Submitted by Cláudia Bueno (claudiamoura18@gmail.com) on 2016-04-25T17:01:02Z No. of bitstreams: 2 Tese - Thaisa Campos Marques - 2016.pdf: 2492479 bytes, checksum: b5a2ef86d3f378ebc4e6976e2ca80765 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2016-04-26T10:50:25Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Thaisa Campos Marques - 2016.pdf: 2492479 bytes, checksum: b5a2ef86d3f378ebc4e6976e2ca80765 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-26T10:50:25Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Thaisa Campos Marques - 2016.pdf: 2492479 bytes, checksum: b5a2ef86d3f378ebc4e6976e2ca80765 (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Melatonin treatment and blastocoel collapse had been suggested to be potent options to enhance embryo development and viability after cryopreservation of bovine embryos. The present study tested these alternatives with the aim to improve cryotolerance of bovine embryos produced in vitro. First, the effects of melatonin (MEL) were evaluated at three concentrations in Maturation Media (IVM) and/or Culture Media (IVC) (0, 10-7, 10-9, 10-11 M). The results showed that MEL10-9 in IVM could improve slightly the cleavage rate. However, when applied during IVC, MEL10-9 resulted in improved blastocysts rates and reduced numbers of apoptotic cells (NAC), a higher expression of antioxidative genes without changing the expression metabolism-related, placentation and anti-apoptotic genes. After, the MEL treatment giving the best result in first experiment (MEL 10-9 M in IVC) was combined with blastocoel collapse (BC) immediatly before vitrification. The survival and embryo quality were investigated. This experiment confirmed that independent of BC, MEL supplementation in IVC enhanced re-expansion and hatching rates of vitrified embryos. However, embryos cultured without MEL required more time during re-culture for all expansion. Embryos produced with MEL had similar NAC irrespective of vitrification and BC. BC did not affect embryo quality, in terms of the expression of genes involved in metabolism, oxidative stress, cell repair, placentation and implantation. Therefore, this research concluded that: (i) at 10-9 M concentration, MEL used during IVC improved embryo quality and development, and it minimized the oxidative stress and apoptosis in cells; (ii) embryos cultured with melatonin, vitrified and re-cultured can be transfered in less time; (iii) the blastocoel collapse benefited hatching when embryos were cultured with MEL in IVC; (iv) embryos cultured in IVC with MEL showed better quality and viability, and independently of BC. This information has a potential value for researchs on embryo cryotolerance. / O tratamento com melatonina e a retirada do fluido da blastocele de blastocistos tem sido sugeridos como potentes opções para melhorar o desenvolvimento e a viabilidade embrionária após a criopreservação de embriões de bovinos. O presente estudo testou essas alternativas com o objetivo de melhorar a criotolerância de embriões bovinos produzidos in vitro. Em primeiro lugar, os efeitos da melatonina (MEL) foram avaliados em três concentrações no meio de maturação (MIV) e/ou meio de cultivo (CIV) (0, 10-7, 10-9, 10-11 M). Os resultados mostraram que MEL10-9 no MIV pode melhorar significativamente a taxa de clivagem. No entanto, quando aplicado durante o CIV, MEL10-9 resultou em melhores taxas de blastocistos, reduzido número de células apoptóticas (NCA), maior expressão de genes antioxidantes sem alterar a expressão de genes anti-apoptóticos e relacionados ao metabolismo e placentação. Depois, o tratamento de MEL com melhor resultado no primeiro experimento (MEL 10-9 M no CIV) foi combinado com a retirada do fluido da blastocele (RFB) imediatamente antes da vitrificação. Foram investigadas a qualidade e sobrevivência de embriões. Este estudo confirmou que independente da RFB, a suplementação MEL no CIV melhorou a re-expansão e eclosão dos embriões vitrificados. No entanto, embriões cultivados sem MEL necessitou de maior período de recultivo para sua total re-expansão. Embriões produzidos com MEL tiveram similar NCA, independentemente da vitrificação e RFB. A RFB não afetou a qualidade do embrião em termos de expressão de genes envolvidos no metabolismo, estresse oxidativo, reparo celular, placentação e implantação. Portanto, esta investigação conclui que: (i) na concentração de 10-9 M, MEL utilizada no CIV melhorou a qualidade e desenvolvimento do embrião e, minimizou o estresse oxidativo e a apoptose celular; (ii) os embriões cultivados com MEL, vitrificados e re-cultivados podem ser transferidos em menor tempo; (iii) a RFB beneficiou a eclosão quando os embriões foram cultivados com MEL no CIV; (iv) embriões produzidos com MEL no CIV apresentaram melhor qualidade e viabilidade, independentemente da RFB. Esta informação tem um valor potencial para pesquisas sobre criotolerância embrionária.

