O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis e questões ambientais têm gerado grandes preocupações para a sociedade, e alternativas sustentáveis e eficientes para solucionar e trazer inovações na produção de biocombustíveis estão cada vez mais próximas. O uso de biomassa pode ser uma vantajosa opção, mas para isso, é necessária a degradação das moléculas constituintes de sua parede celular a açúcares fermentáveis. A biotecnologia tem melhorado e aumentado as opções para suprir fontes sustentáveis e preservação do meio ambiente. A transformação de biomassa na escala industrial para produção de bioetanol depende da capacidade de otimizar o processo de hidrólise enzimática da celulose utilizando enzimas de complexo celulolítico, principalmente de fontes bacterianas e fungos filamentosos. Dessa forma, estudamos a principal endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913, que foi inicialmente identificada através de zimogramas e espectrometria de massas que mostrou boa cobertura de sequência e purificada utilizando passos de precipitação com sulfato de amônio seguida do uso de uma coluna de exclusão molecular. Esta enzima teve seus parâmetros cinéticos determinados, mostrando-se ativa para diversos substratos testados e também grande estabilidade para variações de pH e temperatura, com condições ótimas de pHótimo = 7.0 e Tótima = 45°C. Além da caracterização enzimática, a posição relativa entre o domínio catalítico e de ligação da celulose (CBM) da Endoglucanase por SAXS também foram determinadas, e ainda, para finalizar os estudos estruturais, a estrutura cristalográfica do domínio catalítico da enzima foi determinada com resolução de 2.8Å, contendo quatro moléculas por unidade assimétrica. / The exhaustion of fossil fuels and the environment issues related have been generated many concerns for the society and searching for sustainable and effective alternative are being done in order to solve and bring innovations for biofuel production. Biomass can be a good alternative, but, for the success, it will be necessary degrading the cellular wall molecules into fermentable sugar. Biotechnology has improved and increased options in order to supply sustainable sources and environment preservation. The biomass transformation for bioethanol production, at the industrial scale, depends on the capacity of optimize the enzymatic hydrolysis of cellulose using enzymes of the cellulolytic complex, mainly produced by bacteria and filamentous fungi. We have studied the main endoglucanase of Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913 which has been initially identified by zymograms and mass spectrometry with high coverage sequence, and purified using precipitation with ammonium sulfate followed by size exclusion column. This enzyme had its kinetic parameters determined showing activity for the substrates tested and also has showed stability for pH and temperature changes, with optimal conditions of pHopt = 7.0 and Topt = 45°C. Following this enzymatic characterization, the relative position of the catalytic domain and cellulose binding domain (CBM) was determined by SAXS. In order to complete the structural studies, the crystallographic structure of the catalytic domain has been determined with 2.8Å of resolution, showing four molecules by asymmetric unity.

O esgotamento das fontes de combustíveis fósseis e questões ambientais têm gerado grandes preocupações para a sociedade, e alternativas sustentáveis e eficientes para solucionar e trazer inovações na produção de biocombustíveis estão cada vez mais próximas. O uso de biomassa pode ser uma vantajosa opção, mas para isso, é necessária a degradação das moléculas constituintes de sua parede celular a açúcares fermentáveis. A biotecnologia tem melhorado e aumentado as opções para suprir fontes sustentáveis e preservação do meio ambiente. A transformação de biomassa na escala industrial para produção de bioetanol depende da capacidade de otimizar o processo de hidrólise enzimática da celulose utilizando enzimas de complexo celulolítico, principalmente de fontes bacterianas e fungos filamentosos. Dessa forma, estudamos a principal endoglucanase de Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913, que foi inicialmente identificada através de zimogramas e espectrometria de massas que mostrou boa cobertura de sequência e purificada utilizando passos de precipitação com sulfato de amônio seguida do uso de uma coluna de exclusão molecular. Esta enzima teve seus parâmetros cinéticos determinados, mostrando-se ativa para diversos substratos testados e também grande estabilidade para variações de pH e temperatura, com condições ótimas de pHótimo = 7.0 e Tótima = 45°C. Além da caracterização enzimática, a posição relativa entre o domínio catalítico e de ligação da celulose (CBM) da Endoglucanase por SAXS também foram determinadas, e ainda, para finalizar os estudos estruturais, a estrutura cristalográfica do domínio catalítico da enzima foi determinada com resolução de 2.8Å, contendo quatro moléculas por unidade assimétrica. / The exhaustion of fossil fuels and the environment issues related have been generated many concerns for the society and searching for sustainable and effective alternative are being done in order to solve and bring innovations for biofuel production. Biomass can be a good alternative, but, for the success, it will be necessary degrading the cellular wall molecules into fermentable sugar. Biotechnology has improved and increased options in order to supply sustainable sources and environment preservation. The biomass transformation for bioethanol production, at the industrial scale, depends on the capacity of optimize the enzymatic hydrolysis of cellulose using enzymes of the cellulolytic complex, mainly produced by bacteria and filamentous fungi. We have studied the main endoglucanase of Xanthomonas campestris pv. Campestris ATCC33913 which has been initially identified by zymograms and mass spectrometry with high coverage sequence, and purified using precipitation with ammonium sulfate followed by size exclusion column. This enzyme had its kinetic parameters determined showing activity for the substrates tested and also has showed stability for pH and temperature changes, with optimal conditions of pHopt = 7.0 and Topt = 45°C. Following this enzymatic characterization, the relative position of the catalytic domain and cellulose binding domain (CBM) was determined by SAXS. In order to complete the structural studies, the crystallographic structure of the catalytic domain has been determined with 2.8Å of resolution, showing four molecules by asymmetric unity.

