Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-07-03T15:37:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação - Tamiris Rio Branco da Fonseca.pdf: 1102398 bytes, checksum: e70c786229e1b956a358698df9fb090b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-08T18:09:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Tamiris Rio Branco da Fonseca.pdf: 1102398 bytes, checksum: e70c786229e1b956a358698df9fb090b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-07-08T18:13:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação - Tamiris Rio Branco da Fonseca.pdf: 1102398 bytes, checksum: e70c786229e1b956a358698df9fb090b (MD5) / Made available in DSpace on 2015-07-08T18:28:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação - Tamiris Rio Branco da Fonseca.pdf: 1102398 bytes, checksum: e70c786229e1b956a358698df9fb090b (MD5) Previous issue date: 2013-05-02 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Mushrooms arouse interest for presenting high nutritional and medicinal value. The representatives of the genus Pleurotus are able to grow in different agricultural and agro-industrial waste, since they secrete numerous enzymes that hydrolyze the substrates prepared from waste providing nutrient The search for alternative substrates increased in recent years due to the availability of regional waste little or never used in the production of edible mushrooms. The use of waste in solid-state fermentation has emerged also in the production of enzymes. Proteases are a group of enzymes commercially exploited, however the use of Basidiomycetes as producers of proteases is still a relatively unexplored. The aim of this study was to evaluate the mycelial growth as well as to investigate the production and partially characterize extracellular proteases from Pleurotus ostreatoroseus DPUA 1720 in different agro-industrial waste, selecting a mixture for the production of the mushroom and check their microbiological quality and nutritional value. Cultures were prepared in potato dextrose added yeast extract 0.5% (w/v). The vertical mycelial growth and production of proteases from P. ostreatoroseus DPUA 1720 were performed in agro-industrial waste (acai seed, sawdust, cupuassu bark, rice bran, bark and pineapple crown) for 15 days under two growing conditions (presence and absence of light). The production of basidiomata was performed in the substrate which presented satisfactory mycelial growth and vigorous mycelium. From this bioprocess evaluated the formation and development of early basidiomata, total time of cultivation, biological efficiency, productivity, production rate, loss of organic matter, microbiological and nutritional value of the mushroom. P. ostreatoroseus DPUA 1720 grew in all industrial residues also tested serving as sources for the production of proteases. In bark cupuaçu added rice bran mycelium was strongly vigorous and the mycelial growth satisfactory, therefore selected for the production of P. ostreatoroseus DPUA 1720. Under the experimental conditions the proteolytic activity was determined in crude extracts from the substrates of vertical mycelial growth with maximum proteolytic activity (7.89 U/mL) in bark cupuassu added rice bran in the presence of light. This substrate was the most efficient for the production of proteases with activity atpH 6.0 and optimum temperature at 40 ˚C. The basidiomata showed no contaminants, low in fat, high in fiber and protein, macro and micro minerals, essential and non-essential amino acids, may therefore be inserted into the feed as a safe and nutritious food. / Os cogumelos despertam interesse por apresentar alto valor nutricional e medicinal. Os representantes do gênero Pleurotus são capazes de crescer em diferentes resíduos agrícolas e agroindustriais, pois secretam inúmeras enzimas que hidrolisam os substratos elaborados a partir dos resíduos disponibilizando nutrientes. A busca por substratos alternativos cresceu nos últimos anos em virtude da disponibilidade de resíduos regionais pouco ou nunca utilizados na produção de cogumelos comestíveis. O uso de resíduos na fermentação semi-sólida vem despontando também na produção de enzimas. As proteases são o grupo de enzimas mais exploradas comercialmente, no entanto o uso de Basidiomicetos como produtores de proteases ainda é um tema pouco explorado. O objetivo deste trabalho foi avaliar o crescimento micelial, bem como investigar a produção e caracterizar parcialmente proteases extracelulares de Pleurotus ostreatoroseus DPUA 1720 em diferentes resíduos agroindustriais, selecionar uma mistura para produção dos basidiomas e verificar sua qualidade microbiológica e valor nutricional. As culturas foram preparadas