The number of three-dimensional structures of potential protein targets available in several platforms such as the Protein Data Bank is subjected to a constant increase over the last decades. This observation should be an additional motivation to use structure-based methodologies in drug discovery. In the recent years, different success stories of Structure Based Drug Design approach have been reported. However, it has also been shown that a lack of druggability is one of the major causes of failure in the development of a new compound. The concept of druggability can be used to describe proteins with the capability to bind drug-like compounds. A general consensus suggests that around 10% of the human genome codes for molecular targets that can be considered as druggable. Over the years, the protein druggability was studied with a particular interest to capture structural descriptors in order to develop computational methodologies for druggability assessment. Different computational methods have been published to detect and evaluate potential binding sites at protein surfaces. The majority of methods currently available are designed to assess druggability of a static structure. However it is well known that sometimes a few local rearrangements around the binding site can profoundly influence the affinity of a small molecule to its target. The use of techniques such as molecular dynamics (MD) or Metadynamics could be an interesting way to simulate those variations. The goal of this thesis was to design a new computational approach, called JEDI, for druggability assessment using a combination of empirical descriptors that can be collected ‘on-the-fly’ during MD simulations. JEDI is a grid-based approach able to perform the druggability assessment of a binding site in only a few seconds making it one of the fastest methodologies in the field. Agreement between computed and experimental druggability estimates is comparable to literature alternatives. In addition, the estimator is less sensitive than existing methodologies to small structural rearrangements and gives consistent druggability predictions for similar structures of the same protein. Since the JEDI function is continuous and differentiable, the druggability potential can be used as collective variable to rapidly detect cryptic druggable binding sites in proteins with a variety of MD free energy methods.

Detection and analysis of protein-ligand binding sites is an important area of research in drug discovery. The FTMap web server is an established computational method for detection of binding hot spots, or regions on the protein surface that contribute disproportionately to the ligand binding free energy. This body of work primarily focuses on the utilization and advancement of FTMap for the study of protein-ligand interactions and their applications to drug discovery. First, the driving forces behind why some proteins require compounds beyond Lipinski’s rule-of-five (bRo5) guidelines are evaluated for 37 protein targets. Three types of proteins are identified on the basis of their binding hot spots, described by FTMap, and their ligand binding affinity profiles. We describe the multifaceted motivations for bRo5 drug discovery for each group of targets, including increased binding affinity, improved selectivity, decreased toxicity, and decreased off-target effects. Second, the conservation of surface binding properties in protein models is evaluated, with particular emphasis on their utility in drug discovery. Here, the probe-binding locations determined by FTMap are used to generate a binding fingerprint, and the Pearson correlation between the binding fingerprint of an experimental structure and a predicted model indicates the level of surface property conservation, without any knowledge of the protein function a priori. This analysis was performed on the protein models submitted to the Critical Assessment of Techniques for Protein Structure Prediction (CASP) rounds 12 and 14, and results were correlated with well-established structure quality metrics. Third, development of the publicly-available FTMove web server (https://ftmove.bu.edu) is described for detection of binding sites and their respective strengths across multiple different conformations of a protein. FTMove was tested on 22 proteins with known allosteric binding sites, and reliably identified