Submitted by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-02-06T18:33:03Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Rafael Lopes e Oliveira.pdf: 2557570 bytes, checksum: c68440fa2bd9d19a9e6c4576c387ef4b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-02-06T18:33:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Rafael Lopes e Oliveira.pdf: 2557570 bytes, checksum: c68440fa2bd9d19a9e6c4576c387ef4b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-02-06T18:33:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_Rafael Lopes e Oliveira.pdf: 2557570 bytes, checksum: c68440fa2bd9d19a9e6c4576c387ef4b (MD5) Previous issue date: 2015-10-22 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Cellulases are hydrolases, with great interest in industrial, notable for its power in the production of ethanol by hydrolysis of cellulolytic materials. The actinobacteria are producing this enzyme, especially of the genus Streptomyces. This study aimed to produce and characterize a portion of a cellulolytic complex excreted by actinobacteria belonging to the microorganisms Collection of UFPEDA. In the selection of microorganisms producers of cellulolytic complex in qualitative testing microorganisms 171x and 178 showed the most significant enzymatic Index. As for the complex production time, fermentation was studied by 7 days with aliquots being taken every 24h. There was thus obtained peak production at 48 the fermentation was also noted that the micro-organism 171x enzyme produced in greater quantities. The experiment followed with only the more significant production actinobacteria (171x), was tested for optimum substrate concentration (carboximeticelulose), growing temperature and an initial pH of production. The results demonstrate greater production of the cellulolytic complex with a substrate concentration of 3%, fermentation temperature 45 ° C and initial pH 4.0. About the partial characterization of the complex maybe that this behaved very satisfactorily, as proved to be very stable during the test. Furthermore, it has proven activity of the complex by zymography method and its probable molecular weight, the cellulolytic complex studied have Michaeliano behavior, the enzymatic hydrolysis product suggests that the enzyme complex is composed of endoglucanases and experiment suggests that the complex should be produced at 40ºC, pH 4 and 2.5 g / L of CMC. The micro-organism was identified at genus level by the microculture and kind method, molecular identification, being identified as Streptomyces capoamus. Data from this study showed the importance of isolated actinobacteria biotechnology of the savanna soil. This complex has potential for use in the treatment and environmental cleaning products industries because it has high stability in adverse conditions / Celulases são hidrolases, com grande interesse industrial, destacando-se pelo seu poder na produção de etanol, através de hidrólise de materiais celulolíticos. As actinobactérias são produtoras desta enzimas, em especial do gênero Streptomyces. Este trabalho teve como objetivo produzir e caracterizar parcialmente um complexo celulolítico excretado por actinobactérias pertencentes ao acervo da Coleção de micro-organismos UFPEDA. Na seleção dos micro-organismos produtores do complexo celulolítico em ensaios qualitativos os micro-organismos 171x e 178 mostraram o Índice enzimático mais expressivo. Quanto ao tempo de produção do complexo, a fermentação foi estudada por 7 dias, com alíquotas sendo retiradas a cada 24h. Obteve-se assim o pico de produção com 48h de fermentação. Notou-se também que o micro-organismo 171x produziu a enzima em maior quantidade (0,139 U/mL). Os experimentos seguiram com apenas a actinobacteria com produção mais expressiva (171x), sendo testado a concentração ideal de substrato (carboximeticelulose), temperatura de cultivo e pH inicial de produção. Os resultados demonstraram uma maior produção do complexo celulolítico com substrato em concentração de 3%, temperatura de fermentação 45ºC e pH inicial 4,0. Quanto a caractericação parcial do complexo pode-se observar que este se comportou de forma muito satisfatória, pois demonstrou-se bastante estável durante os testes. Além disso, foi comprovada a atividade do complexo pelo método do zimograma