em ágar batata dextrose acrescido de extrato de levedura 0,5% (p/v). O crescimento micelial vertical e a produção de proteases de P. ostreatoroseus foram realizados em resíduos agroindustriais (semente de açaí, serragem, casca de cupuaçu, farelo de arroz, casca e coroa de abacaxi) durante 15 dias, sob duas condições de cultivo (presença e ausência de luz). A produção do basidioma foi realizada no substrato que apresentou crescimento micelial satisfatório e micélio vigoroso. A partir desse bioprocesso foi avaliada a formação e desenvolvimento dos primórdios, tempo total de cultivo, eficiência biológica, produtividade, taxa de produção, perda de matéria orgânica, qualidade microbiológica e valor nutricional dos basidiomas. P. ostreatoroseus DPUA 1720 cresceu em todos os resíduos agroindustriais testados, também servindo como fontes para a produção de proteases. Em casca de cupuaçu adicionado de farelo de arroz o micélio foi fortemente vigoroso e o crescimento micelial satisfatório, por isso selecionado para produção de P. ostreatoroseus DPUA 1720. Nas condições experimentais a atividade proteolítica foi determinada nos extratos brutos provenientes dos substratos miceliados do crescimento micelial vertical com máxima atividade proteolítica (7,89 U/mL) em casca de cupuaçu adicionado de farelo de arroz na presença de luz. Este substrato foi o mais eficiente para a produção das proteases com atividade em pH 6,0 e temperatura ótima a 40˚C. Os basidiomas apresentaram ausência de contaminantes, baixo teor de lipídios, alto teor de fibras e proteínas, macro e microminerais, aminoácidos essenciais e não essenciais, podendo assim ser inserido na alimentação como um alimento saudável e nutritivo.

Tradicionalmente, o cultivo do cogumelo comestível Pleurotus sajor-caju ou "hiratake" é realizado em diferentes resíduos agrícolas, precedido pelos processos de compostagem e pasteurização. Apresenta uma delicada consistência sendo comercializado preferencialmente "in natura", com tempo de vida útil de 3 a 7 dias, dependendo das condições de armazenamento. Os objetivos do presente trabalho foram: eliminar a fase de pasteurização do substrato através da lavagem do bagaço da cana-de-açúcar, com posterior suplementação visando um aumento na produtividade e prolongar o tempo de comercialização do cogumelo fresco através da sua imersão em diferentes soluções. Na primeira parte do trabalho, os colmos da cana-de-açúcar passaram por moenda para a extração do caldo, sendo em seguida desfibrados. Um lote foi pasteurizado em água a 80°C durante 2 horas; outro lote foi lavado em água corrente à temperatura ambiente em um aparelho adaptado, durante uma hora. Foram drenados e acondicionados em sacos de polietileno com a "semente-inóculo" (5% sobre a matéria úmida). A lavagem simples no aparelho foi utilizada para o experimento com suplementação; um lote recebeu suplementação com quirera de milho (suplementação orgânica); outro foi suplementado com solução nutritiva (suplementação mineral) e o controle não foi suplementado; em ambos os experimentos foram avaliadas a eficiência biológica e a contaminação do substrato. Na segunda parte do trabalho, os cogumelos colhidos foram imersos em diferentes soluções (ácido cítrico, peróxido de hidrogênio e água destilada) durante 2 minutos, foram drenados, acondicionados em bandejas de poliestireno e mantidos sob refrigeração (4ºC) durante 10 dias; foram avaliadas a coloração, textura, aparência e o peso. A lavagem simples do bagaço de cana-de-açúcar mostrou-se eficiente no controle dos microrganismos competidores durante as fases de colonização do substrato e produção dos cogumelos. A suplementação mineral do bagaço lavado com solução nutritiva resultou em eficiência biológica média (EBM) de 30,03%, sendo superior ao controle, com EBM de 26,62%; o menor desempenho foi obtido com a utilização da suplementação orgânica no bagaço lavado, apresentando EBM de 15,66%. Em relação à conservação do cogumelo fresco, ocorreram perdas de textura e peso, bem como o amarelecimento dos cogumelos em todos os tratamentos, não apresentando diferença entre as soluções citadas e o controle no final do período de avaliação. Portanto, os processos de imersão nas soluções de ácido cítrico, peróxido de hidrogênio e água destilada não apresentaram resultados satisfatórios para a conservação dos cogumelos frescos. / Traditionally, the cultivation of edible mushroom Pleurotus sajor-caju or "hiratake" has been carried out on different composted and pasteurized agricultural residues. They are usually sold in natura and according to the storage conditions the mushrooms’shelf life varies from 3 to 7 days. The objectives of this study were to investigate the