both the orthosteric and allosteric binding sites as highly ranked binding sites. The results yield important insight into the dynamics and druggability of such binding sites. Finally, high throughput affinity purified, mass spectrometry data is evaluated for identification of protein-metabolite interactions (PMIs) in Escherichia coli. A detailed search for known PMIs in both the Protein Data Bank and KEGG database is described, and the resulting curated sets of 21 recovered and 37 potentially novel PMIs in E. Coli are presented. Finally, high confidence novel PMIs were evaluated with the template-based small molecule docking program, LigTBM. / 2023-01-26T00:00:00Z

El trabajo presentado en esta tesis cubre varios campos de investigación relacionados con el desarrollo de moléculas bioactivas. Se compone de cinco partes distintas que se resumen aquí. Predicción de la utilidad farmacológica de dianas terapéuticas. El desarrollo de fármacos está generalmente dirigido a inhibir la función de una proteína específica. Pero para validar esta proteína como diana terapéutica, al principio de un proyecto de descubrimiento de fármacos se tiene que saber si una molécula de tipo fármaco puede unirse con suficiente afinidad a la proteína como para alterar su función. Existen métodos que predicen si una potencial diana terapéutica es tratable o no por vía farmacológica, lo que se ha dado en llamar ‘druggability’. El problema es que estos métodos no están accesibles libremente y su validación es discutible. En la primera parte de la tesis se ha compilado un conjunto extensivo de datos de cavidades en proteínas cuyo novel de ‘druggability’ es conocido, haciéndolo accesible en una plataforma web pública (http://fpocket.sourceforge.net/dcd). Estos datos pueden ser modificados por cualquier persona que quiera contribuir al desarrollo de este conjunto de datos, aumentando su volumen o mejorando su calidad. En estudios previos, los sitios druggable se han asociado a cavidades profundas e hidrofóbicas, ignorando la importancia que tiene los grupos polares en el sitio de unión y su posible relación con la ‘druggability’. Utilizando el set de datos compilado previamente, hemos encontrado que aunque las cavidades ‘druggables’ son mas hidrofóbicas, también tienen grupos polares más expuestos pero con poca superficie de interacción. Esta observación es objeto de posteriores investigaciones en la segunda parte de la tesis. Finalmente, se ha utilizado un algoritmo de búsqueda de sitios de unión, fpocket, que empecé a desarrollar como proyecto de master. Este programa se ha utilizado para extraer todas las características de las cavidades ‘druggables’ y no ‘druggables’ y estos parámetros se han utilizado para entrenar un modelo logístico capaz de predecir si un sitio es druggable o no. Demostramos que el algoritmo y la función de puntuación desarrollado durante esta primera parte predice la ‘druggability’ de manera fiable. Los resultados son de igual calidad a los obtenidos con el único otro programa accesible con funcionalidad parecida (SiteFinder, de Schrödinger), pero nuestro programa tiene las siguientes importantes ventajas: 1) es libre; 2) es mucho más eficiente computacionalmente; y 3) trabaja sobre cavidades detectadas automáticamente por el programa, lo que permite aplicaciones a gran escala. En otras partes de la tesis se verá como su aplicación al conjunto del PDB permite novedosas aplicaciones en el área del diseño de fármacos. Análisis de movilidad de cavidades de las proteínas Existen una gran variedad de algoritmos que permiten identificar posibles sitios de unión en las estructuras tridimensionales de las proteínas. El trabajo presentado en la sección anterior de esta tesis permitía extender uno de estos algoritmos para caracterizar la ‘druggability’ de las cavidades. Un problema de gran calado en el estado actual de la técnica, tanto de detección de sitios de unión como en diseño de fármacos en general,4 es que las proteínas se tratan como un cuerpo rígido a pesar de que en realidad gozan de una gran movilidad estructural. El objetivo de esta sección era otorgar todavía otra funcionalidad a fpocket, el programa de predicción de sitios de unión, para permitir también la detección y el análisis de cavidades de proteínas en movimiento. Habitualmente, los movimientos de las proteína se pueden simular usando la dinámica molecular (MD). Una herramienta capaz de analizar conjuntos de estructuras derivados de MD u otras fuentes puede ser, por tanto, extremadamente útil para observar la aparición de cavidades transitorias y su plasticidad. Como resultado final de este trabajo, se presenta un nuevo programa informático, llamado MDpocket y que se enmarca dentro del paquete fpocket. Para cada conformación de la proteína, se ejecuta un ciclo de detección de cavidades con fpocket. Los resultados de este proceso se plasman sobre una malla tridimensional superpuesta a la estructura de la proteína. La malla puede entonces ser visualizada o analizada en mayor detalle. Lo primero se puede llevar a cabo con programas de visualización molecular tales como PyMOL, VMD o Chimera. Otra funcionalidad dentro de MDpocket es la de seguir la evolución de las propiedades de una cavidad o zona de interés (definida por el usuario) a lo largo del tiempo. Cabe destacar que MDpocket es igualmente capaz de identificar sitios de unión de moléculas tipo fármaco como pequeños canales en la matriz proteica que pueden ser importantes para la migración de pequeños ligandos como gases o moléculas de agua. Las posibles aplicaciones de MDpocket se ejemplifican en tres casos distintos. El primero es la capacidad de identificar la apertura transitoria de cavidades en el sitio de unión de ATP en la proteína HSP90. En el segundo ejemplo, se muestra como MDpocket permite identificar un canal de migración de moléculas biatómicas en mioglobina, un sistema de referencia bien conocido. Aquí se demuestra que MDpocket puede, no tan solo identificar los sitios internos de unión a Xenón, sino también los canales que se abren de forma transitoria para permitir a los ligandos migrar de un sitio a otro. En el último ejemplo, las propiedades del sitio de unión a ATP de la proteína cinasa P38 se analizaron a lo largo de una trayectoria de MD, evaluando la capacidad de MDpocket para identificar aquellas conformaciones que pueden ser particularmente útiles para realizar docking molecular. Uno de los principales problemas en docking de proteína-ligando es que el receptor generalmente se considera rígido, mientras que si se utilizan múltiples conformaciones (cristalográficas o derivadas de MD) para representar al receptor es difícil decidir a priori cuales de ellas pueden dar mejores resultados. Aquí mostramos que MDpocket se puede utilizar para seleccionar conformaciones concretas de una trayectoria de MD para usarlas en procesos de docking. Concretamente, hemos observado que la densidad hidrofóbica promedio (previamente identificada como un descriptor importante para predecir ‘druggability’) correlaciona bien con la probabilidad de que el modo de unión de ligandos pueda ser predicho correctamente. Tal como en el trabajo anterior, MDpocket se incluye dentro del proyecto fpocket y se está accesible como una herramienta libre y de código abierto. Relaciones estructura-cinética de unión El control de los tiempos en interacciones moleculares es una propiedad esencial de los sistemas bioquímicos, pero poco se conoce sobre los factores estructurales que gobiernan la cinética de los procesos de reconocimiento molecular. Partiendo de una observación realizada durante el trabajo de predicción de ‘druggability’, aquí se ha investigado el papel que átomos con poca superficie expuesta a solvente pueden jugar en los sitios de unión de la proteína. En particular, encontramos que los átomos polares en los sitios druggable son minoritarios en comparación con los átomos apolares, pero si bien pueden tener poca superficie accesible, tienden a ser mas protuberantes, lo que los hace más accesibles para establecer interacciones. Hemos establecido que esta propiedad puede estar relacionada con la cinética de unión/disociación de un ligando a su cavidad en el receptor. En diseño de fármacos, la vida media del complejo formado entre el fármaco y su diana terapéutica determina en gran medida sus efectos biológicos, pero en ausencia de relaciones estructura cinética, se hace imposible optimizar esta propiedad de forma racional. Aquí se muestra que átomos polares prácticamente enterrados (ABPAs) – un elemento comúnmente encontrado en los sitios de unión de proteínas – tienden a formar puentes de hidrógeno que están protegidos de las moléculas de agua. La formación y ruptura de este tipo de puentes de hidrógeno implica un estado