Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / A bioenergia destaca-se como um substituto relevante para os combustíveis fósseis e os A capacidade de selecionar o embrião com maior viabilidade para transferência às receptoras é um componente crucial para o sucesso das técnicas de reprodução assistida. Atualmente, avaliações morfológicas são utilizadas para selecionar os embriões com maior potencial de implantação, e apesar de se tratar de um método não invasivo e relativamente bem sucedido, ainda apresenta uma série de limitações. Nos últimos anos, o desenvolvimento de novas tecnologias tem possibilitado análises quantitativas e qualitativas para determinação da viabilidade dos embriões para melhoria da seleção embrionária. Em especial as tecnologias espectroscópicas e espectrométricas permitiram o desenvolvimento de novos métodos para a caracterização embrionária e predição do potencial de estabelecimento da prenhez. Assim, o objetivo deste trabalho foi a caracterização não invasiva de embriões bovinos pela análise dos perfis espectroscópicos e espectrométricos dos meios de cultivo de embriões com diferentes cinéticas de desenvolvimento visando a obtenção de padrões específicos baseados no fenótipo embrionário. Para isso, embriões bovinos foram produzidos in vitro por protocolos convencionais. Os zigotos foram transferidos para meios de cultivo individualmente e classificados em dois grupos: rápido (4 células-40hpi) e lento (2 ou 3 células-40hpi). Os meios de cultura foram coletados às 40, 96 e 168 horas pós-inseminação (hpi), tranferidos para criotubos e congelados a -80ºC até o momento das análises. A análise do metaboloma embrionário foi realizada por espectroscopia Raman. Para tal, gotas de meios de cultura foram cobertas com óleo mineral, sendo escaneadas por um sistema Raman triplo. Os dados foram normalizados e analisados por Análises de Componentes Principais (PCA), de Agrupamentos (Clusters) e por Loading plot. A análise do secretoma embrionário foi feita por MALDI-MS-TOF, através da extração dos metabólitos, sendo os espectros adquiridos pelo espectrômetro em modo de ionização positiva. Foram feitas analises estatísticas univariadas e multivariadas pelo software online Metaboanalyst. Os resultados obtidos pela espectroscopia Raman e espectrometria de massas demonstram que embriões com diferentes cinéticas de desenvolvimento possuem diferentes perfis espectroscópicos e espectrométricos ao longo do desenvolvimento embrionário, indicando que estes embriões consomem e/ou produzem diferencialmente metabólitos nos meios de cultura. Com base em nossos resultados, propomos com este estudo que a análise dos meios de cultura por espectroscopia Raman pode ser utilizada para fins de diagnóstico embrionário, pois permite uma caracterização rápida e global dos perfis embrionários relacionados a cinética, enquanto a espectrometria de massas pode ser utilizada para caracterização qualitativa dos embriões, permitindo a identificação do secretoma de embriões durante o cultivo in vitro. / The ability to select embryo with greater viability to transfer to the receptors is a crucial component to the success of assisted reproduction techniques. Currently, morphological assessments are used to select embryos with the highest implantation potential, although it¿ s a noninvasive and relatively successful, has still a number of limitations. In recent years, the development of new technologies has enabled quantitative and qualitative analyzes for the determination of viability of embryos to improve embryo selection. In particular spectroscopic and spectrometric technologies have permitted the development of new methods for embryo characterization and prediction of potential establishment of pregnancy. The objective of this study was non-invasive characterization of bovine embryos by analysis of spectroscopic and spectrometric profiling of embryo culture media with different kinetics of development in order to obtain specific patterns based on embryonic phenotype. For this, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols. The zygotes were transferred to individual culture medium and divided into two groups: Fast (4 cells-40hpi) and slow (2 or 3 cells-40hpi). The culture media were collected at 40, 96 and 168 hours post-insemination (hpi) tranfered to cryotubes and frozen at -80 until the time of analysis. The analysis of the metabolome embryo was made by Raman spectroscopy. For this, droplets of culture media were overlaid with mineral oil being scanned by a triple Raman system. The data were normalized and analyzed by Principal Component Analysis (PCA), clusters and Loading plot. Analysis of embryonic secretome was made by MALDI-TOF-MS, through the extraction of the metabolites, and the spectra acquired by the spectrometer in positive ionization mode. Analyzes were performed univariate and multivariate statistics by the online software Metaboanalyst. The results obtained by Raman spectroscopy and mass spectrometry demonstrated that the development of embryos with different kinetics have different spectroscopic and spectrometric profiles during embryonic development, indicating that these embryos consume and /or produce differentially metabolites in the culture media. Based on our results, we propose that the analysis of Raman spectroscopy culture media may be used for diagnostic purposes embryo, since it allows a fast and comprehensive characterization of embryonic profiles related to kinetics, while mass spectrometry can be used for qualitative characterization of the embryo, allowing the identification of secretome embryo during in vitro culture.