traditional processes of compostage and pasteurization in substitution by washed and supplemented (mineral or organic) sugar cane bagasse and evaluate the increase of fresh mushrooms’shelf life by immersion into different solutions. In the first experiment, the fresh sugar cane bagasse was washed in fresh water and packed in ethylene bag added with the spawn; the suplementation of washed sugar cane bagasse was mineral (with the nutritive solution) or organic (with the corn gritz). The biological efficiency and the contamination of the substrate were analysed. After harvest, the mushrooms were immersed into different solutions for 2 minutes, dryed, packed in trays and kept under refrigeration (4ºC) for 10 days. Coloration, texture, weight and global aspect of the mushrooms were evaluated in this period of storage. The washed bagasse was efficient to inhibit the growth of competitive microorganisms during the spawning and production of the mushrooms. The supplementation with nutritive solution presented the best biological efficiency media (BEM), 30,03% while with the control was 26,62%. The corn gritz presented the worst performance, with a BEM of 15,66%. The yellowish of mushrooms occurred and their texture and weight decreased. The global aspect of the immersed mushrooms had no difference compared to the control not immersed. This process of immersion into different solutions did not extend the shelf life of fresh mushrooms.

Tradicionalmente, o cultivo do cogumelo comestível Pleurotus sajor-caju ou “hiratake” é realizado em diferentes resíduos agrícolas, precedido pelos processos de compostagem e pasteurização. Apresenta uma delicada consistência sendo comercializado preferencialmente “in natura”, com tempo de vida útil de 3 a 7 dias, dependendo das condições de armazenamento. Os objetivos do presente trabalho foram: eliminar a fase de pasteurização do substrato através da lavagem do bagaço da cana-de-açúcar, com posterior suplementação visando um aumento na produtividade e prolongar o tempo de comercialização do cogumelo fresco através da sua imersão em diferentes soluções. Na primeira parte do trabalho, os colmos da cana-de-açúcar passaram por moenda para a extração do caldo, sendo em seguida desfibrados. Um lote foi pasteurizado em água a 80°C durante 2 horas; outro lote foi lavado em água corrente à temperatura ambiente em um aparelho adaptado, durante uma hora. Foram drenados e acondicionados em sacos de polietileno com a “semente-inóculo” (5% sobre a matéria úmida). A lavagem simples no aparelho foi utilizada para o experimento com suplementação; um lote recebeu suplementação com quirera de milho (suplementação orgânica); outro foi suplementado com solução nutritiva (suplementação mineral) e o controle não foi suplementado; em ambos os experimentos foram avaliadas a eficiência biológica e a contaminação do substrato. Na segunda parte do trabalho, os cogumelos colhidos foram imersos em diferentes soluções (ácido cítrico, peróxido de hidrogênio e água destilada) durante 2 minutos, foram drenados, acondicionados em bandejas de poliestireno e mantidos sob refrigeração (4ºC) durante 10 dias; foram avaliadas a coloração, textura, aparência e o peso. A lavagem simples do bagaço de cana-de-açúcar mostrou-se eficiente no controle dos microrganismos competidores durante as fases de colonização do substrato e produção dos cogumelos. A suplementação mineral do bagaço lavado com solução nutritiva resultou em eficiência biológica média (EBM) de 30,03%, sendo superior ao controle, com EBM de 26,62%; o menor desempenho foi obtido com a utilização da suplementação orgânica no bagaço lavado, apresentando EBM de 15,66%. Em relação à conservação do cogumelo fresco, ocorreram perdas de textura e peso, bem como o amarelecimento dos cogumelos em todos os tratamentos, não apresentando diferença entre as soluções citadas e o controle no final do período de avaliação. Portanto, os processos de imersão nas soluções de ácido cítrico, peróxido de hidrogênio e água destilada não apresentaram resultados satisfatórios para a conservação dos cogumelos frescos. / Traditionally, the cultivation of edible mushroom Pleurotus sajor-caju or “hiratake” has been carried out on different composted and pasteurized agricultural residues. They are usually sold in natura and according to the storage conditions the mushrooms’shelf life varies from 3 to 7 days. The objectives of this study were to investigate the traditional processes of compostage and pasteurization in substitution by washed and supplemented (mineral or organic) sugar cane bagasse and evaluate the increase of fresh mushrooms’shelf life by immersion into different solutions. In the first experiment, the