No / P-cadherin serves as a major topobiological cue in mammalian epithelium. In human hair follicles (HFs), it is prominently expressed in the inner hair matrix that harbors the HF pigmentary unit. However, the role of P-cadherin in normal human pigmentation remains unknown. As patients with mutations in the gene that encodes P-cadherin show hypotrichosis and fair hair, we explored the hypothesis that P-cadherin may control HF pigmentation. When P-cadherin was silenced in melanogenically active organ-cultured human scalp HFs, this significantly reduced HF melanogenesis and tyrosinase activity as well as gene and/or protein expression of gp100, stem cell factor, c-Kit, and microphthalmia-associated transcription factor (MITF), both in situ and in isolated human HF melanocytes. Instead, epidermal pigmentation was unaffected by P-cadherin knockdown in organ-cultured human skin. In hair matrix keratinocytes, P-cadherin silencing reduced plasma membrane β-catenin, whereas glycogen synthase kinase 3 beta (GSK3β) and phospho-β-catenin expression were significantly upregulated. This suggests that P-cadherin-GSK3β/Wnt signaling is required for maintaining the expression of MITF to sustain intrafollicular melanogenesis. Thus, P-cadherin-mediated signaling is a melanocyte subtype-specific topobiological regulator of normal human pigmentation, possibly via GSK3β-mediated canonical Wnt signaling.

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(生命科学) / 甲第24822号 / 生博第502号 / 新制||生||67(附属図書館) / 京都大学大学院生命科学研究科統合生命科学専攻 / (主査)教授 上村 匡, 教授 見学 美根子, 教授 鈴木 淳 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Philosophy in Life Sciences / Kyoto University / DGAM

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第25180号 / 医博第5066号 / 新制||医||1071(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 平井 豊博, 教授 上野 英樹, 教授 金子 新 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Agricultural Science / Kyoto University / DFAM

Animal morphogenesis is largely driven by concerted changes in the shape of individual cells. However, how cell shape changes are regulated and coordinated in developing animals is not well understood. Here we show that the two perpendicular signaling gradients of the morphogens Dpp, a TGF-β homologue, and Wingless, a Wnt family member, maintain tissue homoeostasis and control cell shape changes in the developing Drosophila wing. Clones of cells lacking Dpp or Wingless signaling invaginate apically, shorten apico-basally and subsequently extrude basally without disruption of the epithelium. During early larval development, the onset of Dpp and Wingless signaling correlates with the cuboidal-to-columnar cell shape transition of wing disc cells. Gradients in apical-basal length of columnar cells correlate during late larval development with the gradients of Dpp and Wingless signaling activities. Cells receiving high levels of Dpp and Wingless signaling are most elongated and apically constricted. Low levels of Dpp and Wingless signaling correlate with a shorter and apically wider cell morphology. Dpp and Wingless signaling is cell-autonomously required for maintaining the elongated columnar cell shape of late larval wing disc cells. Overactivation of these pathways results in precocious cell elongation during early larval development. These morphogenetic responses to Dpp and Wingless require the transcription factor complexes Mad and Tcf/β-catenin, respectively, indicating that they are mediated by changes in gene expression. The morphogenetic function of Wingless is in part mediated by one of its target genes, the transcription factor Vestigial. Wingless signaling promotes an enrichment