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:11Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-03-02Bitstream added on 2014-06-13T19:45:12Z : No. of bitstreams: 1 perini_ap_dr_jabo.pdf: 421844 bytes, checksum: 8711bc62b0ce38924a7b61b38ef31cf7 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Foram estudadas modificações feitas no tempo de maturação in vitro de oócitos bovinos, incubação dos espermatozóides e separação dos mesmos por gradiente de densidade de PercollTM, bem como a associação dessas técnicas antes da fecundação para que se consiga desviar a proporção sexual dos embriões para fêmeas. O controle de qualidade foi feito em cada etapa dos procedimentos avaliando-se os parâmetros de motilidade, vigor e concentração dos espermatozóides, bem como taxa de clivagem e produção in vitro dos embriões. A proporção sexual foi avaliada pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e por transferências de embriões em receptoras. Pela técnica da PCR concluiu-se que a incubação dos espermatozóides em meio FIV sem heparina por 12 horas, desviou 59% o sexo dos embriões para fêmeas, a diminuição do tempo de maturação não desviou e essas duas técnicas associadas a centrifugação em gradiente não aumentaram o desvio da proporção sexual, porém o gradiente de sexagem foi eficaz em sexar 64% dos espermatozóides para fêmeas. Obteve-se uma taxa média de prenhez de 36,73% e uma proporção de fêmeas de 88,88% com embriões produzidos a partir da associação da redução no tempo de maturação dos oócitos ao gradiente de sexagem / Were studied modifications made at the time of in vitro maturation of oocytes, sperm incubation and separation thereof by density gradient PercollTM as well as the combination of these techniques prior to fertilization to be able to divert the sex ratio of embryos females. Quality control was done at each stage of the procedures by evaluating the parameters of motility, vigor and concentration of spermatozoa and rate of cleavage and in vitro production of embryos. The sex ratio was assessed by means of Polymerase Chain Reaction (PCR) and embryo transfer into recipients. By the technique of PCR it was found that incubation of spermatozoa in IVF medium without heparin for 12 hours, 59% deviated sex of embryos for females, the reduction time of maturation is not shifted and associated with these two techniques do not increase the deviation of the sex ratio by gradient centrifugation, but the gradient was effective in sexing 64% of sperm to females. We obtained a mean pregnancy rate of 36.73% and a ratio of 88.88% of females with embryos produced from the combination of the reduction in the time of oocyte maturation to the gradient of sexing

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca: Juliana Corrêa Borges Silva / Banca: Wilter Ricardo Russiano Vicente / Banca: Paulo Henrique Franceschini / Resumo: Foram estudadas modificações feitas no tempo de maturação in vitro de oócitos bovinos, incubação dos espermatozóides e separação dos mesmos por gradiente de densidade de PercollTM, bem como a associação dessas técnicas antes da fecundação para que se consiga desviar a proporção sexual dos embriões para fêmeas. O controle de qualidade foi feito em cada etapa dos procedimentos avaliando-se os parâmetros de motilidade, vigor e concentração dos espermatozóides, bem como taxa de clivagem e produção in vitro dos embriões. A proporção sexual foi avaliada pela técnica da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e por transferências de embriões em receptoras. Pela técnica da PCR concluiu-se que a incubação dos espermatozóides em meio FIV sem heparina por 12 horas, desviou 59% o sexo dos embriões para fêmeas, a diminuição do tempo de maturação não desviou e essas duas técnicas associadas a centrifugação em gradiente não aumentaram o desvio da proporção sexual, porém o gradiente de sexagem foi eficaz em sexar 64% dos espermatozóides para fêmeas. Obteve-se uma taxa média de prenhez de 36,73% e uma proporção de fêmeas de 88,88% com embriões produzidos a partir da associação da redução no tempo de maturação dos oócitos ao gradiente de sexagem / Abstract: Were studied modifications made at the time of in vitro maturation of oocytes, sperm incubation and separation thereof by density gradient PercollTM as well as the combination of these