Prostate cancer (PC) is the most common cancer in Sweden. Most patients have slow growing tumors that will not cause them any harm within their lifetime, but some have aggressive tumors and will die from their disease. The ability of current clinical practice to predict tumor behavior and disease outcome is limited leading to both over- and undertreatment of PC patients. The men who die from their disease are those that develop metastases. It is therefore of great value to find better and more sensitive prognostic techniques, so that metastatic spread can be detected (or predicted) at an early time point, and so that appropriate treatment can be offered to each subgroup of patients. The aim of this thesis was to investigate if, and by what means, highly aggressive prostate tumors influence extratumoral tissues such as the non-malignant parts of the prostate and regional lymph nodes (LN), and also if any of our findings could be of prognostic importance. Gene- and protein expression analysis were the main methods used to address these questions. Our research group has previously introduced the expression Tumor Instructed (Indicating) Normal Tissue (TINT), and we use the term TINT-changes when referring to alterations in non-malignant tissue due to the growth of a tumor nearby or elsewhere in the body. In the Dunning rat PC-model we found that MatLyLu (MLL)-tumors, having a high metastatic ability, caused pre-metastatic TINT-changes that differ from those caused by AT1-tumors who have low metastatic ability. Prostate-TINT surrounding MLL-tumors had elevated immune cell infiltration, and gene ontology enrichment analysis suggested that biological functions promoting tumor growth and metastasis were activated in MLL- while inhibited in AT1-prostate-TINT. In the regional LNs we found signs of impaired antigen presentation, and decreased quantity of T cells in the MLL-model. One of the downregulated genes in the MLL-LNs was Siglec1 (also known as Cd169), expressed by LN resident macrophages that are important for antigen presentation. When examining metastasis-free LN tissue from PC patients we found CD169 expression to be a prognostic factor for PC-specific survival, and reduced expression was linked to an increased risk of PC-specific death. Some of our findings in prostate- and LN-TINT could be seen already when the tumors were very small suggesting that differences in TINT-changes between tumors with different metastatic capability can be detected early in tumor progression. However, before coming of use in the clinic more research is needed to better define a suitable panel of prognostic TINT-factors as well as the right time window of when to use them. / Populärvetenskaplig sammanfattning Prostatacancer är den i särklass vanligaste cancerformen hos män i Sverige. De flesta patienter har en mycket långsamt växande tumör som inte orsakar dem några större besvär under deras livstid, men enbart i Sverige dör ca 2500 patienter/år av sjukdomen. Det är först vid uppkomst av metastaser som sjukdomen blir dödlig. Befintliga diagnos- och prognosmetoder är otillräckliga när det gäller att uppskatta och förutse tumörens aggressivitet och risk för att bilda metastaser. Detta gör att vissa patienter inte får tillräcklig behandling eller behandlas försent medan andra behandlas i onödan. Behovet av förbättrad diagnostik är därför stort. Om vi kan hitta markörer för potentiellt metastaserande sjukdom, och i bästa fall också behandla innan metastaser uppstår, skulle det förbättra chansen för överlevnad markant. För att kunna växa och spridas behöver en tumör inte bara förbereda närliggande vävnader utan förmodligen hela kroppen. Vår hypotes är att potentiell dödliga tumörer sannolikt är bättre på detta än mer ofarliga. Man vet från studier av andra cancerformer att farliga tumörer orsakar förändringar i det organ dit cancern senare sprids. Dessa förändringar sker för att de tumörceller som senare anländer ska kunna överleva, och processen har fått namnet pre-metastatisk nisch. Bl.a. har man sett att immunsystemet hämmas och nybildning av kärl ökar. Det är vanligt att metastaser uppstår i närliggande lymfkörtlar innan uppkomst av metastaser i andra organ. Dock är väldigt lite känt om pre-metastatiska förändringar i lymfkörtlar eftersom den forskning som hittills är gjord främst har tittat på andra organ. Inom prostatacancer finns det förvånande få studier