fresh sugar cane bagasse was washed in fresh water and packed in ethylene bag added with the spawn; the suplementation of washed sugar cane bagasse was mineral (with the nutritive solution) or organic (with the corn gritz). The biological efficiency and the contamination of the substrate were analysed. After harvest, the mushrooms were immersed into different solutions for 2 minutes, dryed, packed in trays and kept under refrigeration (4ºC) for 10 days. Coloration, texture, weight and global aspect of the mushrooms were evaluated in this period of storage. The washed bagasse was efficient to inhibit the growth of competitive microorganisms during the spawning and production of the mushrooms. The supplementation with nutritive solution presented the best biological efficiency media (BEM), 30,03% while with the control was 26,62%. The corn gritz presented the worst performance, with a BEM of 15,66%. The yellowish of mushrooms occurred and their texture and weight decreased. The global aspect of the immersed mushrooms had no difference compared to the control not immersed. This process of immersion into different solutions did not extend the shelf life of fresh mushrooms.

O fungo Pleurotus ostreatus pertence ao grupo de basidiomicetos que degradam madeira. Este cogumelo cultivado em todo mundo apresenta grande rusticidade e produtividade, e pode ainda ser usado em processos de biorremediação e biopolpação. Devido a seu potencial biotecnológico, torna-se interessante a compreensão da interação deste com outros microrganismos. Neste sentido, recentemente foi observada a presença de bactérias associadas a P. ostreatus em culturas in vitro, que apresentavam grande pleomorfismo. A partir desta observação foram elaborados ensaios que visaram a confirmação da presença de bactérias. Para tanto, foi utilizada a estratégia do "Ciclo Completo de Análise do rRNA" (full-cycle rRNA analysis) empregada em microrganismos não cultiváveis ou de crescimento fastidioso, além do emprego de técnicas de microbiologia básica, e de estudos de ultraestrutura. Os estudos de microbiologia básica indicaram que se tratava de um microrganismo fastidioso e que se desenvolvia melhor na presença do fungo em sistema de co-cultivo em meios contendo Tween 80 ou Tween 20. Por sua vez, a análise de ultraestrutura demonstrou a presença de estruturas pleomórficas, tanto internamente como externamente à hifa. Em relação ao "Ciclo completo de Análise do rRNA" este se iniciou pela amplificação e seqüenciamento de parte do rDNA bacteriano, que revelou a proximidade desta bactéria com o Complexo Burkholderia cepacia (CBC). A partir desta seqüência, foi realizado um estudo de bioinformática que indicou sondas específicas para este grupo de bactérias. Completando o Ciclo completo de Análise do rRNA, foram realizados ensaios de hibridização in situ fluorescente (FISH) para a confirmar a relação entre as estruturas bacterianas e a seqüência obtida. Este método comprovou a presença das bactérias no interior das hifas de P. ostreatus. Este trabalho constitui o primeiro relato de bactérias pleomórficas pertencente ao complexo B. cepacia associados a P. ostreatus. / The fungus Pleurotus ostreatus, which belongs to white rot basidiomycete group, is a widely cultivated mushroom; this species has high productivity and rusticity, besides its use in biobleaching and bioremediation processes. This biotechnological potential justifies microbial interaction studies between this fungi and others microorganisms. In P. ostreatus mycelia, it has been observed pleomorphic bacteria growing on agar media. This research describes several assays to confirm bacterial presence in this sample. Therefore, the full-cycle rRNA analysis (described for unculturable or fastidious microorganism), ultrastructure and basic microbiology approaches were employed. Basic microbiology approaches indicated slow growing bacteria, which grown faster near to fungi colonies in solid media amended with Tween 80 or Tween 20 (co-culture system). Ultrastructure studies confirm the presence of intracellular and extracellular pleomorphic bacteria. The full-cycle rRNA analysis started with 16S rDNA amplification and sequencing. This approach demonstrated a relation between these bacteria with Burkholderia cepacia complex. By bioinformatics analysis was determinate which DNA probes can be use to identified this bacterial group. The last step for full-cycle rRNA analysis was applying fluorescent in situ hybridization (FISH). This technique confirmed the relationship between 16S rDNA bacterial sequence and bacterial forms. This is the first time that a pleomorphic bacteria from B. cepacia complex is found associated with P. ostreatus.

