Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Botânica, Programa de Pós-Graduação em Botânica, 2013. / Submitted by Alaíde Gonçalves dos Santos (alaide@unb.br) on 2014-01-13T13:31:39Z No. of bitstreams: 1 2013_PauloCesarAlvesdeSousa.pdf: 2751877 bytes, checksum: eb53f7827fae946f8607c11f3efa17d0 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2014-01-13T14:30:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2013_PauloCesarAlvesdeSousa.pdf: 2751877 bytes, checksum: eb53f7827fae946f8607c11f3efa17d0 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-01-13T14:30:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2013_PauloCesarAlvesdeSousa.pdf: 2751877 bytes, checksum: eb53f7827fae946f8607c11f3efa17d0 (MD5) / Este trabalho teve como objetivo desenvolver a organogênese e embriogênese somática e avaliar o uso do óleo mineral na propagação e conservação in vitro de Piper aduncum e Piper hispidinervum, bem como avaliar a estabilidade genômica dos acessos regenerados. Plantas germinadas in vitro foram utilizadas como material vegetal. Inicialmente, as sementes passaram por processo de desinfestação, antes da inoculação em meio de crescimento. Para os testes de germinação foram utilizados os meios de cultura de MS e WPM, com incubação nas temperaturas de 25 ºC e 30 ºC, nas condições de luz e escuro. Foi avaliada a taxa de germinação (%), o tempo médio de germinação e a velocidade de germinação. Os resultados sobre a germinação das sementes cultivadas em meio de cultura de MS e WPM a 25 ºC foram: taxa de Germinação = 84% e 81% (P. aduncum MS/WPM), 100% e 100% (P. hispidinervum MS/WPM); tempos médios de germinação = 253,429 e 240,593 horas (P. aduncum MS/WPM), 202,320 e 190,320 horas (P. hispidinervum MS/WPM); velocidades médias de germinação = 3,94 h-1 e 4,14 h-1 (P. aduncum MS/WPM); 4,94 h-1 e 5,25 h-1 (P. hispidinervum MS/WPM). As médias de germinação ficaram com valores próximos em ambos os meios de cultura testados. A germinação das sementes cultivadas em meio WPM a 25 ºC e 30 ºC foram: taxa de Germinação = 81% e 74% (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC), 100% e 96% (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC), tempo médio de germinação = 240,593 e 333,081 horas (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 190,320 e 215,250 horas (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC), velocidades médias de germinação = 4,14 h-1 e 3,00 h-1 (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 5,25 h-1 e 4,64 h1 (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC). A temperatura de 25 ºC proporcionou maior percentagem de germinação dentro do menor espaço de tempo para ambas as espécies. Nos testes de micropropagação foi avaliado o cultivo de microestacas em meios de cultura com diferentes concentrações de sais de MS e WPM (50, 70 e 100%), e em outra etapa, o cultivo em meio de MS adicionado de diferentes concentrações dos reguladores BAP (6-benzilaminopurina) e KIN (Cinetina) (0,00; 0,01; 0,05; 0,1; 0,5; 1,0 e 2,0 mg.L-1). Na primeira etapa os dados apresentaram diferenças significativas no que diz respeito ao número de formação de gemas e à altura em ambas as espécies. P. aduncum apresentou melhores resultados, tanto no número de gemas quanto na altura, quando cultivada em meio com concentrações de 50% e 75% de sais de MS e em 75% e 100% de sais de WPM, enquanto P. hispidinervum apresentou melhor desempenho quando cultivada em meio de WPM nas concentrações de 75% e 100%. Com relação ao meio de cultura adicionado dos reguladores de crescimento, P. aduncum apresentou melhores resultados nos tratamentos com 0,50 mg.L-1 de KIN e 0,05 mg.L-1 de BAP, com maior número de brotos; para P. hispidinervum as concentrações dos reguladores foram significativas apenas quando se utilizou o BAP, com melhores resultados obtidos na concentração de 1,0 mg.L-1. Para se determinar um protocolo visando a embriogênese somática a partir de explantes foliares de P. hispidinervum e P. aduncum foram realizados testes combinando diferentes concentrações de ANA (ácido α-naftalenoacético) e BAP adicionados ao meio de MS, formando 5 tratamentos: T1 (5 mg.L-1 de ANA + 0 mg.L-1 de BAP), T2 (10 mg.L-1 de