Thèse ou mémoire avec insertion d'articles / La prévalence du diabète de type 2 (DT2) a pris des proportions épidémiques au cours des dernières décennies. La découverte des impacts métaboliques de la composition du microbiote intestinal a modifié notre perception des causes pathogéniques de cette maladie. Il est largement accepté qu'un changement drastique du microbiote chez les personnes obèses et atteintes de DT2 est associé à une inflammation de bas grade, une intolérance au glucose et une résistance à l'insuline. L'étude privilégiée du microbiote du côlon a laissé de côté d'autres segments intestinaux tels que l'intestin grêle qui présente également un intérêt en raison de son rôle important dans l'absorption de nutriments tels que le glucose. Ce mémoire vise à 1) identifier des bactéries à partir de biopsies duodénales de patients avec ou sans DT2 2) étudier in vitro l'activité pro ou anti-inflammatoire des bactéries tuées par la chaleur et de leur surnageant de culture à l'aide du modèle de macrophage murin J774.2. La biodiversité de nos découvertes se résume à 38 espèces de bactéries différentes et une espèce de champignon appartenant à quatre phylums principaux : Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria et Ascomycota. Les effets pro et anti-inflammatoires de ces extraits bactériens ont été évalués en mesurant la production de monoxyde d'azote (NO) en absence et en présence de LPS d'Escherichia coli sérotype O55:B5 dans un modèle in vitro. Parmi les 21 espèces de bactéries testées, la plupart d'entre elles ont induit une inflammation, tandis que leurs surnageants ont induit diverses réponses. Certains ont induit l'inflammation, d'autres étaient neutres et seul le surnageant de Bacillus thuringiensis a eu un effet anti-inflammatoire. À terme, il sera possible de valider l'effet des souches in vivo chez le ver C. elegans, le poisson zèbre et la souris permettant d'étudier leur impact sur la perméabilité intestinale et le métabolisme du glucose. / The prevalence of type 2 diabetes (T2D) has taken on epidemic proportions in recent decades. The discovery of the metabolic impacts of the composition of the intestinal microbiota has changed our perception of the pathogenetic causes of this disease. It is now well accepted that a drastic change in the microbiota in people with obesity and T2D is associated to low-grade inflammation, glucose intolerance and insulin resistance. The focus on the colonic microbiota has left out other intestinal segments such as the small intestine which is also of interest due to its important role in the absorption of nutrients such as glucose. This thesis aims to 1) identify bacteria from duodenal biopsies of patients with or without T2D 2) study in vitro the pro or anti-inflammatory activity of heat-killed bacteria and their culture supernatant using the J774.2 murine macrophage model. The biodiversity of our discoveries comes down to 38 different species of bacteria and one species of fungi belonging to four main phyla: Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria and Ascomycota. The pro and anti-inflammatory effects of these bacterial extracts were evaluated by measuring the production of nitric oxide (NO) in the absence and in the presence of LPS from Escherichia coli serotype O55:B5 in an in vitro model. Among the 21 species of bacteria tested, most of them induced inflammation, while their supernatants induced various responses. Some induced inflammation, others were neutral, and only Bacillus thuringiensis supernatant had an anti-inflammatory effect. Eventually, it will be possible to validate effects of these strains in vivo in the worm C. elegans, zebrafish and mice making it possible to study their impact on intestinal permeability and glucose metabolism.

Mon projet de doctorat a pour objet l'étude des facteurs pouvant influencer le métabolisme des médicaments et la variabilité interindividuelle dans la réponse aux médicaments. Mon projet cible plus précisément les Cytochromes P450 (CYP450), le système enzymatique majeur impliqué dans la biotransformation des médicaments. Mes travaux de recherche évaluent l'impact d’une condition pathologique, le diabète de type 2 (DT2), sur l'activité métabolique des CYP450s. Mes études comprennent un volet de métabolisme systémique chez le patient et un volet de métabolisme in vitro. Dans cette thèse, les résultats de mes recherches sont rapportés sous forme de présentation par articles. Le volet in vivo consistait en une étude de pharmacocinétique qui visait à évaluer l’impact du diabète sur l’activité métabolique de différentes isoformes des CYP450s en utilisant un cocktail de substrats-marqueurs. Des patients avec le DT2 et des sujets non diabétiques ont reçu une dose orale de notre cocktail VM/JT de substrats-marqueurs composé de caféine (CYP1A2), bupropion (CYP2B6), tolbutamide (CYP2C9), oméprazole (CYP2C19), dextrométhorphane (CYP2D6) et midazolam (CYP3A4/5) suivi d'une administration de chlorzoxazone (CYP2E1). Le protocole pour cette étude est détaillé dans l’article disponible à la section 2.1; manuscrit 1. Les concentrations