Actuellement, l’injection sous-cutanée d’insuline est le seul moyen pour les diabétiques de type 1 d’équilibrer leur glycémie. Les travaux de thèse entrent dans le cadre du projet ORAIL qui vise à développer un système de délivrance orale d’insuline basé sur la double encapsulation, et à valider l’efficacité et la sécurité de ce système in vitro dans des modèles d’épithélium intestinal, et in vivo chez le rat. Le vecteur pharmaceutique développé est composé d’une gélule contenant des nanoparticules (NPs) d’insuline formulées à partir d’acide (lactique-co-glycolique) par la méthode de double émulsion eau/huile/eau. Un premier objectif de la thèse a été d’évaluer chez le rat la gastrorésistance et l’entérosolubilité de la gélule sélectionnée pour l’encapsulation des NPs, par tomodensitométrie aux rayons X et par l’étude de la biodisponibilité de l’ibuprofène et de l’acétaminophène. Les résultats de ces travaux ont montré que la gélule est résistante en conditions gastriques et se dégrade au niveau de l’intestin. Un deuxième objectif a été de synthétiser des NPs d’insuline de taille croissante (100 à 800 nm), et d’évaluer l’internalisation de ces NPs et leur sécurité dans des cultures de cellules Caco-2, et dans des co-cultures de cellules Caco-2 et HT29-MTX. Les résultats de ces travaux ont montré que les NPs sont internalisées de manière dose et temps-dépendante, et que la taille de NPs permettant une internalisation optimale est de 400 nm après 4h d’incubation. Des études mécanistiques ont suggéré l’implication de mécanismes cavéoline-dépendants dans l’internalisation des NPs. Aucune toxicité des NPs n’a été observée quels que soient les paramètres étudiés (viabilité et mort cellulaire, augmentation de perméabilité, production de mucus, sécrétion de cytokines pro-inflammatoires). Dans une dernière partie de notre travail, nous avons montré que l’administration intraduodénale de NPs d’insuline de 200 et 400 nm à des rats diabétiques permettait une diminution significative de leur glycémie sans altération morphologique de leur paroi intestinale, données confortant nos résultats in vitro. Notre vecteur basé sur la double encapsulation semble donc être un système prometteur pour l’administration orale d’insuline. Le vecteur complet doit cependant être évalué in vivo chez le rat. / Up to date, the subcutaneous injection of insulin is the sole way available on market for blood glucose control in type 1 diabetic patients. This doctoral thesis is part of in ORAIL project, which aim is to develop a system for oral insulin delivery using double encapsulation, and validate its efficiency and safety in vitro, using an intestinal epithelium model, and in vivo in rats. The pharmaceutical carrier developed here in, comprises a capsule containing nanoparticles (NPs) of insulin formulated from poly (lactide-co-glycolide)- acid using the double emulsion water/oil/water method. The first goal of this thesis was to evaluate the gastric resistance and enteric solubility of the selected capsule in rats, using X-ray tomodensitometry and by assessing the bioavailability of ibuprofen and acetaminophen. These results have shown that this capsule is resistant to gastric conditions and degrades in the intestine. The second objective of this thesis was to synthesize insulin NPs of increasing size (100 to 800 nm), and to evaluate their internalization and security in cultured Caco-2 cells, and in co-cultures of Caco-2 cells together with HT29-MTX cells. The results of these studies have shown that NPs are internalized in a dose and time-dependent manner and that the optimal size of NPs for internalization was 400 nm after 4 h of incubation. Mechanistic studies have suggested the involvement of caveolin-dependent mechanisms in NPs internalization. No toxicity of NPs was observed regardless of the studied parameters (viability and cell death, increased permeability, mucus production, secretion of pro-inflammatory cytokines). In the last part of this thesis, we have shown that intraduodenal administration of insulin NPs of 200 nm and 400 nm, respectively, in diabetic rats, allowed a significant reduction in blood glucose level without any alteration of the intestine’s structure, therefore confirming the obtained results in vitro. In conclusion, our vector based on double encapsulation seems to be a promising system for oral administration of insulin. Furthermore, the whole vector must be evaluated in vivo in rats.