techniques prior to fertilization to be able to divert the sex ratio of embryos females. Quality control was done at each stage of the procedures by evaluating the parameters of motility, vigor and concentration of spermatozoa and rate of cleavage and in vitro production of embryos. The sex ratio was assessed by means of Polymerase Chain Reaction (PCR) and embryo transfer into recipients. By the technique of PCR it was found that incubation of spermatozoa in IVF medium without heparin for 12 hours, 59% deviated sex of embryos for females, the reduction time of maturation is not shifted and associated with these two techniques do not increase the deviation of the sex ratio by gradient centrifugation, but the gradient was effective in sexing 64% of sperm to females. We obtained a mean pregnancy rate of 36.73% and a ratio of 88.88% of females with embryos produced from the combination of the reduction in the time of oocyte maturation to the gradient of sexing / Doutor

Orientador: Prof. Dr. Marcelo Zanchetta do Nascimento / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Engenharia da Informação, 2014. / In vitro production has been employed in bovine embryos and quantification of lipids is fundamental to understand the metabolism of these embryos. This paper presents an unsupervised segmentation method for histological images of bovine embryos. During the process of mounting slides some droplets of dye and other fragments could be remain out of the embryo. With this method, the irregularities were removed by applying an algorithm developed in the pre-processing step, in which a calculation is done to eliminate regions whose pixels have values of hypotenuse greater than 22% of the image center. After removal of the irregularities a transformation of the RGB color model to the YIQ was applied. Then the global thresholding technique was applied with the threshold value obtained by the maximum entropy in order to separate the lipid droplets of histological slides at diferent stages: early cleavage, morula and blastocyst. After this step, false positive regions were removed using the technique of connected components. For this step, area information, center and amount of pixels were used. It enabled outliers removal of segmented regions. The proposed segmentation method was applied in 60 histological images of bovine embryos. The images were evaluated qualitatively and quantitatively with respect to the gold standard images. The method presented accuracy values of 96 2%, 942% and 952%, respectively in the tissues of early cleavage, morula and blastocyst. The developed method obtained better results than classical segmentation methods.

Tendo em vista a possibilidade de que a adição de ácidos graxos ao meio de cultivo embrionário aumente a sobrevivência ao congelamento, a proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de quatro ácidos graxos isoladamente ao meio de cultivo, dois do grupo ômega 6 (ácido linoléico e ácido linoléico conjugado) e dois do grupo ômega 3 (ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico), na produção de embriões, no número de células, na quantidade de lipídeos, na taxa de re-expansão da blastocele após 48 horas de cultivos pós-descongelamento, na taxa de eclosão pósdescongelamento e na taxa de gestação. Para tal, os oócitos bovinos colhidos de ovários de vacas abatidas foram maturados, fecundados e cultivados in vitro em atmosfera de 5% CO2 em ar, à 38,8°C e máxima umidade. No cultivo, foi adicionado isoladamente um destes ácidos graxos, e foram avaliadas a taxa de clivagem, e a produção de embriões no sétimo e oitavo dia de cultivo. No sétimo dia, os blastocistos expandidos foram congelados com 1,5M de etileno glicol. Eles permaneceram nesta solução por 9 minutos antes de serem envasados e seguirem para a maquina de congelamento numa taxa de resfriamento de 0,5°C/minuto até chegarem à temperatura de -32°C. Dos embriões que foram congelados, alguns seguiram para o descongelamento e voltaram para o cultivo in vitro para avaliação da reexpansão e taxa de eclosão pós-descongelamento. Outros foram transferidos para receptoras sincronizadas para avaliação da taxa de gestação. Outros grupos de embriões permaneceram até o oitavo dia de cultivo e foram corados com Hoechst 33342 para contagem dos núcleos, e corados com Nile Red para avaliação do conteúdo total de lipídeos. Em geral, a adição isolada de ácidos graxos do grupo ômega 6 (CLA e LA) na produção in vitro de embriões bovinos aumentou a taxa de sobrevivência ao congelamento (criotolerância), no entanto, não houve um aumento no número de células, nem diferença no conteúdo total de lipídeos nos embriões analisados. A taxa de gestação também não diferiu estatisticamente entre os grupos testados in vivo, porém foi observado um aumento de 200% na taxa de gestação dos embriões cultivados na presença de CLA. Novos estudos devem ser desenvolvidos para comprovar o efeito do aumento da criotolerância e melhorias nas taxas de gestações