e determinou-se sua provável massa molecular (80kDa), e que o complexo celulolítico estudado tem comportamento Michaeliano. O produto de hidrólise enzimática sugere que o complexo enzimático seja composto por endoglucanases. O delineamento experimental confirma que os dados obtido quando analisados os fatores isolados estão próximos ao ótimo. O micro-organismo foi identificado em nível de gênero através do método de microcultivo e de espécie, identificação molecular, sendo identificado como Streptomyces capoamus. Os dados obtidos neste estudo mostram a importância biotecnológica das actinobacterias isoladas de solo da caatinga. Este complexo celulolítico tem potencial para utilização em indústrias por possuir alta estabilidade em condições adversas

Orientador: Munir Salomão Skaf / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química / Made available in DSpace on 2018-08-23T08:18:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Prates_EricaTeixeira_D.pdf: 8470737 bytes, checksum: 319e6432b49bf0c2fb876c71f9e7fd49 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: A biomassa lignocelulósica proveniente do bagaço de cana-de-açúcar e de outras matérias-primas é um material altamente promissor para a geração de biocombustíveis renováveis e ambientalmente positivos. A melhor opção para a conversão dessa biomassa em açúcares solúveis fermentáveis a etanol, em termos de rendimento e de vantagens ambientais, é a catálise enzimática. Mas esta é também a etapa mais cara do processo de obtenção de etanol de segunda geração devido à baixa eficiência e alto custo dos coquetéis enzimáticos atualmente disponíveis para este fim. Para tornar estes processos mais eficientes e economicamente viáveis, é preciso aprofundar nossa compreensão dos mecanismos de hidrólise celulolítica. Grande investimento em pesquisa tem sido empregado com esta finalidade e, como parte disto, este trabalho consiste em um conjunto de pesquisas desenvolvidas na área de simulação computacional via dinâmica molecular de três enzimas celulolíticas: 1) Laminarinase de Rodhothermus marinus; 2) Endoglucanase 3 de Trichoderma harzianum e 3) b- glicosidase de Aspergillus niger. De modo geral, estes estudos visaram investigar a relação entre o arranjo estrutural e propriedades mensuráveis em laboratório interessantes na avaliação da performance destes biocatalisadores, como afinidade pelo substrato e estabilidade térmica. Como parte do Projeto Temático BioEn, financiado pela FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), estes estudos computacionais foram realizados em estreita colaboração com grupos de biofísicos estruturais e biólogos moleculares, sendo a escolha dos três temas embasada em resultados experimentais / Abstract: The lignocellulosic biomass from sugar cane bagasse and from other raw materials is a highly promising material for the generation of renewable and environmentally positive fuels. In terms of performance and environmental advantages, the best option for converting this biomass into soluble sugars to produce ethanol is the enzymatic catalysis. However, this is also the most expensive step of the second-generation ethanol production due to the low efficiency and high cost of the currently available enzyme cocktails. In order to make the process more efficient and economically viable, it is necessary to deepen the understanding of the cellulolytic hydrolysis mechanisms. Great investment in research has been employed for this purpose, and as part of these efforts, this work consists on a set of molecular dynamics studies of three cellulolytic enzymes, namely: 1) laminarinase from Rodhothermus marinus; 2) Endoglucanase 3 from Trichoderma harzianum and 3) b-glucosidase from Aspergillus niger. In general, these studies aimed to investigate the relationship between the structural arrangement and experimental data that are interesting for the biocatalyst performance evaluation, such as affinity to the substrate and thermal stability. As part of the BioEn Thematic Project, funded by FAPESP (Research Foundation of the State of São Paulo), these computational studies were carried out in close collaboration with structural biophysicists and molecular biologists. The choice of the three proteins considered here was based on these experimental studies / Doutorado / Físico-Química / Doutora em Ciências