plasmatiques et urinaires des médicaments marqueurs et de leurs métabolites spécifiques ont été quantifiées par LC-MS/MS suivant la méthode publiée dont l’article est disponible à l’annexe 1. Cette étude m’a permis de montrer que les patients avec le DT2 présenteraient une clairance systémique réduite via les isoformes CYP2B6, CYP2C19 et CYP3A. L’article présentant ces résultats se trouve à la section 2.1; manuscrit 2. Au cours de cette étude clinique, nous avons aussi évalué l’utilisation du 4-hydroxycholestérol comme biomarqueur endogène de l’activité du CYP3A dans une population avec le DT2 (objectif secondaire). Les conclusions démontrant la validité de ce biomarqueur sont disponibles dans l’article qui se trouve à la section 2.2; manuscrit 3. Le volet in vitro de mes travaux a permis d’évaluer au niveau du duodénum l’influence du DT2 sur l’expression de plusieurs CYP450s et transporteurs, ainsi que sur l’activité des CYP2B6, CYP2C9, CYP2J2 et CYP3A. Aucun impact significatif du DT2 n’a été mesuré sur l’expression d’ARNm des CYP450s et transporteurs testés exprimés dans des biopsies duodénales. Les niveaux d’activité mesurés à l’aide d’incubations avec des substrats-marqueurs des CYP450s dans des fractions S9 de biopsies duodénales étaient semblables chez des sujets avec le DT2 et des non diabétiques. L’article sur les résultats de ce volet in vitro est disponible à la section 2.3; manuscrit 4. Ces résultats suggèrent que les effets du diabète sur le métabolisme des substrat-marqueurs observés dans l’étude clinique peuvent s’expliquer par une modulation au niveau hépatique ou dans différentes sections de l’intestin. En accord avec ces résultats chez l’humain, notre groupe avait déjà rapporté que l’effet du diabète sur les CYP450s était isoforme et tissu spécifique chez la souris (annexe 2). L'objectif de ma thèse était de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents à la variabilité dans la réponse aux médicaments observés chez les patients diabétiques, lesquels nécessitent fréquemment une polypharmacie. Les résultats de ces travaux permettront éventuellement d’optimiser la pharmacothérapie chez ces patients. / My PhD project evaluates factors that can influence drug metabolism and interindividual variability in drug response. More precisely, my thesis focuses on the major drug metabolizing enzymes, the cytochromes P450 (CYP450). My researches evaluated the impact of a pathological condition, namely type 2 diabetes (T2D), on CYP450 metabolic activities in two parts. First, the effect of diabetes on systemic metabolism was evaluated in patients. Then, in vitro experiments enabled us to measure the impact of T2D on organ-specific or metabolism. In this thesis, my research results are presented in 4 scientific papers. The in vivo part of my PhD research consisted of a pharmacokinetic study assessing metabolic activity of different isoforms of the CYP450s using a cocktail of probe drugs in T2D patients and non-diabetic subjects. All participants of both study groups received a dose of our oral VM/JT probe drugs cocktail consisting of caffeine (CYP1A2), bupropion (CYP2B6), tolbutamide (CYP2C9), omeprazole (CYP2C19), dextromethorphan (CYP2D6) and midazolam (CYP3A4/5) followed by a dose of chlorzoxazone (CYP2E1), alone. Study procedures are detailed in the protocol article (manuscrit 1) presented in section 2.1. Plasma and urine concentrations for all probe drugs and specific metabolites were quantified using a published LC-MS/MS method that is available in annexe 1. This study showed that patients with T2D exhibited reduced systemic clearances for the isoforms CYP2B6, CYP2C19 and CYP3A. Results of this pharmacokinetic research are presented in manuscrit 2 of section 2.1. As a secondary objective, this in vivo part of my PhD project enabled us to verify the validity of 4-hydroxycholesterol as an endogenous biomarker of CYP3A activity in a population with T2D. Conclusions showing its validity as an endogenous biomarker in such population are presented in section 2.2 (manuscrit 3). The in vitro part of my doctoral project evaluated in the intestines the influence of T2D on the mRNA expression of numerous CYP450 isozymes and drug transporters, as well as on metabolic activity of CYP2B6, CYP2C9, CYP2J2 and CYP3A. Using duodenal biopsies, no significant impact of T2D was detected on the mRNA expression levels of all tested CYP450s and transporters. Activity levels measured following incubations of probe-substrates in S9 fractions of duodenal biopsies obtained from patients with T2D and non-diabetic patients were similar. Results from this in vitro study are reported in section 2.3 (manuscrit 4) of this thesis. These results obtained in human subjects are in agreement with our previously published results showing isoform- and tissue-specific effects of T2D on CYP450s in mice (annexe 2). Overall, the central theme of this thesis is to better understand the underlying mechanisms of drug response variability observed in diabetic patients, whom often require polypharmacy, in order to eventually optimize drug therapy in those patients.