ANA + 0 mg.L-1 de BAP,) T3 (0 mg.L-1 de ANA + 2,5 mg.L-1 de BAP), T4 (5 mg.L-1 de ANA + 2,5 mg.L-1 de BAP) e T5 (10 mg.L-1 de ANA + 2,5mg.L-1 de BAP). Aos 60 dias de cultivo, no escuro, o tratamento T4 proporcionou os melhores resultados para a indução de calos primários em P. aduncum com 80% de formação de calos. A transferência dos calos primários para o meio T5 (10 mg.L-1 de ANA + 2,5mg.L-1 de BAP) ocasionou a formação de calos embriogênicos e surgimento de embriões somáticos. De maneira geral, a regeneração dos embriões somáticos teve início 15 dias após a transferência para meio de crescimento de MS, sob condições de luz. As plantas regeneradas a partir dos embriões de P. aduncum apresentaram crescimento mais lento, portanto, apenas as plantas regeneradas a partir dos embriões de P. hispidinervum foram pré-aclimatizadas e levadas para casa de vegetação. A citometria de fluxo foi utilizada verificar a estabilidade genômica das plantas de P. hispidinervum regeneradas, no que diz respeito à quantidade de DNA. Os resultados revelaram que o conteúdo médio estimado de DNA de P. hispidinervum provenientes de plantas da embriogênese somática e da casa de vegetação foi de 1,8329 ± 0,02 pg e 1,8666 ± 0,05 pg, respectivamente, não havendo existência de instabilidade genômica nas plantas avaliadas. Para a conservação de germoplasma in vitro foi testada a estratégia de conservação por de imersão em óleo mineral (OM). Microestacas de P. aduncum e P. hispidinervum foram inoculadas em tubos de ensaio e cobertas completamente com óleo mineral, sendo cultivadas durante 30 e 180 dias. Aos 30 dias de cultivo, as estacas de P. aduncum e P. hispidinervum submersas em óleo mineral (OM) apresentaram taxa de 100% e 80% de sobrevivência, respectivamente. As estacas vivas foram transferidas para meio de crescimento e após 120 dias de cultivo apenas as estacas de P. aduncum apresentaram sobrevivência (30 %). Na etapa de 180 dias de cultivo, apenas as estacas de P. aduncum sobreviveram, obtendo taxa sobrevivência 40%. _______________________________________________________________________________________ ABSTRACT / This study aimed to develop the organogenesis, somatic embryogenesis and mineral oil as in vitro propagation and conservation strategies of Piper aduncum and Piper hispidinervum as well as assess the genomic stability of regenerated plants. Germinated seeds passed through the process of disinfecting before inoculation into the growth medium. In order for germination tests were used MS and WPM growing medium, with incubation at 25 º C and 30 º C, under the conditions of light and dark. It was evaluated the rate of germination (%), the germination mean time and the speed of germination. The measures of seed germination grown on MS and WPM medium at 25 °C were: rate of germination= 84% and 81% (P. aduncum MS/WPM), 100% and 100% (P. hispidinervum MS/WPM); germination mean time= 253,429 and 240,593 hours (P. aduncum MS/WPM), 202,320 and 190,320 hours (P. hispidinervum MS/WPM); speed of germination= 3,94 h-1 and 4,14 h-1 (P. aduncum MS/WPM); 4,94 h-1 and 5,25 h-1 (P. hispidinervum MS/WPM). The measures germination have demonstrated similar values in both growing medium. The measures of seed germination grown on WPM medium at 25 °C and 30 ºC were: rate of germination= 81% and 74% (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC), 100% and 96% (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC); germination mean time= 240,593 and 333,081 hours (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 190,320 and 215,250 hours (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC); speed of germination= 4,14 h-1 and 3,00 h-1 (P. aduncum 25 ºC / 30 ºC); 5,25 h-1 and 4,64 h-1 (P. hispidinervum 25 ºC / 30 ºC). The temperature 25 °C had proportioned higher percentage of germination into the shortest time in both species. In the micropropagation tests were evaluated microshoots growing in MS and WPM medium with different concentrations of salts (50, 70 and 100%), and in another step, the culture in MS medium supplemented with different concentrations of BAP (6-benzylaminopurine) and kinetin regulators. (0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1.0 