Enzyme haben sich in vielen Industriezweigen zu wichtigen Werkzeugen entwickelt und könnten in Zukunft besonders aufgrund der Transformation der chemischen Industrie hin zu klimaneutralen und nachhaltigen Prozessen an Bedeutung gewinnen. Für einen flächendeckenden Einsatz fehlt es jedoch an kosteneffizienten und effektiven Reinigungsmethoden, da vor allem das Downstream Processing einen bedeutenden Anteil an den Herstellungskosten haben kann. In den vergangenen Jahren wurden eine Vielzahl neuer Verfahren etabliert, um kostenintensive, chromatografische Schritte im Downstream Processing zu ersetzen. Eine vielversprechende, jedoch wenig beachtete Technik für die Enzymreinigung ist die Schaumfraktionierung. Diese Methode beruht auf der Bildung stabiler Schaumblasen, die durch die Adsorption oberflächenaktiver Moleküle an der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche von Luftblasen entstehen. Dadurch können Moleküle im Schaum angereichert und gereinigt werden. Die Schaumfraktionierung zeichnet sich durch milde Betriebsbedingungen, geringe Betriebskosten und einen einfachen apparativen Aufbau aus. Ihr Einsatz wird jedoch durch die Verwendung von Tensiden zur Schaumerzeugung und -stabilisierung sowie die potenzielle Denaturierung und Inaktivierung von Enzymen an der Gas-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Unspezifität der Methode verhindert. Fusionsproteine, abgeleitet von natürlichen oberflächenaktiven Proteinen wie (bakteriellen) Hydrophobinen, könnten aufgrund ihrer spezifischen Wechselwirkungen mit der Luft-Wasser-Grenzfläche Tenside als Schaumbildner ersetzen und eine Generalisierung der Methode ermöglichen. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel der vorliegenden Arbeit, Fusionsproteine zu identifizieren, die eine tensidfreie, aktivitätserhaltende Schaumfraktionierung von Enzymen ermöglichen. Die Identifikation potenzieller struktureller Determinanten der Fusionsproteine, die die Aufrechterhaltung der Aktivität und die Anreicherung im Schaum bedingen, bilden eine wichtige Grundlage für künftige Untersuchungen und die Etablierung dieser Methode. Die Fusion des oberflächenaktiven Proteins Ranaspumin-2 (Rsn-2) mit dem Modellenzym β-Lactamase (Bla) resultierte in einem Fusionsprotein, das im Gegensatz zum nativen Enzym die Fähigkeit besaß, einen stabilen Schaum zu erzeugen. In Zerschäumungsversuchen konnte mit dem generierten Fusionsprotein eine tensidfreie Anreicherung in der Schaumfraktion erreicht werden. Des Weiteren gewährleistete die Fusion mit Rsn-2 einen Aktivitätserhalt während der Zerschäumung, wodurch Bla-Rsn-2 ~70% seiner Aktivität beibehielt. Vergleichende Untersuchungen mit einer Penicillin-G-Acylase (PGA) und einer Formiatdehydrogenase (RjFDH) bestätigten nicht nur die Ergebnisse, sondern außerdem die Generalisierbarkeit der Methode. Diese Untersuchungen zeigten jedoch auch den Einfluss der Enzyme auf die Schaumstabilität, sowie einen möglichen Einfluss der Fusion auf die Enzymaktivität. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse erstmals, dass ein Fusions-Tag (F-Tag) basierend auf einem oberflächenaktiven Protein ein veritables Mittel für eine gezielte Schaumfraktionierung von Enzymen sein könnte. Basierend auf diesen Untersuchungen wurden eine Vielzahl natürlicher, schaumstabilisierender Proteine als F-Tags in Zerschäumungsexperimenten untersucht. In diesen wurden alle Fusionsproteine mit variierender Ausbeute im Schaum angereichert und die F-Tags waren in der Lage, die Aktivität der fusionierten Enzyme in unterschiedlichem Ausmaß zu erhalten. Strukturmodell der Fusionsproteine in silico deuteten darauf hin, dass für eine optimale Aktivitätserhaltung vor allem ein großer Abstand zwischen den beiden Proteindomänen erforderlich war. Die Einführung einer künstlichen helikalen Linker-Domäne zwischen Enzym und F-Tag bestätigte diese Hypothese. Interessanterweise war der eingeführte kurze Linker R1 als F-Tag in der Lage, Enzyme aktivitätserhaltend und mit hoher Ausbeute im Schaum anzureichern. In darauffolgenden Schaumfraktionierungsexperimenten wurde versucht eine künstliche Verunreinigung (Grün fluoreszierendes Protein, eGFP) mithilfe der zuvor identifizierten drei besten F-Tags von den Fusionsenzymen abzutrennen. Die Ergebnisse zeigten, dass für eine nahezu vollständige Abtrennung der Verunreinigung ein komplexes Zusammenspiel aus Säulengeometrie, Prozessparametern und Zusammensetzung der Ausgangslösung notwendig war. Die Reinheit der Schaumfraktion wurde vor allem durch die Stabilität der erzeugten Schäume und der Drainage der interstitiellen Flüssigkeit bestimmt. Der Einsatz von Waschpuffer half dabei, die im Schaum eingeschlossene Ausgangslösung auszuspülen und die Reinheit der Schaumfraktion zu steigern. Die Anteile der Fusionsproteine im Schaum sowie deren Restaktivität wurde maßgeblich durch die spezifischen Wechselwirkungen der F-Tags mit der Grenzfläche bestimmt. Schlussendlich konnten aus den Untersuchungen jedoch keine spezifischen strukturellen Determinanten abgeleitet werden, die die Anreicherung der F-Tags im Schaum beeinflussten. Erstaunlicherweise zeigte der kleine Linker R1 unabhängig vom untersuchten Enzym in der Schaumfraktionierung die besten Schaumausbeuten und eine Reinheit von bis zu 96 %, während er in allen Experimenten eine Restaktivität der Enzyme von mindestens 80% gewährleisten konnte. Zusammenfassend wurden Proteine mit inhärent schaumstabilisierenden Eigenschaften identifiziert, die die aktivitätserhaltende Rückgewinnung und Reinigung von Enzymen durch die Schaumfraktionierung ermöglichten. Es wurden Eigenschaften der Fusionsproteine, mögliche Wechselwirkungen und Prozessparameter identifiziert, die die Schaumfraktionierung und den Aktivitätserhalt von F-Tag-Fusionsproteinen maßgeblich beeinflussten. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit verdeutlichen das vielversprechende Potenzial der F-Tags bei der Etablierung einer tensidfreien, aktivitätserhaltenden Schaumfraktionierung als effiziente Methode für die Aufarbeitung von Enzymen im Downstream Processing und bilden eine Grundlage für das Verständnis und die notwendigen Weiterentwicklungen der etablierten Methode.