de transición penalizado energéticamente porque ocurre de modo asincrónico con el proceso de deshidratación/rehidratación. En consecuencia, los puentes de hidrógeno protegidos se intercambian a velocidades lentas. Estas conclusiones se basan en el estudio computacional del proceso de unión de un pequeño ligando a un sitio de unión modelo. El receptor modelo se construyó para permitir modular tanto el grado de exposición del átomo polar como la curvatura del entorno apolar. Mediante el uso de dinámicas moleculares con constricciones y la relación de Jarzinsky, se obtuvieron los perfiles de energía libre de unión para cada cavidad. La presencia de un estado de transición (y por tanto menor velocidad de asociación/disociación) puede anticiparse mediante un simple análisis estructural tal como la medición de la superficie accesible del átomo polar o su grado de protrusión. Esto constituye una nueva y valiosa clave para interpretar y predecir relaciones estructura-actividad, que se ha puesto a prueba investigando sistemas reales. En primer lugar, analizando tanto estructuras cristalográficas depositadas en el PDB como trayectorias de dinámica molecular, se ha demostrado que aquellas moléculas de agua que forman puentes de hidrógeno con ABPAs tienden a tener menor movilidad e intercambios más lentos. Posteriormente, la validez del principio se ha demostrado en dos pares de inhibidores de la proteína Hsp90, una diana terapéutica para cáncer, para los que se han obtenido datos estructurales, termodinámicos y cinéticos mediante distintas técnicas experimentales. El acuerdo entre observables macroscópicas y los resultados de simulaciones moleculares confirma la función de los puentes de hidrógeno protegidos de solvente como trampas cinéticas e ilustra como nuestro hallazgo puede ser usado para facilitar el proceso de diseño de fármacos basado en estructura. Base de datos de cavidades: hacia el ‘pocketoma’ El trabajo presentado en el principio de la tesis perseguía un objetivo muy especifico, que se enmarca en un proyecto mayor del grupo de investigación. La herramienta de predicción de ‘druggability’ se desarrolló con el fin de cribar grandes bases de datos estructurales, tales como el PDB, identificando complejos proteína-proteína no obligados (transitorios) que contengan en su interfase una cavidad potencialmente capaz de unir moléculas de tipo fármaco. Con ello se pretende estabilizar selectivamente dicha interacción y conseguir un efecto biológico que pueda ser terapéutico. Dado que la información sobre cavidades y su druggability asociada va a ser explotadas por otras personas en el grupo en este y otro tipo de proyectos encaminados a facilitar la explotación de nuevos mecanismos de acción, es necesario crear una base de datos que contenga esta información y sea fácilmente navegable. Para empezar, se ejecutó el programa para cada una de las estructuras depositadas en el PDB, identificando todas las cavidades y extrayendo sus descriptores, entre los que se incluye la función de puntuación de druggability. Esta información se guarda de forma organizada en una base de datos relacional (pocketDB), que se relaciona con otras bases de datos tales como Uniprot y Uniref, que contienen información sobre secuencias. Igualmente, se incluyeron información sobre la estructura cuaternaria y otros recursos tales como Kegg, haciendo de pocketDB un potente recurso para filtrar de modo eficiente millones de cavidades, identificando aquellas que tengan mayor interés para cada proyecto. De modo particular, cabe destacar la aplicación de pocketDB a la identificación de cavidades ‘druggable’ situadas en la interfase de complejos transitorios proteína-proteína, resultando en 39 complejos candidatos, entre los que se recobraron 3 casos conocidos previamente, lo que valida la metodología. Además otros tres sistemas identificados, después de una inspección minuciosa, han sido seleccionados en el grupo como candidatos para realizar la prueba de concepto que valide esta nueva estrategia farmacológica. Uno de ellos está actualmente en fase de validación experimental. El ‘pocketoma’ La última sección de mi tesis presenta un proyecto que hace un uso extensivo de la base de datos de cavidades (pocketDB) previamente presentada. Dos cuestiones importantes aún persisten hoy día en el proceso de descubrimiento de fármacos y, de algún modo, contribuyen