximately 300 CH, while „Royal Gala‟ buds required 600 CH. Optimum chill temperature ranged between 3 and 6°C in „Royal Gala‟, but may be up to 12°C in „Castel Gala‟. Heat waves lasting over 36 h during endodormancy resulted in an increase of CH, canceling part of the accumulated chill. Budburst precocity and uniformity were more regular after the chill requirements of each genotype were met. The base temperature for thermal sum during ecodormancy is between 3 and 5°C for both cultivars. A theoretical biological model of the dormancy process in apple buds was developed, including details of the onset and overcoming stages of endodormancy and ecodormancy in apple buds. 2

Orientador: Edvaldo Aparecido Amaral da Silva / Banca: Juliana Pereira Bravo / Banca: Adriana Rodrigues Passos / Banca: João Nakagawa / Banca: Alessandro de Mello Varani / Resumo: A ocorrência de dormência se opõe ao pleno sucesso da propagação futura das espécies nativas de interesse para fins comerciais. Assim, o principal objetivo é o estudo fisiológico e molecular de sementes (embrião) de Annona crassiflora durante a superação da dormência morfofisiológica natural no campo. As sementes foram coletadas de áreas do cerrado do Estado de Minas Gerais, secas em temperatura entre 20-25ºC, em condições de laboratório, até atingirem umidade de 10% com base úmida. Foram feitas no mesmo lote de sementes a determinação da curva de embebição em água, germinação em campo, teor de água e crescimento do embrião mensal. As sementes foram colocadas em sacos de poliester com orifícios de 0,5 cm de diâmetro e, enterradas no mês de abril. Em paralelo, sementes foram colocadas para embeber em solução de giberelina (GA4) na concentração de 100μM, por oito dias e tiveram o comprimento do embrião e teor de água avaliados. Em novembro, as sementes enterradas a campo foram desenterradas e as que apresentaram rupturas no tegumento (sem protrusão radicular) tiveram o embrião isolados para a extração de RNA. Em seguida a integridade do RNA foi verificada em Bioanalyzer (Agilent 2100) e as bibliotecas foram preparadas utilizando o protocolo TruSeq RNA sample prep v2. O sequenciamento foi realizado no HiScanSQ (Illumina) e os dados gerados analisados pelo plataforma CLC Genomics Workbench versão 6.0.2 (CLC bio, Denmark) para montagem do transcriptoma referência e quantificação da expressão por valores de RPKM (Reads per Kilobase per Million of mapped reads). Os contigs foram anotados usando o programa BLAST2Go e manualmente. A semente de A. crassiflora estava totalmente embebida em torno de sete dias de embebição e o teor de água variou de acordo com as condições de umidade do solo, sendo maior no período de germinação. O crescimento do embrião iniciou-se... / Abstract: The occurrence of dormancy opposes to the success of the future propagation of species. Thus, the objective of this study was to performe physiological and molecular studies em seed of Annona crassiflora during overcoming morphological dormancy under field onditions. The seeds were collected from areas of the Cerrado biome from the Minas Gerais State, dried at room temperature until the moisture content of 10% on wet basis. The imbibtion curve, germination in the field, water content and growth of the embryo were made in the same batch of seeds. The seeds were placed in polyester bags with holes of 0.5 cm diameter, buried in April. In parallel, seeds were also imbibed in gibberellin (GA4) at a concentration of 100μM during seven days and had the embryo length measured. In October, embryos were isolated from seeds showing growth of the embryo but without radicle protrusion for RNA extraction. The integrity of the RNAs was verified in Bioanalyzer (Agilent 2100). Following, cDNA libraries were prepared using the TruSeq RNA sample prep protocol v2. Sequencing was performed in HiScanSQ (Illumina) and the analyses of the data was performed by using the CLC Genomics Workbench platform version 6.0.2 (CLC bio, Denmark) for transcriptome assembly and quantification of the expression values for RPKM (Reads per kilobase per Million of mapped reads). The contigs were anotados using the program BLAST2Go and manually. The seed is fully imbibed at seven days imbibitions, and the water content varies with soil conditions being higher during germination. The growth of the embryo starts in August and maintained until January, with peak of germination observed in November. After this period, the seeds that did not germinate formed a soil seed bank and there was no growth of the embryo. After 28 days from the start of imbibitions in GA4 the first seeds showed testa rupture indicating growth of the embryo. From the ... / Doutor