av premetastatiska nischer överhuvudtaget, och man vet därför inte om de alls förekommer eller vilka förändringar som i så fall sker. Vår grupp har tidigare myntat uttrycket TINT som står för Tumor Instructed (Indicating) Normal Tissue (TINT är ett engelskt verb som betyder färga) och syftar på förändringar i normal vävnad som inducerats av tumören, dvs. att tumörer färgar av sig på omgivningen. Det kan vara förändringar i normal vävnad nära tumören, som i det här fallet resten av prostatan, eller i vävnad långt ifrån tumören som till exempel regionala lymfkörtlar, lungor och benmärg. Syftet med det här avhandlingsarbetet var att undersöka TINT-förändringar inducerade av aggressiv cancer och se om dessa skiljer sig från TINT-förändringar inducerade av mindre farliga tumörer, samt att utvärdera om någon TINT-förändring skulle kunna användas för att prognostisera vilka patienter som har hög risk att få metastaser. Vi har använt oss av en prostatacancer-modell i råtta där vi analyserat genoch proteinuttryck i pre-metastatiska regionala lymfkörtlar, tumörer och prostata-TINT (dvs. prostatavävnad utanför tumören). TINT-förändringar inducerade av MatLyLu (MLL), en tumör med hög metastaserande förmåga, jämfördes mot TINT-förändringar inducerade av AT1, en snabbväxande tumör men med låg förmåga att bilda metastaser. Vi kunde vi se flera skillnader mellan modellerna. Genuttrycket i MLL-prostata-TINT indikerade en aktivering av cellulära funktioner som visat sig stimulera tumörväxt och spridning såsom celldelning, viabilitet, migration, invasion, och angiogenes (nybildning av kärl). I AT1-prostata-TINT var genuttrycket kopplat till samma funktioner men verkade istället inhibera dessa. Genom att titta på vävnaderna i mikroskop kunde vi se att MLL-tumörer rekryterade färre T-celler (som har en viktig funktion i immunsvaret mot tumören), men istället fler makrofager och granulocyter till både tumören och prostata-TINT (dessa typer av immunceller har visats kunna hjälpa tumörer att växa och sprida sig). MLL-tumörer hade också fler blodkärl och lymfkärl strax utanför tumören. I de regionala lymfkörtlarna från djur med MLL-tumörer visade genuttrycket tecken på försämrad antigenpresentation, samt immunhämning och/eller induktion av immuntolerans. Immuntolerans innebär att immuncellen inte längre reagerar mot det specifika antigen den blivit tolerant emot. Detta är vanligt förekommande hos individer med cancer och är ett sätt för tumören att undkomma immunförsvaret. I vävnadsprover av lymfkörtlarna kunde vi se färre antigenpresenterande celler, och liksom i tumörerna fanns det färre T-celler i MLL-modellen, något vi kunde se redan när tumörerna var väldigt små. CD169 är ett protein som bl.a. uttrycks av sinus-makrofager i lymfkörtlar. Dessa makrofager har en central funktion i att aktivera ett tumör-specifikt immunsvar. I råttmodellen kunde vi se att regionala lymfkörtlar från djur med MLL-tumörer hade lägre nivåer av CD169 än regionala lymfkörtlar från djur med AT1-tumörer, och då antalet sinus-makrofager visat sig ha prognostiskt värde i t.ex. tjocktarmscancer, ville vi se om det kunde vara så även i prostatacancer. Därför kvantifierade vi uttrycket av CD169 i metastasfria regionala lymfkörtlar från prostatacancerpatienter och såg att låga nivåer av CD169 medförde en ökad risk för att dö i prostatacancer. Sammantaget tyder resultaten på att MLL-tumören jämfört med AT1- tumören bättre lyckas förbereda omgivande vävnad för att gynna tumörväxt och spridning, både lokalt i prostatan men också längre bort från tumören i de regionala lymfkörtlarna. Våra fynd stämmer väl överens med aktuell tumörbiologisk forskning om hur tumörer påverkar sin omgivning. Något som inte visats tidigare är att miljön utanför tumören verkar skilja sig drastiskt beroende på tumörens metastaserande förmåga, samt att dessa skillnader går att se relativt tidigt under sjukdomsförloppet och förmodligen även långt bort från tumören. Vi har också visat att särskilt aggressiv prostatacancer verkar inducera en pre-metastatisk nisch i tumördränerande lymfkörtlar likt det som beskrivits i andra modellsystem och i andra cancertyper, men hittills inte i prostatacancer. Fler studier behövs för att bättre karaktärisera de förändringar som en potentiellt dödlig prostatacancer orsakar i andra vävnader, och för att ta reda på hur denna kunskap kan användas för att förbättra diagnostik och behandling.

