Alix est une protéine adaptatrice impliquée dans plusieurs processus intracellulaires, dont l'apoptose, l'endocytose et le trafic membranaire, le bourgeonnement de certains rétrovirus (ex. HIV-1, EIAV) à travers la membrane plasmique ou encore la cytokinèse. Alix est constituée de trois domaines majeurs: un domaine BRO N-terminal, un domaine spécifique « en V » central (Alix-V) et un domaine C-terminal riche en prolines (PRD). Nous avons montré que la forme tronquée en C-terminal au niveau du domaine PRD (Alix-∃PRD) formait des monomères et des dimères en solution, et que le domaine Alix-V était suffisant pour permettre cette dimérisation. La diffraction de rayons X aux petits angles (SAXS) a montré que Alix-∃PRD se structurait en une forme incurvée et allongée qui rappelle les domaines BAR impliqués dans les phénomènes d'incurvation de membrane. Bien que l'interaction d'Alix avec la membrane ait été mise en évidence in vitro, sa capacité à déformer la membrane doit encore être confirmée. En outre, nous avons déterminé lors d'expériences de microcalorimétrie que les formes monomériques et dimériques de Alix-V interagissent avec un peptide dérivé de la protéine p9 EIAV Gag avec une affinité de l'ordre du micromolaire. Des cristaux de la forme dimérique de Alix-V ont été obtenus. Ces cristaux présentaient un faible pouvoir de diffraction (10Å). En revanche, des cristaux diffractant à 3Å ont été obtenus à partir d'une forme mutante de Alix-V (Mut1) incapable de dimériser et qui se structure en une forme monomérique ouverte et allongée ; la résolution de cette structure est en cours. De plus, nous avons montré que l'absence de relarguage des particules virales (VLP) après surexpression de la forme humaine de Alix-∃Bro (résidus 358-868) pouvait être rétablie à partir de la version Mut1 de cette forme, ce qui suggère donc un rôle de cette dimérisation dans le relarguage des VLP. La protéine Alix-V dimérique a également été utilisée pour produire un antisérum Alix, qui a montré que la protéine endogène Alix pouvait être co-localiser avec les endosomes de recyclage. Enfin, nous avons montré que CHMP4B formant des structures polymériques en anneaux, pouvait interagir avec Alix. L'ensemble de ces résultats donne de nouvelles informations sur la flexibilité conformationnelle d'Alix et, associée avec CHMP4, sur son implication dans les processus de bourgeonnement membranaire. Ce travail définit également le cadre des futures analyses fonctionnelles visant à définir le rôle de la protéine dimérique Alix dans les cellules infectées par le virus HIV-1.

L’auto-incompatibilité est une barrière génétique qui permet à une plante de reconnaître et rejeter son propre pollen tout en acceptant le pollen d’individus moins apparentés d’un point de vue génétique. Chez les Brassicacées, l’auto-incompatibilité est contrôlée par un locus hautement polymorphe appelé le locus S, qui contient les déterminants mâle et femelle. Le stigmate exprime le déterminant femelle de l’auto-incompatibilité, S-LOCUS RECEPTOR KINASE (SRK). Chez Brassica oleracea, la localisation subcellulaire d’SRK est unique en son genre : le récepteur est localisé principalement au niveau des endosomes et dans une moindre mesure à la membrane plasmique.Nous avons étudié la fonction de la localisation endosomale de SRK chez Arabidopsis thaliana. Premièrement, nous avons réintroduit l’auto-incompatibilité chez Arabidopsis thaliana grâce à l’expression d’un allèle fonctionnel de SRK en provenance d’Arabidopsis lyrata (une espèce auto-incompatible). Deuxièmement, nous avons montré qu’un mutant perte de fonction de DYNAMIN-RELATED PROTEIN1A, une protéine requise pour l’endocytose, abolissait l’auto-incompatibilité. Nos résultats suggèrent que l’endocytose est requise pour l’auto-incompatibilité, et que SRK pourrait activer sa voie de signalisation depuis les endosomes. / Self-incompatibility is a genetic barrier by which a plant recognizes and rejects its own pollen while allowing pollen from more distantly related plants to germinate. In the Brassicacea family, it is controlled by a highly polymorphic locus called the S-locus, which contains the male and female determinants of self-incompatibility. The stigma expresses the female determinant of self-incompatibility, the plant receptor kinase (PRK) S-LOCUS RECEPTOR KINASE (SRK). In Brassica oleracea, SRK has a unique subcellular localization among PRK: the receptor is mostly localized in endosomes and to a lesser extent at the plasma membrane.We investigated the function of the endosomal localization of SRK in Arabidopsis thaliana. Firstly, we reintroduced self-incompatibility in Arabidopsis thaliana by expression of a functional SRK allele from Arabidopsis lyrata (a self-incompatible species). Secondly, we showed that a loss-of-function mutant of DYNAMIN-RELATED PROTEIN1A, a protein required for endocytosis, abolished self-incompatibility. Our results suggest that endocytosis is required for self-incompatibility, and that SRK may be signaling from endosomal compartments.