dos embriões, além de estudos da composição de lipídeos nos embriões e membranas. / In the view of the possibility that the addition of fatty acids in the embryo growing medium increase the survival rate after cryopreservation, this study was proposed to evaluate the effect of the addition of four fatty acids in culture medium, two of the omega 6 group (linoleic acid and conjugated linoleic acid) and two of the omega 3 group (eicosapentainoic acid and docosahexaenoic acid), in the rate of production of blastocysts, blastocyst cell number, blastocyst amount of lipids , re-expansion of blastocele rate after 48 hours of culture post-thaw, post-thaw hatching rate and pregnancy rate. The oocytes obtained by punction of slaughterhouse cows were matured in vitro, fertilized in vitro and cultured in vitro in an atmosphere of 5% CO2 in air, to 38,8°C and maximum moisture. Fatty acids were supplemented individually and cleavage rate and production of embryos in the seventh and eighth days of culture were assessed. On seventh day, the expanded blastocysts were frozen with 1.5M of ethylene glycol. They remained in this solution for nine minutes before introduction in a straw followed and then in a freezing machine with a chilling rate of 0,5°C/minute until temperature of -32°C. Frozen embryos were then divide in two groups: one was thawed and returned to in vitro culture in other to assess the reexpansion and post-hatching rate, and other was transferred to synchronized recipients to assess the pregnancy rate. Another unfreezed group of embryos were stained with Hoechst 33342 for counting the nuclei, or stained with Nile Red to estimate the lipids contents. In general, the addition of fatty acids omega 6 group (LA and CLA) increased the survival rate to the freezing (cryotolerancy), however, there was no increase in the number of cells, or difference in the lipids contents. In the CLA treated embryos, the pregnancy rate of the freezed embryos did not differ from groups tested in vivo, but there was a 200% increase in the pregnancy rate. Further studies should be developed to prove the improvements in the rates of pregnancies of omega 6 treated embryos, besides a study of the composition of lipids of embryos and membranes should be conducted.

Orientadora: Profa. Dra. Marcella Pecora Milazzotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / A cinética do desenvolvimento embrionário pode estar relacionada com a viabilidade dos embriões produzidos in vitro (PIV) no que diz respeito ao estresse celular. Embora ainda permaneça a hipótese de que embriões que apresentam cinética de desenvolvimento mais rápida podem apresentar maior viabilidade, embriões que se desenvolvem mais rápido nas suas primeiras clivagens também podem apresentar maior resposta ao estresse. Com base nesses dados nossos objetivos foram caracterizar o perfil de morte celular por apoptose em embriões bovinos PIV com diferentes cinéticas de desenvolvimento, além de verificar possíveis marcadores de resposta ao estresse nestes embriões. Para tal, os complexos cumulus-oócitos obtidos de ovários de vacas de abatedouro comercial foram selecionados, maturados (MIV) e fecundados in vitro (FIV). Os zigotos denudados foram cultivados in vitro (CIV) individualmente e, 40 horas pós inseminação (hpi) os embriões foram classificados de acordo com suas primeiras clivagens em: rápidos (4 células) e lentos (2 ou 3 células), gerando dois grupos que foram avaliados nos seguintes estádios: clivagem (40hpi), mórula (96hpi) e blastocisto (186hpi). As avaliações consistiram de índice de embriões clivados (D2) e blastocistos (D7), número total de células, fragmentação de DNA (teste TUNEL), presença de caspase 3 e 7 ativas, presença de caspase total ativa e avaliação molecular dos genes candidatos (HSP60, GRP78, SOD1 e MORF4L2). Os dados foram submetidos ao teste t-student ou ANOVA seguida de teste Tukey quando apropriado (Prism 5 GraphPad Inc.). Não houve diferença entre os índices de clivagem dos grupos rápido e lento, no entanto maior quantidade de embriões rápidos chegaram ao estádio de blastocisto quando comparado com o grupo lento. Não houve diferença no número total de células e células TUNEL positivas entre grupos em nenhum dos momentos analisados. Apesar disso, quando o embrião está no estádio de mórula, no qual ocorre a ativação do genoma, classificada como uma fase crítica, as quantidades de caspase 3 e 7 e caspase total ativas foram maiores no grupo lento quando comparado com grupo rápido. Pela análise de expressão dos genes candidatos GRP78, HSP60, SOD1 e MORF4L2, foi possível evidenciar que os mecanismos de resposta ao ambiente PIV são diferentes entre os grupos analisados. Esse trabalho nos permite concluir que quando submetidos a PIV, embriões de diferentes cinéticas ativam vias distintas de resposta ao estresse, que podem ou não levar a morte celular por apoptose. Mais ainda, a fase de ativação do genoma embrionário é a fase mais crítica para ambos os grupos.

Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / A morfologia e as taxas de clivagem e de blastocistos têm sido critérios utilizados para avaliação da competência embrionária. Entretanto, com o advento de novas biotecnologias tem-se tornado claro que a competência embrionária pode ser severamente comprometida sem alterações morfológicas perceptíveis. Estudos em embriões humanos propuseram avaliações morfológicas adicionais relacionadas ao momento das primeiras divisões celulares embrionárias (rápida e lenta) que parecem estar relacionadas com a viabilidade do embrião. No entanto, ainda não existem muitos dados dessa análise morfocinética em bovinos. A viabilidade embrionária também pode ser severamente comprometida pelo acúmulo de lipídeos nos embriões PIV, podendo inclusive prejudicar aplicações comerciais como a criopreservação. Com isso, o objetivo desse estudo foi caracterizar em embriões bovinos de cinéticas diferentes de desenvolvimento (rápido e lento) o padrão de metabolismo lipídico. Para tal, embriões produzidos in vitro foram analisados quanto a quantidade de lipídeos totais e caracterização de lipídeos de membrana nos estádios iniciais de clivagem (22hpi e 96hpi) e blastocisto. Para o estádio de blastocisto também foi incluído um grupo de embriões in vivo. Foi possível evidenciar menor quantidade de lipídeos totais pela coloração SUDAN BLACK B nos grupos lentos. As análises de MALDI-MS evidenciaram lipídeos de membrana com padrões distintos nos grupos rápidos e lentos nos estádios de clivagem e mórula. Já nos estádios de blastocistos os dados nos permitem inferir que o grupo de blastocisto lento parece estar mais próximo do grupo in vivo, pela semelhança na abundância/intensidade relativa no maior número de íons revelados pelas análises multivariadas. No entanto, o grupo lento ainda mostra alguma semelhança com o grupo rápido devido a exposição ao mesmo ambiente in vitro. / Embryo viability and competence have been evaluated by criteria such as morphology and cleavage and blastocyst rates. However, the advent and application of new biotechnologies have demonstrated that embryonic competence can be severely compromised without noticeable morphological changes. Human embryo studies proposed the use of additional morphological evaluations related to the moment of the first embryonic cell divisions and its kinetic (fast and slow), which appear to be relevant to the embryo viability. Nevertheless, there are still not enough data available related to the morphokinetic analysis of embryos in bovine cattle. Embryo viability can also be severely compromised by lipid accumulation in IVP (in vitro produced) embryos and can even harm commercial applications such as cryopreservation. Therefore, the aim of this study was to evaluate and characterize the pattern of lipid metabolism on bovine embryos with different developmental kinetics (fast and slow). For this goal, IVP embryos were analyzed considering the lipids total amount and membrane lipids characterization during the cleavage early stages (22hpi and 96hpi) and blastocyst stage. The study also included a group of in vivo embryos at the blastocyst stage. The results, using SUDAN BLACK B staining technique, showed a smaller amount of total lipids in the slow groups. The MALDI-MS analysis results showed different patterns of membrane lipids in the fast and slow groups in the cleavage and morulae stages. The data obtained at the blastocyst stage allow us to infer that the slow group is more similar to the in vivo group, since the results showed similarity in relative quantity/intensity in a greater number of ions revealed by multivariate analysis. However, the slow group still shows some similarity with the fast group due to the exposure to the same in vitro environment.