of E-cadherin at the adherens junctions, and we show that E-cadherin is required to maintain apical-basal cell length. Dpp signaling controls the subcellular distribution of the activities of the small GTPase Rho1 and the regulatory light chain of non-muscle myosin II (MRLC). Alteration of Rho1 or MRLC activity has a profound effect on apical-basal cell length. Finally, we demonstrate that a decrease in Rho1 or MRLC activity rescues the shortening of cells with compromised Dpp signaling. Our results identify cell-autonomous roles for Dpp and Wingless signaling in promoting and maintaining the elongated columnar shape of wing disc cells. Furthermore, they suggest that Dpp and Wingless signaling control cell shape by regulating the actin-MyosinII/E-cadherin network. / Morphogenese in Tieren wird in hohem Maße von konzertierten Zellformveränderungen einzelner Zellen bewirkt. Es ist jedoch noch nicht hinreichend verstanden, wie Zellformveränderungen in sich entwickelnden Tieren reguliert und koordiniert werden. Hier zeigen wir, dass die zwei zueinander senkrecht stehenden Signalgradienten der Morphogene Dpp, eines TGF-β Homologs, und Wingless, eines Mitglieds der Wnt Familie, im sich entwickelnden Drosophila-Flügel Gewebe-Homöostase aufrechterhalten und Zellformveränderungen kontrollieren. Klone von Zellen, denen Dpp oder Wingless Signalaktivität fehlt, invaginieren von ihrer apikalen Seite her, verkürzen sich in apiko-basaler Richtung und extruieren im Folgenden auf der basalen Seite des Epithels, ohne es zu zerstören. Während der frühen Larvalentwicklung korreliert das Anschalten der Dpp und Wingless Signale mit der Zellformveränderung der Flügelscheibenzellen von kuboidal zu kolumnar. Gradienten in der apiko-basalen Länge von kolumnaren Zellen korrelieren während der späten Larvalentwicklung mit den Gradienten der Dpp und Wingless Signalaktivitäten. Zellen, die hohe Werte an Dpp und Wingless Signalen empfangen, sind am meisten elongiert und apikal konstringiert. Niedrige Werte von Dpp und Wingless Signalen korrelieren mit kürzerer und apikal weiterer Zellmorphologie. Dpp und Wingless Signale werden zellautonom gebraucht für die Aufrechterhaltung der elongierten Zellform von späten larvalen Flügelscheibenzellen. Die Überaktivierung dieser Signalwege führt zu vorzeitiger Zellverlängerung während der frühen Larvalentwicklung. Diese morphogenetischen Antworten auf Dpp und Wingless benötigen die Transkriptionsfaktor-Komplexe Mad beziehungsweise Tcf/β-catenin, was darauf hindeutet, dass sie durch Änderungen in der Genexpression vermittelt werden. Die morphogenetische Funktion von Wingless wird teilweise durch eines seiner Zielgene, Vestigial, vermittelt. Wingless Signale fördern die Anreicherung von E-cadherin an den Adherensverbindungen. Wir zeigen hier, dass E-cadherin gebraucht wird, um apiko-basale Zelllänge aufrechtzuerhalten. Dpp Signale kontrollieren die subzelluläre Verteilung der Aktivitäten der kleinen GTPase Rho1 und der regulatorischen leichten Kette von nicht-muskulärem Myosin II (MRLC). Eine Änderung in der Rho1 oder MRLC Aktivität hat weitreichende Auswirkungen auf die apiko-basale Zelllänge. Schließlich zeigen wir noch, dass eine Verringerung der Rho1 oder MRLC Aktivitäten die Zellverkürzung von Dpp-Signal kompromittierten Zellen rettet. Unsere Resultate identifizieren zellautonome Rollen für Dpp und Wingless Signale in der Förderung und Aufrechterhaltung der elongierten kolumnaren Zellform von Flügelimaginalscheibenzellen. Darüber hinaus suggerieren sie, dass Dpp und Wingless Signale die Zellform durch die Regulierung des Aktin-MyosinII/E-cadherin-Netzwerks kontrollieren.