In this thesis, enzymes acting on the primary cell wall hemicellulose xyloglucan are studied.  Xyloglucans are ubiquitous in land plants which make them an important polysaccharide to utilise for microbes and a potentially interesting raw material for various industries.  The function of xyloglucans in plants is mainly to improve primary cell wall characteristics by coating and tethering cellulose microfibrils together.  Some plants also utilise xyloglucans as storage polysaccharides in their seeds. In microbes, a variety of different enzymes for degrading xyloglucans have been found.  In this thesis, the structure-function relationship of three different microbial endo-xyloglucanases from glycoside hydrolase families 5, 12 and 44 are probed and reveal details of the natural diversity found in xyloglucanases.  Hopefully, a better understanding of how xyloglucanases recognise and degrade their substrate can lead to improved saccharification processes of plant matter, finding uses in for example biofuel production. In plants, xyloglucans are modified in muro by the xyloglucan transglycosylase/hydrolase (XTH) gene products.  Interestingly, closely related XTH gene products catalyse either transglycosylation (XET activity) or hydrolysis (XEH activity) with dramatically different effects on xyloglucan and on cell wall characteristics.  The strict transglycosylases transfer xyloglucan segments between individual xyloglucan molecules while the hydrolases degrade xyloglucan into oligosaccharides.  Here, we describe and determine, a major determinant of transglycosylation versus hydrolysis in XTH gene products by solving and comparing the first 3D structure of an XEH, Tm-NXG1 and a XET, PttXET16-34.  The XEH activity was hypothesised, and later confirmed to be restricted to subset of the XTH gene products.  The in situ localisation of XEH activity in roots and hypocotyls of Arabidopsis was also visualised for the first time.  Furthermore, an evolutionary scheme for how XTH gene products developed from bacterial beta-1,3;1,4 glucanases was also presented based on the characterisation of a novel plant endo-glucanase, PtEG16-1. The EG16s are proposed to predate XTH gene products and are with activity on both xyloglucan and beta-1,3;1,4 glucans an “intermediate” in the evolution from beta-1,3;1,4 glucanases to XTH gene products. / QC 20110401

Os fungos de decomposição parda são eficientes na degradação dos polissacarídeos da madeira, pois, além das enzimas hidrolíticas, podem gerar, via reação de Fenton, radicais hidroxila que são responsáveis pela rápida despolimerização dos polissacarídeos da parede celular sem a remoção prévia da lignina. O presente trabalho analisou se enzimas hidrolíticas do fungo de decomposição parda Gloeophyllum trabeum e as endoglucanases comerciais do ascomiceto Talaromyces emersonii apresentam efeito sinérgico com celulases comerciais durante a hidrólise enzimática de substratos com teor elevado de lignina. Os substratos em questão corresponderam a bagaço de cana pré-tratado por um processo quimiomecânico que emprega sulfito alcalino. Dois níveis de tratamento foram obtidos a partir de cargas diferenciadas de sulfito de alcalino. A carga mais elevada foi de 10 g de Na2SO3 e 5 g de NaOH para cada 100g de bagaço e gerou um substrato de baixa recalcitrância. O emprego de uma carga de sulfito alcalino diminuída à metade da carga anterior gerou um substrato de elevada recalcitrância. Para viabilizar a execução dos experimentos utilizando pequenas quantidades de enzima, foi desenvolvido um método de hidrólise em pequena escala empregando bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino como substrato. O método em questão empregou 20 mg de substrato e 1 mL de volume final de reação gerando dados com boa reprodutibilidade e níveis de conversão de celulose e xilana similares aos observados em ensaios tradicionais que empregam 1 g de substrato e 50 mL de meio reacional. O fungo G. trabeum foi cultivado com 7 diferentes fontes de carbono, sendo detectada a atividade de endoglucanase em todos os meios e alcançando níveis mais elevados nos cultivos com carboximetilcelulose, que foi, portanto, utilizado para produção das enzimas de G. trabeum. Um extrato de cultivo de