Une analyse protéomique de la fraction membranaire d'un échantillon foie de rat fortement enrichi en lysosomes a mené à la découverte de l'Onzin parmi les protéines les plus abondantes. Nous avons montré que cette petite protéine riche en cystéines et fortement conservée entre différentes espèces est majoritairement présente dans les organes lymphoïdes et dans le tube digestif. La distribution intracellulaire de l'Onzin dans le foie de souris a été étudiée par des techniques de centrifugation, notamment en induisant in vivo par différentes substances (invertase de levure, Triton WR-1339 et billes de latex) le changement de la densité des lysosomes et des phagosomes. Nous déduisons de ces expériences que l'Onzin est associée à un compartiment de la voie endocytaire en relation dynamique avec le lysosome des cellules de Kupffer. Ces résultats ont également été confirmés et précisés par des approches biochimiques et morphologiques en utilisant des macrophages péritonéaux de souris.

Le trypanosome sud américain, Trypanosoma cruzi, transmis par un insecte hématophage de type triatome est le protozoaire connus pour causer la maladie de Chagas chez l’Homme. Le cycle de vie de ce parasite alterne à la fois sur le type d’hôte, insecte ou hôte vertébré, et sur la forme :trypomastigote pour la forme quiescente et amastigote et épimastigote pour les formes prolifératives. Concernant la forme, seuls les parasites épimastigotes évoluent et prolifèrent dans le tube digestif des triatomes et possèdent un système endocytaire actif nécessaire à leur besoin énergétique. Toutefois, cette endocytose est restreinte à deux sites membranaires, la poche flagellaire et le cytostome, à partir desquels se créent des cargos endocytaires. Ces cargos endocytaires fusionnent ensuite avec un réseau vésiculaire endosomal qui délivre son contenu dans des réservosomes, compartiments similaires aux lysosomes.Chez le trypanosome africain (Trypanosoma brucei brucei), l’endocytose ne se réalise qu’au niveau de la poche flagellaire. Certaines protéines appartenant à cette voie endocytaire sont modifiées par de longues chaines de résidus poly-N-acétyllactosamine (pNAL) de manière post-traductionnelle. Initialement, il a été proposé que ces résidus puissent agir en tant que signal de tri dans le processus d’endocytose chez ces parasites.En nous basant sur les travaux qui ont été réalisés chez le trypanosome africain, nous nous sommes proposés d’approfondir les connaissances sur la voie endocytaire du trypanosome sud américain (Trypanosoma cruzi) qui est beaucoup moins étudié. Pour ce faire, à l’aide de deux lectines, la tomatolectine et la lectine de Griffonia simplicifolia qui présentent respectivement une affinité pour les résidus pNAL et les résidus N-acétylglucosamine (GlcNAc) en fin de chaine, nous avons pu enrichir et caractériser par LC-MS², 173 glycoprotéines putatives dont plus de 13% sont localisées dans la voie endocytaire. Parmi les protéines identifiées, en plus des nombreuses hydrolases lysosomiales, nous avons pu identifier une lectine de type C localisée dans la partie antérieure des parasites, au niveau des principaux sites endocytaires. Cette dernière possédant de nombreux résidus en commun avec les récepteurs de type scavengers, elle pourrait donc jouer un rôle important dans la fixation et l’endocytose de certains nutriments.Nos travaux ont ainsi permis d’établir que similairement aux trypanosomes africains, Trypanosoma cruzi possèdent des glycoprotéines modifiées par des N-glycanes contenant des pNAL. Nos travaux ont également permis d’établir que ces résidus s’associent préférentiellement aux glycoprotéines de la voie endocytaire (au niveau du cytostome et du réservosome) de la forme épimastigote. L’ensemble des résultats obtenus durant cette thèse tendent à montrer que les résidus pNAL des glycoprotéines présentes dans la voie endocytaire ont été conservées entre les deux parasites étudiés (Trypanosoma cruzi et Trypanosoma brucei brucei). / Doctorat en Sciences / info:eu-repo/semantics/nonPublished

Ce travail de thèse a été consacré à l'étude de la protéine AdcA de Dictyostelium discoideum. Cette protéine a été identifiée sur la base de la présence d'un domaine arrestine. Ce coeur arrestine est jouxté par plusieurs domaines dont un motif FYVE et un motif répété trois fois contenant des clusters d'histidines. L'étude de la localisation subcellulaire de AdcA endogène ou de formes étiquetées couplée à l'utilisation de marqueurs de différents compartiments de la voie endocytaire ont permis de mettre en évidence un enrichissement majeur de AdcA au niveau des endosomes précoces. L'étude des différents domaines d'AdcA a mis en lumière le rôle du domaine FYVE dans sa localisation endocytaire et l'implication du domaine N-terminal riche en histidines dans son oligomérisation métal-dépendante. Mes travaux utilisant le mutant adcA nul indique que AdcA pourrait jouer un rôle au niveau d'une voie de recyclage entre les endosomes précoces et la membrane plasmique. Nous avons également pu montrer par des expériences de double hybride et de pull-down que AdcA est capable d'interagir avec la petite protéine G ArfA. Ceci est en accord avec un rôle de AdcA au niveau du recyclage où elle pourrait permettre en association avec ArfA un tri de protéines membranaires dans des vésicules de recyclage.