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Animal morphogenesis is largely driven by concerted changes in the shape of individual cells. However, how cell shape changes are regulated and coordinated in developing animals is not well understood. Here we show that the two perpendicular signaling gradients of the morphogens Dpp, a TGF-β homologue, and Wingless, a Wnt family member, maintain tissue homoeostasis and control cell shape changes in the developing Drosophila wing. Clones of cells lacking Dpp or Wingless signaling invaginate apically, shorten apico-basally and subsequently extrude basally without disruption of the epithelium. During early larval development, the onset of Dpp and Wingless signaling correlates with the cuboidal-to-columnar cell shape transition of wing disc cells. Gradients in apical-basal length of columnar cells correlate during late larval development with the gradients of Dpp and Wingless signaling activities. Cells receiving high levels of Dpp and Wingless signaling are most elongated and apically constricted. Low levels of Dpp and Wingless signaling correlate with a shorter and apically wider cell morphology. Dpp and Wingless signaling is cell-autonomously required for maintaining the elongated columnar cell shape of late larval wing disc cells. Overactivation of these pathways results in precocious cell elongation during early larval development. These morphogenetic responses to Dpp and Wingless require the transcription factor complexes Mad and Tcf/β-catenin, respectively, indicating that they are mediated by changes in gene expression. The morphogenetic function of Wingless is in part mediated by one of its target genes, the transcription factor Vestigial. Wingless signaling promotes an enrichment of E-cadherin at the adherens junctions, and we show that E-cadherin is required to maintain apical-basal cell length. Dpp signaling controls the subcellular distribution of the activities of the small GTPase Rho1 and the regulatory light chain of non-muscle myosin II (MRLC). Alteration of Rho1 or MRLC activity has a profound effect on apical-basal cell length. Finally, we demonstrate that a decrease in Rho1 or MRLC activity rescues the shortening of cells with compromised Dpp signaling. Our results identify cell-autonomous roles for Dpp and Wingless signaling in promoting and maintaining the elongated columnar shape of wing disc cells. Furthermore, they suggest that Dpp and Wingless signaling control cell shape by regulating the actin-MyosinII/E-cadherin network. / Morphogenese in Tieren wird in hohem Maße von konzertierten Zellformveränderungen einzelner Zellen bewirkt. Es ist jedoch noch nicht hinreichend verstanden, wie Zellformveränderungen in sich entwickelnden Tieren reguliert und koordiniert werden. Hier zeigen wir, dass die zwei zueinander senkrecht stehenden Signalgradienten der Morphogene Dpp, eines TGF-β Homologs, und Wingless, eines Mitglieds der Wnt Familie, im sich entwickelnden Drosophila-Flügel Gewebe-Homöostase aufrechterhalten und Zellformveränderungen kontrollieren. Klone von Zellen, denen Dpp oder Wingless Signalaktivität fehlt, invaginieren von ihrer apikalen Seite her, verkürzen sich in apiko-basaler Richtung und extruieren im Folgenden auf der basalen Seite des Epithels, ohne es zu zerstören. Während der frühen Larvalentwicklung korreliert das Anschalten der Dpp und Wingless Signale mit der Zellformveränderung der Flügelscheibenzellen von kuboidal zu kolumnar. Gradienten in der apiko-basalen Länge von kolumnaren Zellen korrelieren während der späten Larvalentwicklung mit den Gradienten der Dpp und Wingless Signalaktivitäten. Zellen, die hohe Werte an Dpp und Wingless Signalen empfangen, sind am meisten elongiert und apikal konstringiert. Niedrige Werte von Dpp und Wingless Signalen korrelieren mit kürzerer und apikal weiterer Zellmorphologie. Dpp und Wingless Signale werden zellautonom gebraucht für die Aufrechterhaltung der elongierten Zellform von späten larvalen Flügelscheibenzellen. Die Überaktivierung dieser Signalwege führt zu vorzeitiger Zellverlängerung während der frühen Larvalentwicklung. Diese morphogenetischen Antworten auf Dpp und Wingless benötigen die Transkriptionsfaktor-Komplexe Mad beziehungsweise Tcf/β-catenin, was darauf hindeutet, dass sie durch Änderungen in der Genexpression vermittelt werden. Die morphogenetische Funktion von Wingless wird teilweise durch eines seiner Zielgene, Vestigial, vermittelt. Wingless Signale fördern die Anreicherung von E-cadherin an den Adherensverbindungen. Wir zeigen hier, dass E-cadherin gebraucht wird, um apiko-basale Zelllänge aufrechtzuerhalten. Dpp Signale kontrollieren die subzelluläre Verteilung der Aktivitäten der kleinen GTPase Rho1 und der regulatorischen leichten Kette von nicht-muskulärem Myosin II (MRLC). Eine Änderung in der Rho1 oder MRLC Aktivität hat weitreichende Auswirkungen auf die apiko-basale Zelllänge. Schließlich zeigen wir noch, dass eine Verringerung der Rho1 oder MRLC Aktivitäten die Zellverkürzung von Dpp-Signal kompromittierten Zellen rettet. Unsere Resultate identifizieren zellautonome Rollen für Dpp und Wingless Signale in der Förderung und Aufrechterhaltung der elongierten kolumnaren Zellform von Flügelimaginalscheibenzellen. Darüber hinaus suggerieren sie, dass Dpp und Wingless Signale die Zellform durch die Regulierung des Aktin-MyosinII/E-cadherin-Netzwerks kontrollieren.