G. trabeum foi parcialmente purificado, gerando um extrato com 2,16 UI de endoglucanases/mL e um teor de proteínas de 1,34 mg/mL. O uso das enzimas de G. trabeum e de T. emersonii em misturas com a Celluclast foi baseado nas cargas de endoglucanases totais, visto que a atividade em papel de filtro não foi detectável nos dois complexos enzimáticos. Para as reações de hidrólise do substrato que apresentava baixa recalcitrância, as conversões máximas de celulose e xilana foram da ordem de 80% após 72h de reação com cargas de endoglucanases de Celluclast de 120 UI/g de substrato. A mistura de enzimas que empregaram metade desta carga de endoglucanase advinda de Celluclast e outra metade de extratos de G. trabeum proporcionaram eficiências de hidrólise similares às obtidas com a mesma carga advinda somente de Celluclast. No caso da suplementação das misturas com endoglucanases de T. emersonii, as eficiências de hidrólise foram menores do que aquelas obtidas somente com Celluclast. As reações de hidrólise do substrato de elevada recalcitrância proporcionaram conversões de celulose e xilana máximas da ordem de 50% quando se empregou Celluclast como fonte de enzimas. A suplementação de parte das endoglucanases desta preparação por endoglucanases provenientes do extrato de G. trabeum ou de T. emersonii não favoreceram a hidrólise dos polissacarídeos presentes no substrato. / Brown-rot fungi can degrade wood polysaccharides in an efficient manner because they produce hydrolytic enzymes and also hydroxyl radicals via Fenton reaction. These systems are responsible for a rapid polysaccharide depolymerization without previous lignin removal from the wood cell walls. The present work evaluated the hydrolytic enzymes produced by the brown-rot fungus Gloeophyllum trabeum and by the ascomycete Talaromyces emersonii in mixtures with commercial cellulases to hydrolyze lignin-rich substrates. The evaluated substrates were sugar cane bagasse pretreated in a chemithermomechanical process that used alkaline sulfite in the reaction media. Two levels of pretreatment were employed by using varied loads of chemicals during the cooking step. A low recalcitrance material was prepared by pretreating the sugar cane bagasse with 10 g of Na2SO3 and 5 g of NaOH per 100g of sugar cane bagasse. Using the half of this chemical loading resulted in a second substrate that was more recalcitrant. A small scale enzymatic hydrolysis procedure was set to permit the use of low enzymes dosage in the polysaccharide hydrolyses studies. This procedure used only 20 mg of lignocellulosic substrate in 1 mL of final reaction volume. Data obtained for cellulose and xylan conversion presented good reproducibility and average conversion values very similar to that obtained in traditional experiments that use 1 g of substrate in 50 mL of reaction medium. G. trabeum was cultured in 7 different carbon sources and endoglucanase activities were detected in all cases. The highest endoglucanases levels were obtained in cultures with carboxymethylcellulose as carbon source. One culture extract from this fungus was partially purified yielding a purified extract with 2.16 IU of endoglucanases/mL and a protein content of 1.34 mg/mL. The use of the enzymes from G. trabeum and T. emersonii extracts in mixtures with commercial Celluclast was based on the total loads of endoglucanases, since filter paper activities were not detectable in the extracts obtained from the studied fungi. Cellulose and xylan from the low recalcitrance substrate were converted at yields of 80% after 72 h of hydrolysis by Celluclast loaded at 120 UI of endoglucanases/g de substrate. Using enzyme mixtures with the same endoglucanase dosage but divided in 50% from Celluclast and 50% from G. trabeum extract yielded almost the same hydrolysis efficiency. In the case of the enzyme mixtures in which the extract from T. emersonii was used instead the extract from G. trabeum the hydrolysis efficiency was lower than that obtained by the treatment with Celluclast only. Cellulose and xylan from the low recalcitrance substrate were converted at yields of 50% after 72 h of hydrolysis by Celluclast. The replacement of this endoglucanase load with endoglucanases from G. trabeum or T. emersonii extracts resulted in lower hydrolysis efficiency.