Tendo em vista a possibilidade de que a adição de ácidos graxos ao meio de cultivo embrionário aumente a sobrevivência ao congelamento, a proposta deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de quatro ácidos graxos isoladamente ao meio de cultivo, dois do grupo ômega 6 (ácido linoléico e ácido linoléico conjugado) e dois do grupo ômega 3 (ácido eicosapentaenóico e ácido docosahexaenóico), na produção de embriões, no número de células, na quantidade de lipídeos, na taxa de re-expansão da blastocele após 48 horas de cultivos pós-descongelamento, na taxa de eclosão pósdescongelamento e na taxa de gestação. Para tal, os oócitos bovinos colhidos de ovários de vacas abatidas foram maturados, fecundados e cultivados in vitro em atmosfera de 5% CO2 em ar, à 38,8°C e máxima umidade. No cultivo, foi adicionado isoladamente um destes ácidos graxos, e foram avaliadas a taxa de clivagem, e a produção de embriões no sétimo e oitavo dia de cultivo. No sétimo dia, os blastocistos expandidos foram congelados com 1,5M de etileno glicol. Eles permaneceram nesta solução por 9 minutos antes de serem envasados e seguirem para a maquina de congelamento numa taxa de resfriamento de 0,5°C/minuto até chegarem à temperatura de -32°C. Dos embriões que foram congelados, alguns seguiram para o descongelamento e voltaram para o cultivo in vitro para avaliação da reexpansão e taxa de eclosão pós-descongelamento. Outros foram transferidos para receptoras sincronizadas para avaliação da taxa de gestação. Outros grupos de embriões permaneceram até o oitavo dia de cultivo e foram corados com Hoechst 33342 para contagem dos núcleos, e corados com Nile Red para avaliação do conteúdo total de lipídeos. Em geral, a adição isolada de ácidos graxos do grupo ômega 6 (CLA e LA) na produção in vitro de embriões bovinos aumentou a taxa de sobrevivência ao congelamento (criotolerância), no entanto, não houve um aumento no número de células, nem diferença no conteúdo total de lipídeos nos embriões analisados. A taxa de gestação também não diferiu estatisticamente entre os grupos testados in vivo, porém foi observado um aumento de 200% na taxa de gestação dos embriões cultivados na presença de CLA. Novos estudos devem ser desenvolvidos para comprovar o efeito do aumento da criotolerância e melhorias nas taxas de gestações dos embriões, além de estudos da composição de lipídeos nos embriões e membranas. / In the view of the possibility that the addition of fatty acids in the embryo growing medium increase the survival rate after cryopreservation, this study was proposed to evaluate the effect of the addition of four fatty acids in culture medium, two of the omega 6 group (linoleic acid and conjugated linoleic acid) and two of the omega 3 group (eicosapentainoic acid and docosahexaenoic acid), in the rate of production of blastocysts, blastocyst cell number, blastocyst amount of lipids , re-expansion of blastocele rate after 48 hours of culture post-thaw, post-thaw hatching rate and pregnancy rate. The oocytes obtained by punction of slaughterhouse cows were matured in vitro, fertilized in vitro and cultured in vitro in an atmosphere of 5% CO2 in air, to 38,8°C and maximum moisture. Fatty acids were supplemented individually and cleavage rate and production of embryos in the seventh and eighth days of culture were assessed. On seventh day, the expanded blastocysts were frozen with 1.5M of ethylene glycol. They remained in this solution for nine minutes before introduction in a straw followed and then in a freezing machine with a chilling rate of 0,5°C/minute until temperature of -32°C. Frozen embryos were then divide in two groups: one was thawed and returned to in vitro culture in other to assess the reexpansion and post-hatching rate, and other was transferred to synchronized recipients to assess the pregnancy rate. Another unfreezed group of embryos were stained with Hoechst 33342 for counting the nuclei, or stained with Nile Red to estimate the lipids contents. In general, the addition of fatty acids omega 6 group (LA and CLA) increased the survival rate to the freezing (cryotolerancy), however, there was no increase in the number of cells, or difference in the lipids contents. In the CLA treated embryos, the pregnancy rate of the freezed embryos did not differ from groups tested in vivo, but there was a 200% increase in the pregnancy rate. Further studies should be developed to prove the improvements in the rates of pregnancies of omega 6 treated embryos, besides a study of the composition of lipids of embryos and membranes should be conducted.