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Prostate cancer is the second-most diagnosed and fatal carcinoma for males in the United States, and better diagnostic markers and potential therapies are needed. microRNAs are small, single-stranded RNA molecules that affect protein expression at the translational level, and dysregulation can dramatically affect cell metabolism. Comparison of 736 microRNA expression levels between the poorly metastatic SV40T immortalized prostate epithelial cell line P69 to its highly tumorigenic and metastatic subline M12 identified 231 miRs that were overexpressed and 150 miRs that showed loss of expression in the M12 cell line. Further evaluation of fourteen identified miRs was accomplished using other prostate cell lines as well as laser-capture microdissected prostate samples. Inhibition of miR-147b was found to affect proliferative, migratory and invasive capabilities of M12 cells, and reduced tumour growth in nude athymic mice. AATF, an activator of the cell-cycle inhibitor p21, was identified as a target. Overexpression of miR-9 was found to affect the epithelial to mesenchymal transition through suppression of e-cadherin, a protein characterized as lost in EMT, as well as suppression of SOCS5, an attenuator of JAK-STAT signaling. Inhibition of miR-9 resulted in reduction of migratory and invasive potential, and significant reduction of tumorigenesis and metastases in male nude athymic mice. miR-17-3p was previously identified as down-regulated in prostate cancer and loss of miR-17-3p shown to cause vimentin transcriptional activation. Reverse phase microarray analysis (RPMA) identified c-KIT as a potential second mRNA target for miR-17-3p. miR-17-3p was shown to modulate not only protein levels, but also messenger RNA levels of c-KIT. Four miR-17-3p binding sites in the c-KIT mRNA were identified. Thus, a number of microRNAs involved in prostate cancer were identified, and their targets found to be highly relevant to tumour progression and could potentially be used as targets for therapy or diagnostics. Stability of microRNAs in forensically relevant biological fluids was evaluated through heat treatment, ultraviolet radiation, and chemical treatment. The dried body fluids showed some susceptibility to harsh treatment, but in most cases microRNAs were still detectable in the samples. microRNAs could represent a highly stable species for body fluid identification methods in forensic science.