Apesar da melhoria no sistema de produção e cultivo dos embriões in vitro, cerca de 60% dos oócitos que entram no sistema, não atingem o estágio de blastocisto e a qualidade dos embriões obtidos é bastante variável quando comparadas com embriões produzidos in vivo. Este bloqueio pode ser afetado por íons inorgânicos, tampões, aminoácidos e composição da atmosfera gasosa. Partindo-se da premissa que há influência da mitocôndria sobre a ativação da morte celular programada levou-nos a formular a hipótese que ausência de fragmentação nuclear nos embriões antes das 72 hpi está relacionada com a ausência do potencial de membrana mitocondrial e a inibição da OXPHOS pela utilização de bloqueadores leva a manutenção de baixos níveis de potencial de membrana mitocondrial e baixas taxas de fragmentação nuclear nos embriões. Embriões foram produzidos in vitro mediante maturação durante 22 horas, fecundação e cultivo 18 horas após a inseminação (hpi). Decorridas 24hpi realizou-se o cultivo com 0% de oxigênio, a fim de bloquear o processo de OXPHOS. Após 48 hpi realizou-se o feeding do meio de cultivo (SOF) com inibidores da OXPHOS (antimicina A e/ou oligomicina, cianeto de potássio) em diferentes doses. O número de embriões 8 células foi determinado às 80 hpi, mesmo momento em que foram realizadas as técnicas de JC-1 e TUNEL. Verificou-se as 168 hpi o efeito dos tratamentos no desenvolvimento embrionário. Os resultados obtidos com a inibição da OXPHOS após 48 hpi com oligomicina e/ou antimicina A nas doses utilizadas não alterou a capacidade do embrião atingir o estádio de 8 células. Entretanto, esta inibição inviabilizou o desenvolvimento até o estádio de blastocisto. O tratamento com KCN permitiu o desenvolvimento até o estádio de 8 células e a blastocisto em taxas semelhantes ao controle. A inibição do cultivo na ausência do O2 inviabilizou o processo de cultivo. Já os resultados obtidos quanto ao Ψmm e TUNEL evidenciam que os tratamentos dos embriões antimicina e/ou oligomicina levaram a um aumento do Ψmm e fragmentação nuclear na maioria dos embriões testados. Portanto, não foi possível testar a hipótese de que o Ψmm é necessário para o estabelecimento da MCP, todavia, foi observada uma correlação positiva entre Ψmm e fragmentação nuclear. / Although in vitro embryo production has been improved in the last 2 decades, about 60% of the oocytes do not reach the blastocyst stage and embryo quality is very variable when compared with in vivo produced embryo. This developmental block can be affected by inorganic ions, buffers, aminoacids and gaseous atmosphere composition. The knowledge that there influence of mitochondria on the activation of the programmed cellular death led to formulate the hypothesis that nuclear fragmentation absence in embryos before 72 post insemination is related with absence of mitochondrial membrane potential and OXPHOS blockage by inhibiting agents, would cause the maintenance of low levels of mitochondrial membrane potential and low rates of embryo nuclear fragmentation. Embryos were cultured in vitro for 18 hours post insemination (hpi) and after 24 hpi, they were submitted to 0% oxygen culture, in order to block the OXPHOS process. At 48 hpi, feeding was performed with SOF medium containing OXPHOS inhibitors (antimycin A and/or oligomycin, potassium cyanide) in different concetrations. The numbers of 8 cell embryos were estimated at 80 hpi, the same moment that they were submitted to JC-1 probes and TUNEL for mitochondrial membrane potential and DNA damages evaluation, respectively. At 168 hpi the effect of the treatments was verified on embryonic development. The results obtained with the OXPHOS inhibition after 48 after hpi using oligomycin and/or antimycin A did not modify embryo capacity to reach 8 cell stage. However, this inhibition prevented development to the blastocyst stage. KCN treatment allowed development up to the 8 cell stage and blastocyst similar to controls. The absence of O2 prevented embryo development. The Ψmm and TUNEL results showed that antimycin and/or oligomycin treatment increased Ψmm and nuclear fragmentation in the majority of the embryos tested. In conclusion, it was not possible to test the hypothesis that Ψmm is necessary to the establishment of MCP, but a positive correlation between Ψmm and nuclear fragmentation was observed.