Os fungos de decomposição parda são eficientes na degradação dos polissacarídeos da madeira, pois, além das enzimas hidrolíticas, podem gerar, via reação de Fenton, radicais hidroxila que são responsáveis pela rápida despolimerização dos polissacarídeos da parede celular sem a remoção prévia da lignina. O presente trabalho analisou se enzimas hidrolíticas do fungo de decomposição parda Gloeophyllum trabeum e as endoglucanases comerciais do ascomiceto Talaromyces emersonii apresentam efeito sinérgico com celulases comerciais durante a hidrólise enzimática de substratos com teor elevado de lignina. Os substratos em questão corresponderam a bagaço de cana pré-tratado por um processo quimiomecânico que emprega sulfito alcalino. Dois níveis de tratamento foram obtidos a partir de cargas diferenciadas de sulfito de alcalino. A carga mais elevada foi de 10 g de Na2SO3 e 5 g de NaOH para cada 100g de bagaço e gerou um substrato de baixa recalcitrância. O emprego de uma carga de sulfito alcalino diminuída à metade da carga anterior gerou um substrato de elevada recalcitrância. Para viabilizar a execução dos experimentos utilizando pequenas quantidades de enzima, foi desenvolvido um método de hidrólise em pequena escala empregando bagaço de cana pré-tratado com sulfito alcalino como substrato. O método em questão empregou 20 mg de substrato e 1 mL de volume final de reação gerando dados com boa reprodutibilidade e níveis de conversão de celulose e xilana similares aos observados em ensaios tradicionais que empregam 1 g de substrato e 50 mL de meio reacional. O fungo G. trabeum foi cultivado com 7 diferentes fontes de carbono, sendo detectada a atividade de endoglucanase em todos os meios e alcançando níveis mais elevados nos cultivos com carboximetilcelulose, que foi, portanto, utilizado para produção das enzimas de G. trabeum. Um extrato de cultivo de G. trabeum foi parcialmente purificado, gerando um extrato com 2,16 UI de endoglucanases/mL e um teor de proteínas de 1,34 mg/mL. O uso das enzimas de G. trabeum e de T. emersonii em misturas com a Celluclast foi baseado nas cargas de endoglucanases totais, visto que a atividade em papel de filtro não foi detectável nos dois complexos enzimáticos. Para as reações de hidrólise do substrato que apresentava baixa recalcitrância, as conversões máximas de celulose e xilana foram da ordem de 80% após 72h de reação com cargas de endoglucanases de Celluclast de 120 UI/g de substrato. A mistura de enzimas que empregaram metade desta carga de endoglucanase advinda de Celluclast e outra metade de extratos de G. trabeum proporcionaram eficiências de hidrólise similares às obtidas com a mesma carga advinda somente de Celluclast. No caso da suplementação das misturas com endoglucanases de T. emersonii, as eficiências de hidrólise foram menores do que aquelas obtidas somente com Celluclast. As reações de hidrólise do substrato de elevada recalcitrância proporcionaram conversões de celulose e xilana máximas da ordem de 50% quando se empregou Celluclast como fonte de enzimas. A suplementação de parte das endoglucanases desta preparação por endoglucanases provenientes do extrato de G. trabeum ou de T. emersonii não favoreceram a hidrólise dos polissacarídeos presentes no substrato. / Brown-rot fungi can degrade wood polysaccharides in an efficient manner because they produce hydrolytic enzymes and also hydroxyl radicals via Fenton reaction. These systems are responsible for a rapid polysaccharide depolymerization without previous lignin removal from the wood cell walls. The present work evaluated the hydrolytic enzymes produced by the brown-rot fungus Gloeophyllum trabeum and by the ascomycete Talaromyces emersonii in mixtures with commercial cellulases to hydrolyze lignin-rich substrates. The evaluated substrates were sugar cane bagasse pretreated in a chemithermomechanical process that used alkaline sulfite in the reaction media. Two levels of pretreatment were employed by using varied loads of chemicals during the cooking step. A low recalcitrance material was prepared by pretreating the sugar cane bagasse with 10 g of Na2SO3 and 5 g of NaOH per 100g of sugar cane bagasse. Using the half of this chemical loading resulted in a second substrate that was more recalcitrant. A small scale enzymatic hydrolysis procedure was set to permit the use of low enzymes dosage in the polysaccharide hydrolyses studies. This procedure used only 20 mg of lignocellulosic substrate in 1 mL of final reaction volume. Data obtained for cellulose and xylan conversion presented good reproducibility and average conversion values very similar to that obtained in traditional experiments that use 1 g of substrate in 50 mL of reaction medium. G. trabeum was cultured in 7 different carbon sources and endoglucanase activities were detected in all cases. The highest endoglucanases levels were obtained in cultures with carboxymethylcellulose as carbon source. One culture extract from this fungus was partially purified yielding a purified extract with 2.16 IU of endoglucanases/mL and a protein content of 1.34 mg/mL. The use of the enzymes from G. trabeum and T. emersonii extracts in mixtures with commercial Celluclast was based on the total loads of endoglucanases, since filter paper activities were not detectable in the extracts obtained from the studied fungi. Cellulose and xylan from the low recalcitrance substrate were converted at yields of 80% after 72 h of hydrolysis by Celluclast loaded at 120 UI of endoglucanases/g de substrate. Using enzyme mixtures with the same endoglucanase dosage but divided in 50% from Celluclast and 50% from G. trabeum extract yielded almost the same hydrolysis efficiency. In the case of the enzyme mixtures in which the extract from T. emersonii was used instead the extract from G. trabeum the hydrolysis efficiency was lower than that obtained by the treatment with Celluclast only. Cellulose and xylan from the low recalcitrance substrate were converted at yields of 50% after 72 h of hydrolysis by Celluclast. The replacement of this endoglucanase load with endoglucanases from G. trabeum or T. emersonii extracts resulted in lower hydrolysis efficiency.