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

Submitted by Inácio de Oliveira Lima Neto (inacio.neto@inpa.gov.br) on 2018-07-13T18:48:13Z No. of bitstreams: 2 Dissertação_Versão_final_Maiby_Glorize.pdf: 1016588 bytes, checksum: 3c3807691391a5a93c63c241d7014dca (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) / Made available in DSpace on 2018-07-13T18:48:13Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Dissertação_Versão_final_Maiby_Glorize.pdf: 1016588 bytes, checksum: 3c3807691391a5a93c63c241d7014dca (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2016-10-03 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / The objective of the study was to determine if the hatching abundance of dormant forms of Cladocera, Copepoda and Rotifera vary in different light intensities and different flood times according to the variation of the water level. For this we test the following hypotheses: i) greater light intensity results in greater hatching abundance; (ii) the hatching abundance of dormant forms decreases with increasing flood time on the litter and non-litter banks. In situ experiments were carried out with sediments from Lake Tupé, Manaus-AM, Brazil. Three light conditions were tested, being 100, 50 and 1%, and the number of hatching at different flood times of sediment of the ATTZ with and without litter was verified that pass for a time without water. It was possible to verify that hatching of the dormant forms of the three groups occurs independently of the light intensity that reaches the sediment, since the different intensities will only influence the amount of egg that breaks out in each region. We also observed that the hatching of dormant forms present on the banks with and without litter increases concomitantly with the increase of the water column in the flood period. With this, it was possible to determine the variation of the abundance in the different light intensities and in the different times of flood. / O objetivo do estudo foi determinar se a abundância de eclosão das formas dormentes de Cladocera, Copepoda e Rotifera variam em diferentes intensidades de luz e diferentes tempos de inundação de acordo com a variação do nível da água. Para isso testamos as seguintes hipóteses: i) maior intensidade de luz resulta em maior abundância de eclosão; ii) a abundância de eclosão das formas dormentes diminui com o aumento do tempo de inundação nas margens com e sem serapilheira. Foram realizados experimentos in situ com sedimentos do lago Tupé, Manaus-AM, Brasil. Foram testadas três condições de luz, sendo 100, 50 e 1%, e verificado o número de eclosão em diferentes tempos de inundação de sedimentos da ATTZ com e sem serapilheira que passam por um tempo sem água. Foi possível verificar que ocorre eclosão das formas dormentes dos três grupos independente da intensidade de luz que chega ao sedimento, uma vez que as diferentes intensidades só vão influenciar na quantidade de ovo que eclode em cada região. Também verificamos que a eclosão das formas dormentes presentes nas margens com e sem serapilheira aumenta concomitantemente com o aumento da coluna d’água no período de enchente. Com isso foi possível determinar a variação da abundância nas diferentes intensidades de luz e nos diferentes tempos de inundação.

A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido. / Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.

A macieira (Malus x domestica) é uma das mais importantes frutíferas do mundo, e sua produção tem destaque na região sul do Brasil. Comparações entre padrões de expressão gênica de diferentes variedades constituem uma estratégia de alto valor científico para seu melhoramento genético. Contudo, a acurácia das análises é dependente de genes de referência estáveis para a normalização dos dados. A escolha de controles inapropriados pode resultar em determinações estatísticas e conclusões incorretas. Pelo presente trabalho, teve-se como objetivo selecionar os melhores genes-referência para estudos de expressão gênica em macieiras, via reação em cadeia da DNA polimerase quantitativa precedida de transcrição reversa (RT-qPCR). A expressão de 21 genes, incluindo tradicionais “housekeeping genes” ou genes sugeridos como constitutivos por dados de microarranjos disponíveis na literatura, foram avaliados em diferentes tecidos vegetativos e reprodutivos da cultivar ‘Gala’ de macieira. Para todos os genes, as combinações de primers testadas permitiram amplificações específicas e curvas de eficiência apropriadas. A estabilidade dos genes foi determinada por dois diferentes algoritmos estatísticos, geNorm e NormFinder. Os resultados permitiram concluir que, para os tecidos e condições avaliadas, EF1β, MDH, SAND, THFS e WD40 são os melhores genes normalizadores para quantificação relativa da abundância de transcritos de interesse em diferentes tecidos-alvos de macieira. A expressão de PAL foi utilizada para validação dos controles selecionados. Combinações específicas de dois ou três genes-referência demonstraram ser suficientes para a normalização dos dados em cada conjunto de amostras analisado. Finalmente, a expressão do gene MDP0000232313 ou MdDAM6, potencial gene MADS-box associado à dormência em macieira, foi avaliada em gemas da cultivar ‘Fuji Standard’, amostradas durante o ciclo vegetativo e de dormência das plantas ao longo do ano 2009. As análises foram conduzidas via RT-qPCR e de forma relativa aos genes EF1β e WD40. Observou-se um nível basal de expressão de MdDAM6 durante o verão e um aumento de cerca de 10 vezes no inverno, refletindo sua possível função no estabelecimento e/ou manutenção do estado endodormente das gemas de macieira, uma vez que este tenha sido estabelecido. / Apple (Malus x domestica) is one of the most important fruit tree crop in the world, and its production is prominent in southern Brazil. Comparisons among profiles of gene expression from different cultivars are valuable scientific tools for apple genetic breeding. However, the accuracy of the analyses is dependent on the evaluation of stable reference genes for data normalization. The inappropriate choice of controls may result in statistical significance undue or incorrect conclusions. In the present work, the objective was to select the best reference genes for gene expression studies by reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) in apple trees. The expression of 21 genes, including traditional housekeeping or genes suggested as constitutive by microarray data available in the literature, was evaluated in different vegetative and reproductive tissues of the apple ‘Gala’ cultivar. For all genes, tested combinations of primers allowed specific amplification and suitable efficiency curves. The stability of the genes was determined by two different statistical algorithms, geNorm and NormFinder. The results allowed us to conclude that, for tissues and conditions evaluated, EF1β, MDH, SAND, THFS and WD40 are the best normalizing genes for relative quantification of interest transcript abundance in different target tissues of apple. PAL expression was used to validate the selected normalizers. Specific combinations of two or three reference genes were shown to be sufficient to normalize each apple sample set analyzed. Finally, the MDP0000232313 or MdDAM6 gene expression, a potential MADS-box gene associated with dormancy in apple, was evaluated in buds of the apple 'Fuji' cultivar, sampled in the vegetative and dormant cycle of plants during the year of 2009. The analysis was performed by RT-qPCR and quantified in relation to the EF1β and WD40 normalizing genes. It a basal level of expression was observed during summer and a ten fold increase during winter, reflecting its possible function associated with the establishment and/or maintenance of the endodormant state of apple buds, once it has been established.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.