La morphogenèse de la glande mammaire résulte de la coordination de différentes voies, incluant l'apoptose, la prolifération, la différenciation et la dynamique des cellules souches/progénitrices. La transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) semble être impliquée dans ces voies de signalisation. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur le facteur de transcription Slug, un gène clé régulant l'EMT, et son implication dans la morphogenèse de la glande mammaire. Dans un premier temps, en utilisant un modèle de souris transgéniques Slug-Lacz, nous avons localisé Slug dans une sous-population couvrant 10 à 20% des cellules basales du tubule et des cap cells du bourgeons terminal, coexprimant les marqueurs P-cadhérine, CK5, CD49f. Ensuite, nous avons montré par des expériences in vitro de perte et de gain de fonction, que Slug régulait la différenciation et la prolifération des cellules épithéliales mammaires. De plus, nous avons trouvé que Slug inhibait l'apoptose, promouvait la motilité cellulaire, et permettait l'émergence et la croissance de mammosphères clonales. Ce dernier point montre l'implication de Slug dans les cellules souches, qui est renforcé par le fait que des cellules primaires déficientes pour Slug étaient incapables de donner des mammosphères secondaires. Par ailleurs, nous avons pu observer in vivo que les souris déficientes pour Slug présentaient un retard de développement de la glande mammaire, possédant moins de cellules en prolifération, et une surexpression des marqueurs des cellules luminale CK8/18, GATA3 et ER. D'autres gènes régulant l'EMT sont retrouvés surexprimés, suggérant un mécanisme de compensation, qui peut expliquer le fait que le retard de développement de la glande mammaire est rattrapé à l'âge adulte. Les glandes mammaires Slug-knockout présentaient également des branchements excessifs, évoquant une différenciation précoce, similaire aux glandes mammaires de souris déficientes pour la P-cadhérine, exprimée dans les cellules basales. Sachant cela, nous avons constaté que la P-cadhérine était diminuée dans les glandes mammaires Slug-knockout, et dans les cellules CommaDβ traitées par siRNA ciblant Slug. Nous avons alors trouvé que Slug se liait directement au promoteur de la P-cadhérine et l'activait, et que cette dernière intervenait dans certains effets fonctionnels de Slug, tels que la croissance de mammosphères, la différenciation et la migration cellulaire. Ainsi, nous avons montré l'importance d'une nouvelle voie de signalisation Slug/P-cadhérine dans les capacités souches/progénitrices des cellules épithéliales mammaires, intégrant la différenciation et la motilité cellulaire, et nous avons maintenant une meilleure compréhension de son rôle dans l'agressivité de certains cancers du sein. / Mammary gland morphogenesis results from the coordination of different pathways, including apoptosis, proliferation, differentiation, and stem/progenitor cell dynamics. Epithelial-mesenchymal transition (EMT) appears to be involved in these signalling pathways. Thus, we focused on transcription factor Slug, a key gene regulating EMT, and its involvement in mammary gland morphogenesis. First, using a Slug–LacZ transgenic mice model, we located Slug in a subpopulation covering about 10–20% basal duct cells and cap cells of terminal end bud, coexpressed with basal markers P-cadherin, CK5 and CD49f. Then, we have shown by in vitro experiments of loss and gain of function that Slug regulated the differentiation and proliferation of mammary epithelial cells. Moreover, we found that Slug inhibited apoptosis, promoted cell motility, and allowed the emergence and growth of clonal mammospheres. This last point shows the involvement of Slug in stem cells, which is reinforced by the fact that primary cells deficient for Slug were unable to give secondary mammospheres. Furthermore, we observed in vivo that mice deficient for Slug showed delayed development of the mammary gland, with less proliferating cells, and overexpression of markers of luminal cells CK8/18, GATA3 and ER. Other genes regulating EMT are found overexpressed, suggesting a compensatory mechanism, which can explain the fact that the delayed development of the mammary gland is caught up in adulthood. The Slug-knockout mammary glands also showed overbranching, evoking an early differentiation, similar to the mammary glands of mice deficient in P-cadherin, expressed in the basal cells. Knowing this, we found that P-cadherin was decreased in Slug-knockout mammary glands, and in CommaDβ cells treated with siRNA targeting Slug. We then found that Slug binds directly to the promoter of the P-cadherin and activated it, and that P-cadherin was involved in some functional effects of Slug, such as mammospheres growth, differentiation and cell migration. Thus, we have shown the importance of a new signalling pathway Slug/P-cadherin in the capacity of mammary epithelial stem/progenitor cells, integrating differentiation and cell motility, and we now have a better understanding of its role in the aggressiveness of some breast cancers.