Submitted by Automa??o e Estat?stica (sst@bczm.ufrn.br) on 2017-02-21T00:14:47Z No. of bitstreams: 1 YagoQueirozDosSantos_DISSERT.pdf: 1419350 bytes, checksum: 3ae7b369d8ed52af2d85454e8aa5fdbb (MD5) / Approved for entry into archive by Arlan Eloi Leite Silva (eloihistoriador@yahoo.com.br) on 2017-03-03T21:49:39Z (GMT) No. of bitstreams: 1 YagoQueirozDosSantos_DISSERT.pdf: 1419350 bytes, checksum: 3ae7b369d8ed52af2d85454e8aa5fdbb (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-03T21:49:40Z (GMT). No. of bitstreams: 1 YagoQueirozDosSantos_DISSERT.pdf: 1419350 bytes, checksum: 3ae7b369d8ed52af2d85454e8aa5fdbb (MD5) Previous issue date: 2016-06-16 / A atual demanda por fontes de energia renov?veis tem impulsionado a busca de alternativas capazes de substituir o uso de combust?veis f?sseis. Uma das inova??es mais promissoras para impactar positivamente o cen?rio mundial de energia ? a produ??o de bioetanol de segunda gera??o (B2G), derivado de monossacar?deos obtidos a partir da degrada??o enzim?tica de material lignocelul?sico que normalmente ? descartado nos atuais processos agroindustriais. No presente trabalho, uma celulase halotolerante secretada por uma linhagem marinha Bacillus sp. SR22 com grande resist?ncia ?s mudan?as de temperatura e pH foi isolada e caracterizada. A endoglucanase de massa aproximada de 37.35 kDa nomeada como Bc22Cel foi purificada por precipita??o de sulfato de am?nio, cromatografia de gel filtra??o e extra??o do gel ap?s eletroforese em gel de poliacrilamida em condi??es nativas. O valor ideal de pH e temperatura de Bc22Cel foram 6,5 e 60 ? C, respectivamente. A enzima purificada demonstrou consider?vel propriedade halof?lica ao manter mais de 70% de atividade residual mesmo quando pr?-incubadas com 1,5 M de NaCl durante 1 hora. Ap?s a an?lise cin?tica de enzima purificada os valores de Km e Vmax foram estabelecidos em 0,3953 nmol.ml-1 e 0,0167 ?mol.ml-1.min-1, respectivamente. Avaliados conjuntamente, os presentes dados apontam a Bc22Cel como uma candidata potencial para aplica??es industriais de degrada??o de celulose. / The current demand for environment-friendly renewable energy sources has driven the search for alternatives capable of replacing the use of fossil fuels. One of the most promising innovations to positively impact the world energy scenario is the second-generation bioethanol production (B2G) from reducing sugars derived from enzymatic degradation of lignocellulosic material that is ordinarily discarded at agroindustrial processes. In this work, a salt-tolerant cellulase secreted by a marine Bacillus sp. SR22 strain with wide resistance to temperature and pH was isolated and characterized. The 37.35 kDa endoglucanase named as Bc22Cel was purified by ammonium sulphate precipitation, gel filtration chromatography and extraction from the gel after non-reducing sodium dodecylsufate-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimal pH value and temperature of Bc22Cel were 6.5 and 60 ?C, respectively. The purified Bc22Cel showed a considerable halophilic property being able to maintain more than 70% of residual activity even when pre-incubated with 1.5 M NaCl for 1 hour. Kinetic analysis of purified enzyme showed the Km and Vmax to be 0,3953 nmol ml-1 and 0,0167 ?mol ml-1 min-1, respectively. Taking together, the present data indicates the Bc22Cel as a potential and useful candidate for industrial applications.