A macieira (Malus x domestica Borkh.) é uma frutífera de grande importância econômica que apresenta dormência invernal. Sua produtividade depende da superação da dormência, a qual é dependente de um somatório de períodos de frio hibernal. Este somatório é variável entre genótipos. Análises gênicas permitiram demonstrar que as vias de síntese de hormônios são diferencialmente ativadas ou reprimidas na dormência e na brotação de macieiras e outros vegetais. Apesar do avanço na compreensão da regulação gênica deste mecanismo, ainda existem carências da compreensão das vias de regulação de metabólitos nesta fase. A gema dormente é um material difícil de ser trabalhado por apresentar tecidos lignificados ricos em pigmentos e compostos fenólicos e com alta tendência à oxidação. Pelo presente trabalho, teve-se por foco o desenvolvimento de método de extração, purificação e detecção/quantificação de hormônios vegetais nas gemas dormentes de macieira e a utilização desse método na caracterização do balanço hormonal destas gemas. O método desenvolvido é sensível e preciso, com capacidade de análise de sete hormônios vegetais (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA e Zea), tanto em gemas dormentes como em tecidos pigmentados, lignificados e com alto efeito matriz. Foram coletadas amostras de gemas de macieira ao longo da dormência de cultivares com requerimento de frio contrastante (Gala Standard e Castel Gala, requerentes de 600 e 300 horas de frio, respectivamente), sobre porta-enxertos com contrastes de vigor (alto vigor, Maruba; médio vigor, Maruba/M9; e baixo vigor, M9), ao longo de um inverno com alta oferta de frio para a região (901 CH in 2016). A modulação hormonal de gemas dormentes foi semelhante entre as cultivares mesmo com fenótipos de brotação diferentes. Não houve quantificação dos hormônios propostos no começo da endodormência. ABA e GA4 foram os principais reguladores da dormência em um mecanismo muito similar ao da dormência de sementes. Porta-enxertos podem atrasar a brotação com estímulo de carga de ABA, como ocorre com M9. Isso demonstra o papel fundamental dos hormônios na dormência e como o estudo de porta-enxertos pode ajudar no desenvolvimento da pomicultura. / The apple tree (Malus x domestica Borkh.) is an economically important fruit tree that presents winter dormancy. Its productivity depends on dormancy overcoming, which is dependent on a sum of periods of chilling during winter. This sum is variable among genotypes. Genetic analyses allowed to show that hormonal biosynthetic pathways are differentially activated or repressed in dormancy and sprouting in apple trees and other plants. Despite the advances in the understanding of the genetic regulation during this mechanism, there is still a lack of knowledge about relevant metabolic pathways in this phase. The dormant bud is a difficult material to work with since it presents lignified tissues with pigments and phenolic compounds that are highly susceptible to oxidation. The present work focused on the development of a method for the extraction, purification and detection/quantification of plant hormones in apple dormant buds and the use of this method to characterize the hormonal balance in these gems. The developed method is sensitive and accurate, allowing the analyses of seven plant hormones (ABA, GA3, GA4, IAA, JA, SA and Zea) in dormant buds or in pigmented, lignified tissues highly susceptible to matrix effect. Samples of apple buds were collected along the dormancy period from cultivars with contrasting cold requirements (Gala Standard and Castel Gala, which require 600 and 300 chilling hours, respectively), on rootstocks with contrasting vigor (high vigor, Maruba; medium vigor, Maruba/M9; and low vigor, M9), during a particularly cold winter to the region (901 CH in 2016). The hormonal modulation of dormant buds was similar among cultivars even with different bud break phenotypes. There was no quantification of the proposed hormones at the beginning of endodormancy. ABA and GA4 were the main regulators of dormancy in a cold year by a mechanism very similar to that found in seed dormancy. Rootstocks may delay bud break with ABA loading stimulus, as occurs with M9. This demonstrates the key role of hormones in dormancy and how the study of rootstocks may help the development of pomiculture.