Submitted by biblioteca unifenas (biblioteca@unifenas.br) on 2018-03-05T22:12:22Z No. of bitstreams: 1 Sávio Carneiro Martins Dissertacao.pdf: 1917056 bytes, checksum: 1e6b06de6f8c419963c162ad0230fffa (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-05T22:12:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sávio Carneiro Martins Dissertacao.pdf: 1917056 bytes, checksum: 1e6b06de6f8c419963c162ad0230fffa (MD5) Previous issue date: 2015-03-30 / Due to the importance of in vitro embryo production (IVEP) to accelerate genetic improvement is important the search for technological innovation that can enhance the in vitro embryo development. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) have been widely used as a feeder layer to support embryonic stem cells due to their release of growth factors. Mesenchymal stem cells (MSCs) from different sources were also found to release bioactive factors that can support cell growth. This study aims to investigate the effect of co-culture of MSC from rat bone marrow or MEF as a feeder source for in vitro production of bovine embryos. Cumulus oophorus complexes were matured into three groups: control (CTRL), co-culture with monolayer of mesenchymal cells of rats (MSC) or co-cultured with monolayer of embryonic fibroblasts of mice (MEF). Fertilization was performed in control condition for all groups, and in vitro fertilized embryos were cultured from fourth day on in CTRL, co-culture with MSC or co-cultured with MEF, so that the following groups were performed: (CTRL / CTRL) - maturation and embryo development in CTRL conditions; (CTRL / MSC) - maturation in CTRL and embryo development with MSC from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (CTRL / MEF) - maturation CTRL and embryo development with MEF from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (MSC / CTRL) - MSC during maturation and embryo development in CTRL; (MSC / MSC) - maturation and embryo development in MSC from the fourth day on after the beginning of the in vitro embryo culture; (MEF / CTRL) - maturation and embryo development in MEF and CTRL (MEF / MEF) - maturation and embryo development in MEF from the fourth day on after the beginning of embryo development in vitro. No significant difference was found among the oocytes matured in CTRL, MSC and MEF conditions for metaphase II and apoptosis rates and for cleavage rate in embryos at 4th day after the beginning of the in vitro culture. The number of cells in the inner cell mass, trophoblast cells, apoptotic cells and total cells were similar (P> 0.05) in the embryos from all experimental groups. The rates of blastocyst formation, expanded, hatched and the total of blastocysts did not differ among experimental groups (P> 0.05) at 7th day of embryo development. At eighth day of embryo culture we observed a difference (P <0.05) in hatched blastocyst rate which was higher in the CTRL /CTRL group when compared to MSC/MSC group, however, the proportion of blastocyst, expanded and total blastocysts was not different (P> 0.05). We conclude that there was no significant improvement in bovine embryo development using co-cultures of MSC from rats or MEF when compared to control culture system. However more studies investigating the use of stem cells from other sources or their conditioned medium are needed to better understand the effect of these cells on embryonic development. / Diante da importância da produção in vitro de embriões (PIVE) na expansão do melhoramento genético, é importante a busca de inovações tecnológicas que possam potencializar o desenvolvimento embrionário in vitro. Fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) têm sido amplamente utilizados como camada alimentadora para suportar as células-tronco embrionárias, devido à sua liberação de fatores de crescimento. As células-tronco mesenquimais (MSCs) identificadas a partir de diferentes fontes, também liberam fatores bioativos que possam suportar o crescimento celular. Este estudo tem como objetivo investigar o efeito da co-cultura de MSC de medula óssea de rato ou MEF como fonte alimentadora na produção in vitro de embriões bovinos. Complexo cumulus oophorus foram maturados em três grupos distintos: Controle (CTRL), co-cultura com monocamada de células mesenquimais de ratos (MSC) ou co-cultura com monocamada de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF). A fecundação foi realizada em condição controle para todos os grupos e os embriões fecundados in vitro foram também cultivados a partir do quarto dia em CTRL, co-cultura com MSC ou co-cultura com MEF, formando os seguintes grupos experimentais: (CTRL/CTRL) – maturação e cultivo embrionário em condições CTRL; (CTRL/MSC) – maturação em CTRL e cultivo embrionário em MSC a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (CTRL/MEF) – maturação em CTRL e cultivo embrionário em MEF a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (MSC/CTRL) – maturação em MSC e cultivo embrionário em CTRL; (MSC/MSC) – maturação e cultivo embrionário em MSC a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro; (MEF/CTRL) – maturação em MEF e cultivo embrionário em CTRL e (MEF/MEF) – maturação e cultivo embrionário em MEF a partir do quarto dia após o início do cultivo embrionário in vitro. Nenhuma diferença significativa foi encontrada entre os oócitos dos grupos CTRL, MSC e MEF, na taxa de estruturas em metáfase II, apoptose e clivagem nos embriões de 4 dias após o início do cultivo in vitro. O número de células da massa celular interna, células do trofoblasto, células em apoptose e células totais foram iguais (P>0,05) entre os embriões dos diferentes grupos experimentais. As taxas de embriões em estágio de blastocisto, blastocisto expandido, blastocisto eclodido e blastocistos totais dos grupos experimentais não se diferiram (P>0,05) no sétimo dia de cultivo embrionário. No oitavo dia de cultivo embrionário houve diferença (P<0,05) da taxa de blastocisto eclodido, sendo maior no grupo CTRL/CTRL quando comparado ao grupo MSC/MSC; no entanto, a proporção de blastocisto, blastocisto expandido e blastocistos totais não foram diferentes (P>0,05) entre os grupos experimentais. Concluímos que não houve melhora significativa no desenvolvimento embrionário bovino utilizando co-culturas com MSC de ratos ou MEF de camundongos, quando comparado com sistema de cultura controle. Entretanto, mais estudos investigando o uso de células-tronco de outras fontes ou seu meio condicionado são necessários para se entender melhor o efeito destas células no desenvolvimento embrionário.

Embora a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) seja uma ferramenta promissora, seu amplo uso é impedido devido às altas taxas de mortalidade durante o desenvolvimento dos animais clonados. Acredita-se que a reprogramação epigenética anormal seja a principal causa desta baixa eficiência. Nós hipotetizamos que agentes modificadores de cromatina (AMCs) atingindo a acetilação das histonas e a metilação do DNA poderiam alterar a configuração da cromatina e torná-la mais facilmente reprogramável. Deste modo, fibroblastos bovinos foram tratados com 5-aza-2\'-deoxicitidina (AZA) mais tricostatina A (TSA) ou hidralazina (HH) mais ácido valpróico (VPA) enquanto, em outro experimento, zigotos bovinos clonados foram tratados com TSA. O tratamento dos fibroblastos com AZA+TSA ou HH+VPA aumentou a acetilação das histonas, mas não afetou o nível de metilação do DNA. Entretanto, o tratamento com HH+VPA diminuiu a viabilidade/proliferação celular. O uso destas células como doadoras de núcleo não mostrou efeitos positivos sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação. Em relação ao tratamento dos zigotos clonados com TSA, o tratamento destes mostrou um aumento nos padrões de acetilação das histonas, mas não reduziu o nível de metilação do DNA. Além disso, este tratamento não resultou em efeito positivo sobre o desenvolvimento pré- e pósimplantação. Este trabalho fornece evidências de que o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos clonados com AMCs não tem efeito positive sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação de bovinos clonados. / Although somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a promising tool, its potential use is hampered by the high mortality rates during the development to term of cloned offspring. Abnormal epigenetic reprogramming of donor nuclei after SCNT is thought to be the main cause of this low