and 2.0 mgL-1). In the first step the results showed significant differences regarding the number of bud formation and height in both species. P. aduncum achieved better results, as numbers of buds as height when grown in medium with 50%, 75%, 100% MS and 50%, 75% and 100% WPM salts concentrations, on the other hand, P. hispidinervum showed the best performance when cultivated in 75% and 100% WPM medium concentrations. Regarding to the culture medium supplemented with regulators, P. aduncum achieved better results in the treatments with 0.50 mgL-1 kinetin and 0.05 mgL-1 BAP which resulted in larger number of shoots, for P. hispidinervum concentrations of regulators were significant only with the use of BAP, and the best results obtained in the concentration of 1.0 mg.L-1. In order to determine a protocol aiming the formation of callus from leaf explants of P. hispidinervum and P. aduncum tests were conducted by combining different concentrations of NAA (α-naphthaleneacetic acid) and BAP added to MS medium, forming 5 treatments: T1 (5 mg.L-1 NAA + 0 mg.L-1 BAP), T2 (10 mgL-1 NAA + 0 mg.L-1 BAP) T3 (0 mg.L-1 + NAA 2.5 mg.L-1 BAP), T4 (5 mg.L-1 + NAA 2.5 mg.L-1 BAP) and T5 (10 mg.L-1 NAA + 2.5 mg.L-1 BAP). Treatment T4 showed the best result in the primary callus induction after 60 days of culture in the dark (P. aduncum with 80% and P. hispidinervum 32% of primary callus formation). The transfer of calluses primary for the treatment T5 (10 mg.L-1 de NAA + 2.5 mg.L-1 de BAP) resulted in the formation of embryogenic callus and somatic embryo emergence. The regeneration of the embryos began 15 days after transfer to growth medium with salts and nutrients of MS and cultivation under light conditions. Plants regenerated from the embryos of P. aduncum grew slower, so only the plants regenerated from the embryos of P. hispidinervum were pre-acclimatized and taken to a greenhouse. The flow cytometry was used to verify the stability of the genome of P. hispidinervum plants regenerated with regard to the amount of DNA. The results showed that the estimated DNA contents of P. hispidinervum from somatic embryogenesis and greenhouse (1.8329 ± 1.8666 ± 0.02 pg and 0.05 pg) with a coefficient of variation below 5% leads to the conclusion about the absence of genomic instability in plants obtained by somatic embryogenesis. For Germplasm in vitro conservation was tested conservation strategy by immersion in mineral oil (MO). Microshoots from P. aduncum and P. hispidinervum were inoculated into sampling tubes and completely covered with mineral oil and cultured for 30 and 180 days. After 30 days of culture, the stakes of P. aduncum and P. hispidinervum submerged in mineral oil (MO) had a survival rate of 100% and 80% respectively. The live cuttings were transferred to growth medium and after 120 days of cultivation only cuttings of P. aduncum showed a survival rate (30%). In the stage 180 days of cultivation, cuttings P. aduncum and P. hispidinervum submerged in mineral oil (MO) had survival rates of 40% and 0% respectively.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2006. / Submitted by Thaíza da Silva Santos (thaiza28@hotmail.com) on 2009-11-30T23:47:25Z No. of bitstreams: 1 dissertacao Flávia Melissa de Souza Moraes.pdf: 3544803 bytes, checksum: 711ca4494d2c03b3a5d69511c5faab6b (MD5) / Approved for entry into archive by Daniel Ribeiro(daniel@bce.unb.br) on 2010-01-12T23:46:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 dissertacao Flávia Melissa de Souza Moraes.pdf: 3544803 bytes, checksum: 711ca4494d2c03b3a5d69511c5faab6b (MD5) / Made available in DSpace on 2010-01-12T23:46:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao Flávia Melissa de Souza Moraes.pdf: 3544803 bytes, checksum: 711ca4494d2c03b3a5d69511c5faab6b (MD5) Previous issue date: 2006-08-29 / Ocotea catharinensis é uma espécie lenhosa florestal nativa da Mata Atlântica que possui grande importância econômica devida à sua madeira e à produção de óleos essenciais. Por causa de sua intensa exploração comercial e da baixa reprodução e viabilidade de suas sementes, O. catharinensis tornou-se ameaçada de extinção. O objetivo deste trabalho foi estudar