<p>Abstract</p><p>The aim of the present study was to increase the understanding of how the cell surface properties affect the performance of unit operations used in primary protein purification. In particular, the purpose was to develop, set up and apply methods for studies of cell surface properties and cell interactions.</p><p>A method for microbial cell surface fingerprinting using surface plasmon resonance (SPR) is suggested. Four different <em>Escherichia coli </em>strains were used as model cells. Cell surface fingerprints were generated by registration of the interaction between the cells and four different surfaces, with different physical and chemical properties, when a cell suspension was flown over the surface. Significant differences in fingerprint pattern between some of the strains were observed. The physical properties of the cell surfaces were determined using microelectrophoresis, contact angle measurements and aqueous two-phase partitioning and were compared with the SPR fingerprints. The generated cell surface fingerprints and the physical property data were evaluated with multivariate data analysis that showed that the cells were separated into individual groups in a similar way using principal component analysis plots (PCA).</p><p>Studies of the behaviour of the model cells on stirred cell filtration and in an interaction test with different expanded bed adsorption (EBA) adsorbents were performed. It could be concluded that especially one of the strains behaved differently. Differences in the properties of the model cells were indicated by microelectrophoresis and aqueous two-phase partitioning which to some extent correlated with observed differences in behaviour during filtration and in an interaction test with EBA adsorbents.</p><p>The impact of high-pressure homogenisation of <em>E. coli </em>cell extract was examined, with a lab scale and a pilot scale technique. The DNA-fragmentation, visualised with agarose gel electrophoresis, and the resulting change in viscosity was analysed. A short homogenisation time resulted in increased viscosity of the process solution that correlated with increased concentration of released non-fragmented DNA. With longer homogenisation time the viscosity decreased with increasing degree of DNA-fragmentation.</p><p>The results show that strain dependant cell surface properties of<em> E. coli</em> may have an impact on several primary steps in downstream processing.</p>

Abstract The aim of the present study was to increase the understanding of how the cell surface properties affect the performance of unit operations used in primary protein purification. In particular, the purpose was to develop, set up and apply methods for studies of cell surface properties and cell interactions. A method for microbial cell surface fingerprinting using surface plasmon resonance (SPR) is suggested. Four different Escherichia coli strains were used as model cells. Cell surface fingerprints were generated by registration of the interaction between the cells and four different surfaces, with different physical and chemical properties, when a cell suspension was flown over the surface. Significant differences in fingerprint pattern between some of the strains were observed. The physical properties of the cell surfaces were determined using microelectrophoresis, contact angle measurements and aqueous two-phase partitioning and were compared with the SPR fingerprints. The generated cell surface fingerprints and the physical property data were evaluated with multivariate data analysis that showed that the cells were separated into individual groups in a similar way using principal component analysis plots (PCA). Studies of the behaviour of the model cells on stirred cell filtration and in an interaction test with different expanded bed adsorption (EBA) adsorbents were performed. It could be concluded that especially one of the strains behaved differently. Differences in the properties of the model cells were indicated by microelectrophoresis and aqueous two-phase partitioning which to some extent correlated with observed differences in behaviour during filtration and in an interaction test with EBA adsorbents. The impact of high-pressure homogenisation of E. coli cell extract was examined, with a lab scale and a pilot scale technique. The DNA-fragmentation, visualised with agarose gel electrophoresis, and the resulting change in viscosity was analysed. A short homogenisation time resulted in increased viscosity of the process solution that correlated with increased concentration of released non-fragmented DNA. With longer homogenisation time the viscosity decreased with increasing degree of DNA-fragmentation. The results show that strain dependant cell surface properties of E. coli may have an impact on several primary steps in downstream processing. / QC 20101129