Apesar da grande melhora nos resultados de desenvolvimento embrionário in vitro, cerca de 40% dos oócitos bovinos fecundados não completam o desenvolvimento na fase de pré-implantação. Diversos fatores estão relacionados a este fenômeno, conhecido como bloqueio do desenvolvimento embrionário. Partindo da premissa que o bloqueio no desenvolvimento ocorre normalmente, durante a ativação do genoma embrionário, aproximadamente, no 4º ciclo celular em bovinos, formulou-se a hipótese de que os genes transcritos no momento da ativação do genoma embrionário estão relacionados ao bloqueio. Nesta tese, um sistema fluorescente de Differential Display PCR (DDPCR) foi desenvolvido para isolar e identificar fragmentos de mRNAs expressos diferencialmente entre embriões que se desenvolvem mais rápido e com melhor taxa de desenvolvimento e aqueles que apresentam desenvolvimento mais lento e com maior taxa de bloqueio. Dentre 176 fragmentos recuperados, 27 foram clonados, seqüenciados e 30 genes identificados. Dois genes, PI3K e ITM2B foram quantificados pela PCR em tempo real. Os resultados sugerem que duas diferentes ativações do genoma podem estar ocorrendo: o grupo de desenvolvimento rápido ativa genes ligados ao desenvolvimento embrionário e, o grupo lento ativa os genes ligados à sobrevivência ou morte celular. / The embryonic developmental block occurs at the 8-cell stage in bovine and is characterized for a lengthening of the cell cycle. At the same stage, also takes place the maternal-embryonic transition (i.e. the activation of the embryonic genome). These events are highly correlated and many genes are activated at the 4th cell cycle however, their functions are mostly unknown. The study of gene expression during this stage will help understand the mechanisms involved in the maternal-embryonic transition and ultimately lead to improvements of in vitro embryo production rates. The aim of this study was to identify genes differentially expressed between bovine embryos with or without developmental competence to reach the blastocyst stage, using Differential Display PCR methodology. Embryos with fast cleavage divisions showing 8 cells at 48 hpi and high potential of development (R8), and embryos with slow cleavage divisions showing 4 cells at 48hpi (L4) and 8 cells at 80 hpi (L8), both with reduced rates of development to blastocyst, were analyzed. We developed an alternative protocol for amplification and recovery of differentially expressed genes from extremely small initial amounts of RNA (10 to 25 pg of mRNA) from preimplantation bovine embryos without need of radio-isotopes. A total of 176 differentially expressed bands were recovered, 27 isolated-fragments were cloned and sequenced confirming the expected primer sequences and allowing the recognition identification of 30 gene transcripts related to bovine embryonic physiology. Two genes, PI3K and ITM2B were chosen for relative quantification of mRNA using Real-Time PCR. Results suggest two different embryonic genome activation mechanisms: fast-developing embryos activate genes related to embryonic development, and slow-developing embryos activate genes related to cellular survival and/or death.

Dentre as tecnologias de reprodução assistida (TRAs), a produção in vitro de embriões (PIVE) bovinos é a mais amplamente estudada, além de possuir um grande interesse econômico. Entretanto, existem fatores que influenciam negativamente a taxa de produção embrionária e o sucesso da gestação. Sabe-se que embriões provenientes das TRAs apresentam frequentemente alterações epigenéticas, relacionadas principalmente ao microambiente no qual os gametas e embriões se desenvolvem. A suplementação com ácido fólico parece prevenir tais erros epigenéticos, visto que além de ser um importante composto vitamínico, ele pode atuar como doador de grupamentos metil e possui ação antioxidante. A adição de ácido fólico durante a maturação oocitária parece influenciar positivamente a PIVE, além de existir evidências de que ele possa alterar os níveis de metilação do DNA e a expressão de genes importantes ao desenvolvimento embrionário. Sendo assim, este trabalho teve como objetivo, avaliar a influência de diferentes concentrações de ácido fólico durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos de diferentes qualidades (graus I e III) na produção embrionária e na expressão dos genes IGF2 e LIT1 em blastocistos bovinos. Para tanto, três diferentes concentrações de ácido fólico (10, 30 e 100µM) foram avaliadas durante a MIV, em que 2159 oócitos (1087 oócitos grau I e 1072 oócitos grau III) foram maturados, fertilizados e cultivados por sete dias. Os blastocistos foram avaliados quanto à (1) taxa de produção nos diferentes tratamentos e