a embriogênese somática de O. catharinensis por meio da análise proteômica comparativa dos diferentes estágios embriogênicos e também de agregados celulares cultivados em diferentes meios de cultura que produzem células com distintas competências embriogênicas. Para isso, os extratos de proteínas dos agregados celulares cultivados em diferentes meios (WPM, MS, MS+2,4 D) e dos embriões somáticos nos estágios globular (E1), cotiledonar inicial (E2), cotiledonar intermediário (E3) e embrião maduro (E4) foram submetidos à eletroforese bidimensional (2-DE). As amostras foram maceradas em N2 líquido e pó de vidro e precipitadas com solução de TCA/acetona seguida pela extração e solubilização em tampão 2-DE. A concentração de proteína foi determinada utilizando-se Plus One 2D QuantKit (GE Healthcare). As amostras foram submetidas à focalização isoelétrica utilizando-se géis de gradiente imobilizados de pH (IPG) na faixa de 4-7. Também foram realizados géis bidimensionais "dois-em-um" dos agregados celulares, nos quais os géis IPG com a mesma faixa de pH para duas diferentes amostras foram colocados lado-a-lado no topo de um gel para SDS PAGE vertical para a separação na segunda dimensão (Wang et al., 2003). Após a coloração com nitrato de prata, as imagens dos géis foram digitalizadas e submetidas à análises computacionais para se determinar o número e a intensidade dos spots, levando à informação da expressão diferencial de proteínas. Poucos spots mostraram mudanças de intensidade durante o desenvolvimento e nos meios de cultura testados. Estes spots foram analisados por espectrometria de massa utilizando-se espectrômetros de massa tipo MALDI TOF e nano-LC MS/MS (LTQ Orbitrap). Somente um spot foi identificado por MALDI-TOF e oito por LTQ Orbitrap. Entre os diferentes polipeptídeos identificados estão proteínas estruturais como a actina, proteínas antioxidantes como tiorredoxina, superóxido dismutase e outras como proteínas da família 14-3-3, germina e enzima biossintética de tiamina. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Ocotea catharinensis is a forest tree species from Mata Atlântica that has economic importance due to its wood and essential oils. O. catharinensis became an endangered species mostly because of its intense exploitation and its low seed production and viability. The objective of this work was to study O. catharinensis somatic embryogenesis through the comparative proteome analysis of different embryogenic stages as well as cell aggregates maintained in different culture media that produce distinct cell embryogenic competence. For that, the protein extracts of cell aggregates (calus) cultured in different medias (WPM, MS, MS+2,4-D) and of the somatic embryos in globular (E1), initial cotiledonary (E2), intermediary cotiledonary (E3) and mature embryo (E4) stages were subjected to two-dimensional gel electrophoresis (2-DE). The samples were ground in liquid N2 and glass powder, and the proteins precipitated with TCA/acetone solution followed by extraction and solubilization in 2-DE buffer. The protein concentration was determined using Plus One 2D QuantKit (GE Healthcare). The samples were submitted to isoelectric focusing using pH 4-7 immobilized pH gradient (IPG) strips. We also carried out “two-inone” gels (Wang et al., 2003) of cell aggregates, where IPG strips with the same pH range for two different samples were loaded side by side on top of a vertical SDS-PAGE gel for separation in the second dimension. After silver staining, the gel images were digitalized and subjected to computational analyses in order to determine the number and intensity of the spots, allowing the determination of protein differential expression. Few protein spots showed different intensities during the development and in the different culture media tested. These spots were analyzed by mass spectrometry using MALDI-TOF and nano-LC MS/MS (LTQ Orbitrap). Just one spot were identified by MALDITOF and eight by LTQ-Orbitrap. Among the identified polypeptides, there were structural proteins like actin, antioxidant proteins like tioredoxin, superoxide dismutase and others like the 14-3-3 family, germin and thiamine biosynthetic enzyme.