efficiency. We hypothesized that chromatinmodifying agents (CMAs) targeting chromatin acetylation and DNA methylation could alter the chromatin configuration and turn them more amenable to reprogramming. Thus, bovine fibroblasts were treated with 5-aza-2\'-deoxycytidine (AZA) plus trichostatin (TSA) or hydralazine (HH) plus valproic acid (VPA) whereas, in another trial, cloned bovine zygotes were treated with TSA. The treatment of fibroblasts with either AZA+TSA or HH+VPA increased histone acetylation, but did not affect the level of DNA methylation. However, treatment with HH+VPA decreased cellular viability and proliferation. The use of these cells as nuclear donors showed no positive effect on pre- and post-implantation development. Regarding the treatment of cloned zygotes with TSA, treated one-cell embryos showed an increase in the acetylation patterns, but not in the level of DNA methylation. Moreover, this treatment revealed no positive effect on pre- and post-implantation development. This work provides evidence the treatment of either nuclear donor cells or cloned zygotes with CMAs has no positive effect on pre- and post-implantation development of cloned cattle.

Embora a transferência nuclear de células somáticas (TNCS) seja uma ferramenta promissora, seu amplo uso é impedido devido às altas taxas de mortalidade durante o desenvolvimento dos animais clonados. Acredita-se que a reprogramação epigenética anormal seja a principal causa desta baixa eficiência. Nós hipotetizamos que agentes modificadores de cromatina (AMCs) atingindo a acetilação das histonas e a metilação do DNA poderiam alterar a configuração da cromatina e torná-la mais facilmente reprogramável. Deste modo, fibroblastos bovinos foram tratados com 5-aza-2\'-deoxicitidina (AZA) mais tricostatina A (TSA) ou hidralazina (HH) mais ácido valpróico (VPA) enquanto, em outro experimento, zigotos bovinos clonados foram tratados com TSA. O tratamento dos fibroblastos com AZA+TSA ou HH+VPA aumentou a acetilação das histonas, mas não afetou o nível de metilação do DNA. Entretanto, o tratamento com HH+VPA diminuiu a viabilidade/proliferação celular. O uso destas células como doadoras de núcleo não mostrou efeitos positivos sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação. Em relação ao tratamento dos zigotos clonados com TSA, o tratamento destes mostrou um aumento nos padrões de acetilação das histonas, mas não reduziu o nível de metilação do DNA. Além disso, este tratamento não resultou em efeito positivo sobre o desenvolvimento pré- e pósimplantação. Este trabalho fornece evidências de que o tratamento de células doadoras de núcleo ou zigotos clonados com AMCs não tem efeito positive sobre o desenvolvimento pré- e pós-implantação de bovinos clonados. / Although somatic cell nuclear transfer (SCNT) is a promising tool, its potential use is hampered by the high mortality rates during the development to term of cloned offspring. Abnormal epigenetic reprogramming of donor nuclei after SCNT is thought to be the main cause of this low efficiency. We hypothesized that chromatinmodifying agents (CMAs) targeting chromatin acetylation and DNA methylation could alter the chromatin configuration and turn them more amenable to reprogramming. Thus, bovine fibroblasts were treated with 5-aza-2\'-deoxycytidine (AZA) plus trichostatin (TSA) or hydralazine (HH) plus valproic acid (VPA) whereas, in another trial, cloned bovine zygotes were treated with TSA. The treatment of fibroblasts with either AZA+TSA or HH+VPA increased histone acetylation, but did not affect the level of DNA methylation. However, treatment with HH+VPA decreased cellular viability and proliferation. The use of these cells as nuclear donors showed no positive effect on pre- and post-implantation development. Regarding the treatment of cloned zygotes with TSA, treated one-cell embryos showed an increase in the acetylation patterns, but not in the level of DNA methylation. Moreover, this treatment revealed no positive effect on pre- and post-implantation development. This work provides evidence the treatment of either nuclear donor cells or cloned zygotes with CMAs has no positive effect on pre- and post-implantation development of cloned cattle.