a la alta tasa de fracasos en las fases tardías del desarrollo, que normalmente se explican por la baja eficacia o el exceso de efectos secundarios (normalmente tóxicos) para el organismo. Ambas situaciones pueden ser explicadas por un fenómeno común: la falta de selectividad. Las fármacos interaccionan en la célula con una diversa variedad de macromoléculas además de con la diana terapéutica, induciendo así efectos secundarios imprevistos. Asimismo, considerar solamente una diana para nuestro fármaco puede resultar menos efectivo de lo esperado, puesto que la pérdida de función de una sola proteína diana puede ser fácilmente reemplazada debido a los mecanismos homeostáticos controlados por robustas redes de interacciones, derivando en una pérdida de eficacia de nuestra molécula. Este trabajo pretende sentar las bases para poder establecer relaciones entre macromoléculas biológicas en base a su potencial para interaccionar con una misma entidad química (fármaco). El trabajo se basa en la asunción de que cavidades similares son capaces de unir ligandos similares. Existen varios métodos que calculan la similitud entre cavidades de unión, sin embargo, hasta la fecha no se ha realizado un análisis relacional profundo de todas las cavidades en el PDB que permita establecer relaciones entre ellos. Con el fin de cumplir con los requerimientos técnicos de unos objetivos tan ambiciosos, se ha desarrollado un novedoso método de comparación de cavidades. En este particular método se considera una representación muy abstracta de la cavidad. Dicha representación reúne información tanto sobre la forma de la cavidad cómo sobre la distribución por pares de los puntos de interacción en la superficie. No obstante, la información sobre la topología exacta de la cavidad es ignorada. Tal abstracción intenta relacionar cavidades que estructuralmente están alejadas, pero que se parecen entre ellas en términos de forma y propiedades fisicoquímicas globales. Usando varios ejemplos de validación en un conjunto de cavidades de referencia, el método resulta capaz de recuperar de un gran set de cavidades aquellas más similares y relacionadas entre sí. Del mismo modo, el método demuestra ser útil para encontrar relaciones entre cavidades previamente no relacionadas y que sin embargo unen los mismos ligandos o moléculas muy similares. Esta nueva implementación se ha utilizado en un experimento de exploración a gran escala para encontrar (i) las mismas cavidades en diferentes estructuras, (ii) cavidades relacionadas y (iii) cavidades con la misma estructura de ligando. Se obtuvieron excelentes resultados para estas tres categorías. Seguidamente, se compararon entre ellas todas las cavidades encontradas en el PDB. Se desarrolló una herramienta computacional novedosa para permitir la navegación en el 'pocketoma' resultante de las comparaciones, que será posible descargar gratuitamente. Los resultados presentados muestran por primera vez un espacio global interrelacionando cavidad-ligando para todas las cavidades del PDB. Finalmente, se señalan a continuación dos aplicaciones que ponen de manifiesto el posible impacto del ‘pocketoma’ y la herramienta de navegación. En el primer ejemplo, una cavidad no caracterizada encontrada en GSK3-β fue comparada contra todas las cavidades del PDB, permitiendo obtener una variedad de cavidades, y sistemas, supuestamente relacionadas. Entre los resultados se encontraban las subunidades de unión a ADP dhaL y dhaM de la PTS dependiente di-hidroacetona cinasa. Se encontró que el sitio de unión a ADP era muy similar a la cavidad investigada en GSK3-β con una sorprendente similitud estructural entre ambos. En el último ejemplo, se navegó por el ‘pocketoma’ utilizando la herramienta visual desarrollada para tal tarea. Durante la exploración se encontró una curiosa e importante relación entre el sitio de unión de la hormona del receptor de estrógenos y una cavidad no caracterizada en la proteína Caspasa-3. Seguidamente, se realizó un estudio de docking con ligandos similares a la hormona y se procedió a realizar una extensiva dinámica molecular con el ligando en la mejor posición para verificar la estabilidad del compuesto en la cavidad de Caspasa-3. El complejo proteína-ligando estudiado resultó ser muy estable. Actualmente, el compuesto identificado se encuentra bajo validación experimental por nuestros colaboradores.