Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:12Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006Bitstream added on 2014-06-13T18:46:35Z : No. of bitstreams: 1 pyles_escs_dr_botfmvz.pdf: 345793 bytes, checksum: f8cd21a8887d03897e049aa3fce53820 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Neste estudo vitrificou-se em OPS ovócitos (Experimentos 1, 2 e 3) e embriões bovinos (Experimentos 4, 5 e 6) em três soluções de vitrificação distintas: Experimentos 1 e 4) 20%EG + 20%DMSO + 0,5M sacarose; Experimentos 2 e 5) 20%DF + 20%EG + 0,5M sacarose; Experimentos 3 e 6) 20%DF + 20%DMSO + 0,5M sacarose. Os embriões foram vitrificados na presença ou não de citocalasina B. Os ovócitos foram vitrificados ou somente expostos aos crioprotetores imaturos (G0h e G0hexp), ou após 6 horas (G6h e G6hexp), 12 horas (G12h e G12hexp) ou 22 horas de MIV (G22h e G22hexp). Após a exposição ou aquecimento, parte dos ovócitos completou as 22 horas de MIV e foi destinada à PIV, para avaliação da capacidade de se desenvolverem até blastocisto. No restante avaliou-se o estágio de maturação nuclear e a distribuição dos grânulos corticais e das mitocôndrias. Observou-se que a exposição dos ovócitos imaturos (0 ou 6 horas de MIV) aos crioprotetores nos experimentos 1, 2 e 3 resultou em perda substancial de viabilidade, avaliada pelas taxas de clivagem (GC=79,4%; 1G0hexp=37,1%; 1G6hexp=51,1%; 2G0hexp=33%; 2G6hexp=52,5%; 3G0hexp=36,2%; 3G6hexp=49,8%), o que foi menos notável nos ovócitos expostos após 12 ou 22 horas de MIV (1G12hexp=59,1%; 1G22hexp=71,1%; 2G12hexp=61,5%; 2G22hexp=62,5%; 3G12hexp=58,8%; 3G22hexp=68,6%). A realização da MIV antes da vitrificação foi benéfica. Apesar de nenhuma das soluções de crioprotetores ter sido capaz de promover proteção adequada aos ovócitos submetidos à vitrificação em qualquer momento da MIV, no Experimento 1 foi observada clivagem (1G12h=7,3%; 1G22h=4,2%) indicando que a mistura de crioprotetores EG+DMSO foi a mais eficiente nas condições utilizadas. Entretanto, não houve produção de blastocistos em nenhum experimento. Nos Experimentos 4, 5 e 6 notou-se que em todos os grupos... / In this study bovine oocytes (Experiments 1, 2 and 3) and embryos (Experiments 4, 5 and 6) were vitrified in OPS using 3 different cryoprotectant solutions: Experiments 1 and 4) 20%EG + 20%DMSO + 0,5M sucrose; Experiments 2 and 5) 20%DF + 20%EG + 0.5M sucrose; Experiments 3 and 6) 20%DF + 20%DMSO + 0.5M sucrose. Embryos were vitrified in the presence or not of cytocalasin B. Oocytes were vitrified or just exposed to the cryoprotectant solutions after 0h (G0h and G0hexp), 6h of IVM (G6h and G6hexp), 12h of IVM (G12h and G12hexp) and 22h of of in vitro maturation (IVM) (G22h and G22hexp). Oocytes from groups 0 and 6h were considered immature and from 12 and 22h groups were considered mature. After exposure to cryoprotectants or warming, part of the oocytes that completed 22h of IVM were submitted to IVF to evaluate their developmental ability. Another part of the oocytes were used to evaluate nuclear maturation in the distribution of mitochondria and cortical granules. The results showed that the exposure of immature oocytes (0 and 6 hours of MIV) to cryoprotectants reduce their viability, since cleavage rates of all groups were significantly lower compared to control group (GC=79.4%; 1G0hexp=37.1%; 1G6hexp51.1%; 2G0hexp=33%; 2G6hexp=52.5%; 3G0hexp=36.2%; 3G6hexp=49.8%). This effect was less evident in the groups of mature oocytes submitted to IVM for 12 or 22 hours (1G12hexp=59.1%; 1G22hexp=71.1%; 2G12hexp=61.5%; 2G22hexp=62.5%; 3G12hexp=58.8%; 3G22hexp=68.6%). The previous IVM is beneficial to vitrification. Although none of the cryoprotectant solutions utilized were totally efficient in protecting the oocytes form cryodamage, in Experiment 1 cleavage was observed (1G12h=7.3%; 1G22h=4.2%) indicating that the combination of EG+DMSO was more effective than the other two. However in none of the groups blastocyst was formed. When embryos... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2015-07-13T12:10:32Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-11. Added 1 bitstream(s) on 2015-07-13T12:24:09Z : No. of bitstreams: 1 000836344.pdf: 1551165 bytes, checksum: 49d3df701c66be32f547fcbaebe0981c (MD5) / O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da suplementação do meio de cultivo com ácido linoleico e/ou catalase, em meio sem a adição de SFB, cultivados em atmosfera de baixa tensão de oxigênio sobre o desenvolvimento, qualidade e criotolerância de embriões bovinos. Em um grupo foi feita a suplementação com 100 μM de ácido linoleico (LA); 100UI de catalase (CAT) em um segundo, no terceiro grupo foram feitas as 2 suplementações (CAT+LA) e um quarto grupo sem suplementação (CONTROLE), durante todo o período de cultivo em atmosfera de 5%CO2, 7%O2 e 88%N2 em BAGS. As taxas de clivagem não diferiram (P>0,05) entre os grupos. Porém as taxas de produção de embriões em D7 e D8 diferiram (P<0,05), sendo que o controle obteve melhor resultado perante os 3 tratamentos e o grupo CAT+LA gerou a menor taxa de produção (30,7; 22,4; 19,8; 12,4%). Observou-se um atraso no desenvolvimento, sendo os blastocistos expandidos somente encontrados no D8. Na avaliação do conteúdo total de lipídios, houve uma redução significativa (P<0,05) nos 3 grupos tratados em relação ao controle. A medida dos níveis intracelulares de ROS não foi afetada nos 4 grupos (P>0,05). A quantidade de células totais foi significativamente menor (P<0,05) no grupo CAT+LA, e o grupo CAT foi o que apresentou maior porcentagem de células apoptóticas. Em relação à taxa de re-expansão às 24 horas (P<0,05), o grupo controle (50%) e o CAT (67,2%) apresentaram menores taxas que os grupos LA (71,7%) e o CAT+LA (76,7%). Às 48 horas, o grupo controle apresentou a menor taxa (35,7%), seguido pelo grupo CAT (47,5%). Já o grupo LA (56,5%) diferiu estatisticamente do controle mas não dos grupos CAT (47,5%) e CAT+LA (76,7%). O grupo CAT+LA diferiu estatisticamente dos grupos controle e CAT. Com base nestes resultados, embriões tratados com LA ou CAT+LA no cultivo in vitro, na ausêncio... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / The most commonly recommended way to obtain more resistant in vitro embryos during the cryopreservation process is to change these embryos, whether through removal of fetal bovine serum (FBS), addition of different supplements to the culture medium or changes in oxygen tension in the production process. The objective of this study was to assess the effects of supplementation of the culture medium with linoleic acid and/or catalase in medium without the addition of FBS, in low tension oxygen atmosphere on development, quality and cryotolerance of bovine embryos. In one group, the medium was supplemented with 100 μm of linoleic acid (LA); the second was supplemented with 100UI of catalase (CAT), a third group was supplemented with both, CAT+LA and a fourth group received no supplementation (control), during the entire culture period in an atmosphere of 5% CO2, 7% O2 and N2 88% in BAGS. Cleavage rates did not differ (P>0.05) between groups (72.7; 74.1; 72.1; and 72.0%, respectively). However, embryo production rates in D7 and D8 were different (P<0.05), where the control had the highest blastocyst rate of the treatments and the CAT+LA group presented the lowest rate of production (30.7; 22.4; 19.8; 12.4%). Expanded blastocysts were only foundon D8, indicating a delay in development. There was a significant reduction (P<0.05) of total lipids in the 3 treated groups when compared to the control group. There was no difference in the intracellular levels of ROS between the 4 groups (P>0.05).Total cell number was significantly lower (P<0.05) in the CAT+ LA and the CAT group showed the highest percentage of apoptotic cells. Considering the re-expansion rates in 24 hours (P<0.05), the control group (50%) and the CAT group (67.2%) presented lower rates than the LA group (71.7%) and CAT+LA group (76.7%). At 48 hours, the control group showed the worst rate (35.7%) followed by the CAT group (47.5%)...(Complete abstract eletronic access below)

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.