Die invasiven und metastatischen Eigenschaften vieler Tumore werden mit einer Veränderung im physiologischen Gleichgewicht der Matrix Metalloproteinasen (MMP) und ihrer spezifischen und unspezifischen Inhibitoren in Zusammenhang gebracht. Das Ziel dieser Dissertation war es, die Wirkung von Batimastat, einem synthetischen Inhibitor der MMP, auf hormonabhängige und hormonunabhängige Prostatakarzinomzellinien sowie auf das Tumorwachstum im orthotopen Tumormodell des Dunning Tumor (R3327) zu untersuchen. Methoden: Im Zellkulturversuch wurde die Wirkung verschiedener Konzentrationen von Batimastat untersucht und die Proliferation mit dem MTT Test gemessen. Die Induktion des orthotopen Tumors erfolgte durch Inokulation von MATLyLu Zellen in die Rattenprostata (Dunning Tumor der Copenhagen Ratte). 10 Tiere wurden nach Tumorinduktion täglich mit 30 mg/kg Batimastat durch intraperitoneale Gabe behandelt, 10 weitere Ratten erhielten nur das Vehikel. Zehn Kontrolltiere blieben unbehandelt. Der Effekt auf des lokale Tumorwachstum wurden durch Bestimmung des Tumorgewichtes nach 20 Tagen definiert. Results:Batimastat zeigte eine dosisabhänige Hemmung des Wachstums der Prostatakarzinomzellinien in vitro. Bei 4000 ng/ml kam es zu einer eindeutigen Hemmung des Zellwachstums. Im Tierversuch fand sich nach 20 Tagen in der Kontrollgruppe ein mittleres Tumorgewicht von 18.9 ± 5,4 g, in der Vehikelgruppe von 22.3 ± 4,3 g und in der mit Batimastat behandelten Gruppe von 11.1 ± 2,6 g. Im Vergleich zur Kontroll- und Vehikelgruppe, zeigte sich in der Batimastatgruppe ein signifikant geringeres Tumorgewicht. Zusammenfassung: Batimastat kann das Tumorwachstum in einem Standardtiermodell des Prostatakarzinoms vermindern. Der Dunning Tumor der Copenhagen Ratte ist ein zuverlässiges Tiermodell zur weiteren Untersuchung von synthetischen Inhibitoren der MMP. / Background: Increased concentrations of metalloproteinases are associated with the invasive and metastatic behavior of several human malignant tumors. Normally, enzymatic activity is tightly regulated by nonspecific mechanisms and specific inhibitors. The aim of this dissertation was to determine the potential of a synthetic metallproteinase inhibitor, batimastat, to show its in vitro effect on hormonedependent and hormoneindependent prostate cancer cell lines and its in vivo effect on tumor growth in orthotopic cancer (R3327 Dunning tumor) in rats. Methods: In vitro, a dose response curve of batimastat was generated over 5 days using the MTT assay. Prostate cancer was injected in vivo in male Copenhagen rats by inoculating R3327 Dunning tumor cells (MATLyLu) into the ventral prostatic lobe of 30 rats. Each of 10 rats received batimastat (30 mg / kg / body weight) or vehicle once a day by i.p. application beginning the day of cell inoculation. Ten rats remained untreated. The effect on local tumor growth was evaluated by measuring tumor weights 20 days after tumor cell inoculation. Results: Significant inhibiton of tumor cell proliferation in vitro occurred at 4000 ng / ml batimastat. After orthotopic cell inoculation, tumors grew to mean weights of 18.9 ± 5,4 g in the control group without treatment, to 22.3 ± 4,3 g in the vehicle group, an to 11.1 ± 2,6 g in the treated group. In comparison to the control group and to the vehicle group, tumor weights increased significantly less under treatment with batimastat. Conclusions: Batimastat is able to reduce tumor growth in the standard prostate cancer model. Using this model, activity against cancer progression of future inhibitory agents can be reliably assessed.