Made available in DSpace on 2014-08-20T14:38:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao_liziane_vianna.pdf: 321138 bytes, checksum: e8e76002b27c6cb6d710d3cd63a4c088 (MD5) Previous issue date: 2011-02-28 / The objective of this study was to evaluate alternative methods to the gradient of Percoll® for sperm selection used in bovine in vitro production systems. We evaluated the following parameters: sperm quality, embryo development, the viability after cryopreservation and sex ratio of bovine embryos produced in vitro. Four treatments were performed: percoll group (90 and 45%) 4 mL, centrifuged at 700xg for 20 min; minipercoll group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; miniisolate group (90 and 45%) 800 &#956;L, centrifuged at 700xg for 5 min; and minioptiprep group (30,28 and 26%) 1,2 mL, centrifuged at 900xg for 15 min. Different gradients did not affect the semen characteristics compared with the evaluation immediately after thawing (P>0,05). It was only observed a decrease in total motility in minioptiprep group (P<0,05). The cleavage rates were similar among the percoll and miniisolate groups (P>0,05). Minipercoll and minioptiprep groups were lower to percoll (P<0,05) and similar to isolate (P>0,05). At Day 7 the developmental rates were higher in miniisolate group than other groups (P<0,05). But at D8 the developmental rates of minigradients were similar to percoll (P>0,05). Among the minigradientes, the miniisolate was higher to minipercoll and minioptiprep (P<0,05). The treatments did not affect the sex ratio expected of 50:50% (P.0,05) and there was no difference among the four groups (P>0,05). Also, there was no difference in survival rates after vitrification (P>0,05). In conclusion, the miniisolate and the minioptiprep groups, in the concentration and volume used in our experiment, reached similar results to the percoll group. So, they are alternatives to the gradient of Percoll® in the routine of IVP bovine embryos. / O objetivo do presente estudo foi avaliar possíveis alternativas ao gradiente de Percoll®, para seleção espermática, no sistema de produção in vitro de embriões bovinos. Foram avaliados os seguintes parâmetros: qualidade espermática, desenvolvimento embrionário, viabilidade após a criopreservação e a proporção sexual dos embriões bovinos produzidos in vitro. Foram realizados quatro tratamentos: grupo percoll (90 e 45%) - 4 mL, centrifugado 700xg por 20 min; grupo minipercoll (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; gupo miniisolate (90 e 45%) 800 &#956;L, centrifugado a 700xg por 5 min; e grupo minioptiprep (30, 28 e 26%) - 1,2 mL, centrifugado a 900xg por 15 min. A passagem pelos gradientes não afetou as características do sêmen em comparação com a avaliação realizada logo após o descongelamento (P>0,05), sendo somente observada uma diminuição da motilidade total para o grupo minioptiprep (P<0,05). Quanto a produção in vitro de embriões, não foi observada diferença na taxa de clivagem entre os grupos percoll e miniisolate (P>0,05), sendo o minipercoll e o minioptiprep inferiores ao percoll (P<0,05) e semelhantes ao miniisolate (P>0,05). No desenvolvimento embrionário, o miniisolate foi superior aos demais grupos em D7 (P<0,05). Em D8, os três minigradientes foram semelhantes ao percoll (P>0,05). Entre os minigradientes, o miniisolate foi superior ao minipercoll e ao minioptiprep (P<0,05). A passagem pelos gradientes não afetou a proporção sexual esperada de 50:50%, além disso, não houve diferença entre os grupos (P>0,05). Não houve diferença quanto à taxa de sobrevivência a vitrificação nos quatro grupos em 48 h (P>0,05). Concluímos que o miniisolate e o minioptiprep, nas concentrações e volumes estudados neste trabalho, atingiram resultados semelhantes ao percoll. Portanto, são alternativas a utilização do gradiente de Percoll®, na rotina de produção de embriões bovinos in vitro.