Os materiais de origem animal utilizados na produção in vitro (PIV) de bovinos podem apresentar-se contaminados pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) quando provenientes de animais infectados. Tendo isso em vista é importante realizar estudos aplicados para minimizar a transmissão de patógenos via biotécnicas de reprodução. Os objetivos desse trabalho foram avaliar a capacidade dos métodos de processamento seminal, Swim up, gradiente de Percoll e a combinação Swim up/Percoll em reduzir ou eliminar o BVDV de amostras de sêmen experimentalmente infectadas (Experimento 1), e também, avaliar o efeito do BVDV durante a maturação in vitro (MIV) de complexos cumuli-oophorus bovinos (CCOs), assim como, no seu posterior desenvolvimento embrionário. Foi avaliada também a produção de antígenos nas células do cumulus (CC) em cultivo em comparação com as células MDBK (Experimento2). No Experimento 1 foram obtidas as seguintes faixas de títulos virais após processamento, 100.87 – 102.3 TCID/50/mL no Percoll, 101.87 – 103.3 TCID/50/mL no Swim up e no grupo combinado Swim up/Percoll não foi possível detectar vírus nas amostras. E a PIV produziu taxas de blastulação semelhantes nos grupos de diferentes processamentos seminais avaliados. Os dados mostraram que a combinação Swim up/Percoll reduziu/eliminou significativamente o número de partículas virais nas amostras de sêmen, sem causar danos aos espermatozóides, e também, possibilitou a PIV. No Experimento 2 nossos dados mostraram que os grupos controle (C) e infectado (V) apresentaram padrões diferentes de expansão das CC. A taxa de MIV do grupo C foi significativamente maior do que no grupo V, assim como as taxas de blastulação. Títulos virais mais altos foram obtidos nas CC em comparação com as células MDBK. Os resultados mostraram que a presença do BVDV na MIV infecta as CC, afeta o padrão de expansão das CC e reduz as taxas de maturação e blastulação. Dessa forma conclui-se que os dados obtidos nesse trabalho são extremamente importantes para auxiliar no desenvolvimento de protocolos de lavagem de sêmen a fim de eliminar os microorganismos presentes e possibilitar a produção de embriões livres de patógenos. / The materials of animal origin used in cattle to produce in vitro embryos (IVP) have been shown to contain BVDV when originate from infected animals. Considering that it is important to perform applicable studies to minimize transmission of pathogens via these assisted reproductive techniques. The aim of the study were evaluate the capacity of sperm separation procedures Percoll gradient, Swim-up, and a combination of Swim-up/Percoll, to reduce/eliminate BVDV from experimentally infected semen samples (Experiment 1), and to evaluate BVDV experimentally infection during in vitro maturation (IVM) of bovine cumuli oophorus complexes (COCs) and also BVDV effect on the COCs posterior embryo development. It was also evaluated the production of BVDV antigens through cumulus cells (CC) culture in comparison to MDBK cell culture (Experiment 2). At experiment 1 the virus titration presented a titer range among 100.87 - 102.3 TCID50/mL in Percoll; 101.87 - 103.3 TCID50/mL in Swim up; and undetected for all samples in the Swim up/Percoll. And the PIV produced similar blastocyst rates among the groups. The data showed that the combination of Swim up/Percoll promoted a significant reduction/elimination in the number of viral particles in the semen, without promotion of damage in spermatozoa cells and allow IVP with similar blastocyst rates among the different groups. From experiment 2 our data showed that control (C) and infected (V) groups presented different CC expansion patterns. The IVM rate for C group was higher than V group. Embryo development rate to blastocyst stage was significantly higher in C group than in V group. The highest virus titers were obtained in CC in comparison with MDBK cells. Our findings showed that BVDV presence during IVM infected CC and this affects their expansion pattern, which may be related to the observed reduced nuclear maturation and blastocyst development rates. Therefore it is possible to conclude that our data are extremely important as a help to develop semen washing protocols to eliminate microorganisms and allow the embryo production free of pathogens.