O fungo Pleurotus ostreatus pertence ao grupo de basidiomicetos que degradam madeira. Este cogumelo cultivado em todo mundo apresenta grande rusticidade e produtividade, e pode ainda ser usado em processos de biorremediação e biopolpação. Devido a seu potencial biotecnológico, torna-se interessante a compreensão da interação deste com outros microrganismos. Neste sentido, recentemente foi observada a presença de bactérias associadas a P. ostreatus em culturas in vitro, que apresentavam grande pleomorfismo. A partir desta observação foram elaborados ensaios que visaram a confirmação da presença de bactérias. Para tanto, foi utilizada a estratégia do “Ciclo Completo de Análise do rRNA” (full-cycle rRNA analysis) empregada em microrganismos não cultiváveis ou de crescimento fastidioso, além do emprego de técnicas de microbiologia básica, e de estudos de ultraestrutura. Os estudos de microbiologia básica indicaram que se tratava de um microrganismo fastidioso e que se desenvolvia melhor na presença do fungo em sistema de co-cultivo em meios contendo Tween 80 ou Tween 20. Por sua vez, a análise de ultraestrutura demonstrou a presença de estruturas pleomórficas, tanto internamente como externamente à hifa. Em relação ao “Ciclo completo de Análise do rRNA” este se iniciou pela amplificação e seqüenciamento de parte do rDNA bacteriano, que revelou a proximidade desta bactéria com o Complexo Burkholderia cepacia (CBC). A partir desta seqüência, foi realizado um estudo de bioinformática que indicou sondas específicas para este grupo de bactérias. Completando o Ciclo completo de Análise do rRNA, foram realizados ensaios de hibridização in situ fluorescente (FISH) para a confirmar a relação entre as estruturas bacterianas e a seqüência obtida. Este método comprovou a presença das bactérias no interior das hifas de P. ostreatus. Este trabalho constitui o primeiro relato de bactérias pleomórficas pertencente ao complexo B. cepacia associados a P. ostreatus. / The fungus Pleurotus ostreatus, which belongs to white rot basidiomycete group, is a widely cultivated mushroom; this species has high productivity and rusticity, besides its use in biobleaching and bioremediation processes. This biotechnological potential justifies microbial interaction studies between this fungi and others microorganisms. In P. ostreatus mycelia, it has been observed pleomorphic bacteria growing on agar media. This research describes several assays to confirm bacterial presence in this sample. Therefore, the full-cycle rRNA analysis (described for unculturable or fastidious microorganism), ultrastructure and basic microbiology approaches were employed. Basic microbiology approaches indicated slow growing bacteria, which grown faster near to fungi colonies in solid media amended with Tween 80 or Tween 20 (co-culture system). Ultrastructure studies confirm the presence of intracellular and extracellular pleomorphic bacteria. The full-cycle rRNA analysis started with 16S rDNA amplification and sequencing. This approach demonstrated a relation between these bacteria with Burkholderia cepacia complex. By bioinformatics analysis was determinate which DNA probes can be use to identified this bacterial group. The last step for full-cycle rRNA analysis was applying fluorescent in situ hybridization (FISH). This technique confirmed the relationship between 16S rDNA bacterial sequence and bacterial forms. This is the first time that a pleomorphic bacteria from B. cepacia complex is found associated with P. ostreatus.