origem dos oócitos e (2) a expressão dos genes IGF2 e LIT1 foi investigada utilizando a transcrição reversa associada a PCR quantitativa. A análise estatística foi realizada através do teste t de Student. A avaliação da produção embrionária mostrou que a adição de 10µM de ácido fólico influencia positivamente a produção de embriões provenientes de oócitos grau III (p=0,017), enquanto em embriões provenientes de oócitos grau III não foi observada influência. O segundo tratamento mostrou que a adição de 30µM de ácido fólico parece não influenciar tanto embriões provenientes de oócitos grau I quanto grau III. Por outro lado, a adição de 100µM de ácido fólico prejudica o desenvolvimento de embriões provenientes de oócitos grau I (p=0,043), mas parece não influenciar os embriões provenientes de oócitos grau III. Quando avaliada a expressão gênica, o gene IGF2 foi expresso em 25% das amostras, sendo que, com exceção de uma amostra, todas eram provenientes de oócitos grau I. Apesar do gene LIT1 ser expresso em todas as amostras analisadas, não foram observadas diferenças entre os embriões cujos oócitos foram maturados na ausência ou na presença de ácido fólico, independente da concentração adicionada ou origem oocitária (graus I ou III). A adição de ácido fólico durante a maturação de oócitos bovinos parece ser interessante para a PIVE. No entanto, a concentração e a qualidade oocitária parecem ser fatores importantes para a produção embrionária, visto que menores concentrações favorecem oócitos de baixa qualidade enquanto que maiores concentrações prejudicam oócitos de maior qualidade. Por fim, as alterações na produção embrionária devido à adição de ácido fólico parecem não estar relacionada com os níveis de expressão dos genes IGF2 e LIT1. / Among assisted reproductive Technologies (ARTs), in vitro production (IVP) of bovine embryos is the most studied, besides exist a great economic interest. However, there are many factors that negatively influences production rates and pregnancy success. It\'s know that embryos produced by ARTs frequently present epigenetics alterations, related, specially, to the microenvironment where occurs the development of gametes and embryos. Supplementation with folic acid seems to prevent these epigenetics damages, since it is an important component and may act like a methyl donor and has antioxidant action. Folic acid addition during oocitary maturation seems to positively influences embryos IVP, in addition there are evidences that it may alter DNA methylation levels and expression of important genes during embryo development. Thus, this paper had as objective; evaluate different concentrations of folic acid during in vitro maturation (IVM) of different bovine oocytes (Grade I and III) on the embryo production and expression of IGF2 and LIT1 gene in the bovine blastocyst. For this purpose, three different folic acid concentrations (10, 30, and 100µM) were evaluated during IVM, when 2159 oocytes (1087 grade I and 1072 grade III) were matured, fertilized and cultured during seven days. Blastocysts were evaluated for (1) production rates in different treatments and oocyte type and (2) expression of IGF2 and LIT1 was investigated using quantitative reverse transcription PCR. Statistical analysis was realized using student t test. Embryo production analysis revealed that addition of 10µM of folic acid positively influences production of embryos from oocytes grade III (p=0,017), whereas in embryos from oocytes grade I this influence wasn\'t observed. The second treatment showed that 30µM of folic acid didn\'t influence both embryos from oocytes grade I and embryos from oocytes grade III. On the other hand, addition of 100µM of folic acid damages the development of embryos provide from oocytes grade I (p=0,043), but this wasn\'t observed in embryos provide from oocytes grade III. When evaluated gene expression, IGF2 gene were expressed in 25% of all samples, being that, with exception of one sample, all of them were embryos from oocytes grade I. Despite LIT1 expression were detected in all samples, wasn\'t observed statistical difference between embryos whose oocytes were matured in the absence or presence of folic acid, independent of concentration added or oocytes types (grades I ou III). Folic acid addition during bovine oocytes maturation seems to be interesting to embryo IVP. However, folic acid concentration and oocyte quality seems to be important factors to embryo production, since lower concentration its beneficial for lower quality oocytes, while higher folic acid concentration damage better oocytes. Finally, embryos production rates alterations due folic acid addition appears to be unrelated with expression levels of IGF2 and LIT1.