Actuellement, l'injection sous-cutanée d'insuline est le seul moyen pour les diabétiques de type 1 d'équilibrer leur glycémie. Les travaux de thèse entrent dans le cadre du projet ORAIL qui vise à développer un système de délivrance orale d'insuline basé sur la double encapsulation, et à valider l'efficacité et la sécurité de ce système in vitro dans des modèles d'épithélium intestinal, et in vivo chez le rat. Le vecteur pharmaceutique développé est composé d'une gélule contenant des nanoparticules (NPs) d'insuline formulées à partir d'acide (lactique-co-glycolique) par la méthode de double émulsion eau/huile/eau. Un premier objectif de la thèse a été d'évaluer chez le rat la gastrorésistance et l'entérosolubilité de la gélule sélectionnée pour l'encapsulation des NPs, par tomodensitométrie aux rayons X et par l'étude de la biodisponibilité de l'ibuprofène et de l'acétaminophène. Les résultats de ces travaux ont montré que la gélule est résistante en conditions gastriques et se dégrade au niveau de l'intestin. Un deuxième objectif a été de synthétiser des NPs d'insuline de taille croissante (100 à 800 nm), et d'évaluer l'internalisation de ces NPs et leur sécurité dans des cultures de cellules Caco-2, et dans des co-cultures de cellules Caco-2 et HT29-MTX. Les résultats de ces travaux ont montré que les NPs sont internalisées de manière dose et temps-dépendante, et que la taille de NPs permettant une internalisation optimale est de 400 nm après 4h d'incubation. Des études mécanistiques ont suggéré l'implication de mécanismes cavéoline-dépendants dans l'internalisation des NPs. Aucune toxicité des NPs n'a été observée quels que soient les paramètres étudiés (viabilité et mort cellulaire, augmentation de perméabilité, production de mucus, sécrétion de cytokines pro-inflammatoires). Dans une dernière partie de notre travail, nous avons montré que l'administration intraduodénale de NPs d'insuline de 200 et 400 nm à des rats diabétiques permettait une diminution significative de leur glycémie sans altération morphologique de leur paroi intestinale, données confortant nos résultats in vitro. Notre vecteur basé sur la double encapsulation semble donc être un système prometteur pour l'administration orale d'insuline. Le vecteur complet doit cependant être évalué in vivo chez le rat.

Administration par voie orale.L’insulinothérapie permet aux diabétiques de réguler leur glycémie. La thèse s’inscrit dans le projet ORAIL Bis qui vise à développer un système d’administration orale d’insuline basé sur la double encapsulation de l’insuline. Le vecteur développé est composé d’une gélule contenant des particules (NP) d’insuline formulées à partir de chitosane (CS) par coacervation complexe ou d’acide (lactique-co-glycolique) (PLGA) par double émulsion. Les objectifs de la thèse sont de stabiliser les NP de chitosane par réticulation et lyophilisation, augmenter la biodisponibilité des NP de PLGA par mucoadhésion, les transposer à l’échelle industrielle. Les résultats ont montré que la combinaison des deux approches permet de réduire la taille des NP de CS, de maintenir une charge positive, de leur conférer une stabilité et une bioefficacité. La mucoadhésion n’a pas permis d’augmenter la biodisponibilité des NP de PLGA. Une charge négative permet d’améliorer leur efficacité biologique et sont transposable à échelle industrielle. L’encapsulation de ces NP dans une gélule a permis de valider in vivo le concept de double encapsulation de l’insuline. / Insulinotherapy helps diabetics to regulate their glycaemia. This thesis is part of the ORAIL Bis project which aims to develop an oral insulin delivery system based on the double encapsulation of insulin. The developed vector is composed of a capsule containing insulin loaded particles (NPs) formulated with chitosan (CS) by complex coacervation or poly (lactic-co-glycolic) acid (PLGA) by double emulsion solvent evaporation. The objectives of the thesis are to stabilize chitosan NPs by crosslinking and freeze-drying, increase the bioavailability of NPs PLGA by mucoadhesion and transpose them to the industrial scale. Results showed that the combination of both strategies reduces the size of CS NPs, maintain a positive charge, give them stability and bioefficacy. Mucoadhesion failed to increase the bioavailability of PLGA NPs. A negative charge allows to improve their biological efficacy and are transposed to industrial scale. The encapsulation of these NPs in an alginate capsule allowed to validate in vivo the concept of double encapsulation of insulin.

