Ingeniero Civil en Biotecnología / El presente trabajo tuvo por objetivo estudiar la validez de los criterios de selección que se han establecido para la adición de extremos hidrofóbicos a proteínas para mejorar su purificación mediante Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC). Para esto se utilizó una enzima celulasa Cel5A de Bacillus Agaradherans y tres combinaciones de aminoácidos prolina (P), tirosina (Y) y triptófano (W): YYY (Y3), WPWP (WP2) y WPWPWPWP (WP4). Las secuencias fueron añadidas en el extremo carboxilo terminar de la enzima nativa mediante la técnica de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). Se obtuvieron de forma exitosa las variantes recombinantes Celulasa-Y3, Celulasa-WP2 y Celulasa-WP4. Las variantes obtenidas fueron cultivadas e inducidas bajo las mismas condiciones preestablecidas, extrayéndose las fracciones extracelular y periplasmática a las cuales se les realizaron ensayos de actividad celulolítica y proteína total, para posteriormente calcular su actividad específica. La proteína total producida por las variantes mutantes fue similar a la obtenida por la cepa nativa, obteniéndose un nivel de proteína total con respecto a la cepa nativa de un 98% para la variante Cel-Y3, 88% para la variante Cel-WP2 y de un 75% para la variante Cel-WP4. En todos los casos se obtuvo una mayor parte de la proteína en la fracción extracelular con valores superiores al 56% del total de proteína producida. La variante Cel-WP2, mantuvo un 97% de la actividad celulolítica total de la enzima nativa, a diferencia de las variantes Cel-Y3 y Cel-WP4 que mantuvieron sólo un 18 y 14% respectivamente. Sin embargo, se obtuvo que todas las variantes presentaron una distribución similar de la actividad entre las distintas fracciones con aproximadamente un 87% de la actividad en la fracción extracelular, un 5% en la fracción de lavado con TES y un 8% en la fracción periplasmática. Fue posible evaluar la validez del criterio señala que: es recomendable la incorporación de prolina en los extremos a fin de evitar la formación de estructuras secundarias y asegurar la exposición del extremo , así como también de que: el valor de la hidrofobicidad del extremo debe ser menor a 500 para mantener la actividad de la enzima . Por el contrario se descartó el criterio de que: no es necesaria la presencia de prolina para mantener la actividad en enzima extracelulares , debido a que sólo la variante con prolina mantuvo una actividad específica alta. Por otra parte, se realizaron HIC para todas las variantes, pero no fue posible la determinación de los valores del tiempo de retención, debido que la enzima precipitaba al introducirla en un medio con alta concentración de sulfato de amonio, lo cual imposibilitaba la realización de ensayos de actividad en las fracciones, por lo cual se recomienda evaluar otras condiciones de operación para determinar estos tiempos de retención.

Magíster en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Ingeniera Civil en Biotecnología / Existe una preocupación mundial por la disponibilidad de los combustibles fósiles para suplir la demanda de energía en el mundo, que aumenta año a año, y los problemas ambientales que su uso genera. Así, el bioetanol lignocelulósico ha surgido como una adecuada alternativa para reemplazar parcialmente la gasolina, pero todavía su costo no es competitivo con el petróleo o gasolina. El proceso de producción de bioetanol consta de tres etapas principales: pretratamiento, hidrólisis y fermentación. Específicamente, la hidrólisis es catalizada por celulasas y es una de las etapas con grandes proyecciones a disminuir su costo, por lo que este trabajo se enfoca en esta etapa, principalmente en el desarrollo de nuevas celulasas, que puedan aportar al desarrollo actual y a lograr reducir el costo de producción del bioetanol. El objetivo de este trabajo fue aislar y caracterizar el gen que codifica para una endoglucanasa del hongo Trametes versicolor y expresar la enzima en el sistema de expresión de Pichia pastoris. A partir de dos fragmentos de la secuencia del gen, se obtuvo una secuencia con el dominio catalítico completo, llamada tveg. La secuencia se clonó en el vector pPICZαA y se transformó células de la cepa GS115 de P. patoris para expresar la proteína en forma extracelular. Luego se realizó una curva de inducción y se estudió la expresión de la enzima en la fracción extracelular e intracelular. El análisis de la expresión se realizó mediante ensayos de actividad sobre carboximetilcelulosa (CMC) en medio sólido y en medio líquido, zimogramas y geles SDS-PAGE. El análisis de tveg mediante BLASTX mostró, con un 90% de identidad, que corresponde a la secuencia de una endoglucanasa del hongo T. versicolor, perteneciente a la familia 5 de las glicosil hidrolasas. Los ensayos en medio sólido revelaron actividad enzimática en la cepa recombinante GS115, indicando que la expresión fue exitosa. Por otra parte, los ensayos en medio líquido de la cepa GS115-TvEG permitieron cuantificar la actividad de la endoglucanasa TvEG recombinante, produciendo 8,3 U/l de cultivo a las 84 horas de inducción con metanol, de las cuales un 50% se encontraba en la fracción extracelular y un 50% en la fracción citoplasmática. Los zimogramas corroboraron los resultados de los ensayos en medio líquido y en los geles SDS-PAGE se vio una proteína con un peso molecular aparente de 90 kDa, mucho mayor a los 30 kDa estimados para TvEG, posiblemente por hiperglicosilación y/o problemas de corte de la señal de secreción. Por otro lado, se estudió la producción de celulasas nativas del hongo T. veriscolor en Avicel, CMC y astillas de Lenga como fuente de carbono. Con CMC se logró mayor producción de actividad celulolítica, llegando a un máximo de 225 U/l a los 6 días de cultivo. La gran diferencia entre el sistema nativo y el sistema recombinante, y la comparación con otros estudios, indican que la expresión de TvEG debe y puede ser mejorada.

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