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Therefore, the aim of this study was to develop and characterize nanostructured lipid carriers (NLC) containing TAC and CLO and NLC coated or not with chitosan oligosaccharide (CO), in order to increase the skin permeation and retention of drugs. NLCs were prepared by the dilution of the microemulsion and were subsequently coated with OQ. The carriers obtained contained both drugs or TAC or CLO separately. The formulations obtained were evaluated for average diameter and polydispersity index (PDI), zeta potential, drug recovery (DR), encapsulation efficiency (EE) and drug loading (DL). The drug penetration from the NLC was assessed in pig ear skin in Franz cells. Co-encapsulated NLCs showed an average diameter of 143.3 nm and PdI of 0.264. The particles showed negative zeta potential of about -40 mV. After coating with OQ, NLCs showed a significant increase in diameter (311.9 nm) (p <0.05) and positive zeta potential (24,4mV) due to the adsorption of CO on the surface of the NLC. Co-encapsulation of the drug was effective, EE was greater than 90% for both TAC and CLO. In studies of electron paramagnetic resonance (EPR) it was observed that the drugs slightly modified the dynamics of lipids in NLC on the surface of the matrix (5-DSA). There was a significant increase in the 2A// parameter, the TAC+CLO-NLC (47,1G) compared to NLCs with no drug (45,6G). When the samples were coated with CO, the lipid dynamic modified considerably. The 2A// values increased from 45.5 to 50.1 in the NLC and 46.5 to 50.7 in the TAC+CLO-NLC. The CO probably forms a frame around the nanocarriers which significantly reduces the lipids mobility. The encapsulation of the drugs increased penetration of both TAC and CLO to the skin layers when compared to non-encapsulated drugs. The NLC coated increased the amount of TAC retained in the deeper layers of the skin (approximately 1.8 times more drug). For the CLO, the coating favored retention in the EC (1.7 fold) and on the remaining skin (3 times more drug) as compared to uncoated particles. When co-encapsulated with TAC and CLO, TAC’s penetration was superior compared with the particle containing only TAC. Thus, this strategy has shown to be promising to increase TAC’s skin penetration , which is a drug that hardly passes through the SC and promote greater retention of CLO in the upper layers of the skin. The results suggest that the co-encapsulated system is a potential formulation for skin drug delivery of the drugs. / O uso de medicamentos tópicos, como o propionato de clobetasol (CLO) e o tacrolimus (TAC), são o principal tratamento para doenças inflamatórias da pele incluindo o lúpus eritematoso discóide (LED). O LED é uma doença crônica que acomete a pele e pode ter seu tratamento melhorado com o uso simultâneo desses fármacos. Entretanto, essa condição é difícil de ser tratada topicamente devido ao espessamento do estrato córneo (EC). Novas formulações como nanopartículas lipídicas e a utilização de promotores da permeação, podem melhorar a penetração de fármacos na pele e aprimorar o tratamento de diferentes patologias tópicas. Sendo assim, o objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar carreadores lipídicos nanoestruturados (CLN) contendo TAC e CLO revestidos ou não com oligossacarídeo de quitosana (OQ), visando aumentar a permeação e retenção cutânea dos fármacos. Os CLN foram preparados pelo método de diluição da microemulsão e posteriormente foram revestidos com OQ. Foram obtidos carreadores contendo ambos os fármacos e carreadores contendo TAC ou CLO separadamente. As formulações obtidas foram avaliadas quanto ao diâmetro médio, índice de polidispersão (PdI), potencial zeta, recuperação do fármaco (REC%), eficiência de encapsulação (EE%) e carga de fármaco (CF%). A penetração dos fármacos a partir dos CLN foi avaliada em pele de orelha de porco em células de Franz. Os CLN com dupla encapsulação apresentaram diâmetro médio e PdI de 143,3 nm e 0,264, respectivamente. As partículas apresentaram potencial zeta negativo de aproximadamente -40 mV. Após o revestimento com OQ, os CLN apresentaram aumento significativo de diâmetro (311,9 nm) (p<0,05) e potencial zeta positivo (24,4mV), devido a adsorção de OQ na superfície dos CLN. A co-encapsulação dos fármacos mostrou-se eficiente, sendo que a EE% foi maior que 90% tanto para o TAC quanto para o CLO nas formulações obtidas. Nos estudos de Ressonância paramagnética eletrônica (RPE) foi possível observar que os fármacos modificaram um pouco a dinâmica dos lipídios do CLN na superfície da matriz (5-DSA). Observou-se um aumento significativo do parâmetro 2A//, das CLN-TAC+CLO (47,1G) em comparação com os CLN sem fármaco (45,6G). Quando as amostras foram revestidas com OQ a dinâmica dos lipídios modificou consideravelmente. Os valores de 2A// aumentaram de 45,5 para 50,1 nos CLN e de 46,5 para 50,7 nos CLN-TAC+CLO. Ou seja, o OQ provavelmente forma uma estrutura em torno dos nanocarreadores que reduz significativamente a mobilidade dos lipídios. A encapsulação dos fármacos nas partículas aumentou tanto a penetração do TAC quanto do CLO nas camadas da pele quando comparado com os fármacos não encapsulados. O revestimento do CLN com OQ aumentou a quantidade de TAC retido nas camadas mais profundas da pele (aproximadamente 1,8 vezes mais fármaco). Para o CLO, o revestimento dos CLN favoreceu tanto a retenção no EC (1,7 vezes mais) quanto na pele remanescente (3 vezes mais fármaco) em comparação com as partículas sem revestimento. Ainda, quando os dois fármacos estavam combinados nos CLN, a penetração do TAC foi superior quando comparado com a partícula contendo apenas TAC. Sendo assim, esta estratégia mostrou-se promissora para aumentar a penetração cutânea de TAC, que é um fármaco que dificilmente atravessa o EC e promover maior retenção de CLO nas camadas superficiais da pele. Os resultados sugerem que estes sistemas com dupla encapsulação podem apresentar potenciais benefícios para o tratamento de patologias cutâneas como o LED.