L'entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie inflammatoire affectant le tractus gastro-intestinal de 5 à 10 % des enfants prématurés ayant un poids inférieur à 1500 g à la naissance. Elle se traduit principalement par la perte de tissu de la muqueuse intestinale, ce qui permet l'invasion bactérienne, menant ultimement à une nécrose de l'intestin. Parmi les options pouvant être envisagées pour prévenir la NEC, le lait maternel constitue l'approche la plus efficace. En effet, ce dernier fournit aux nouveau-nés des nutriments essentiels, mais également des substances bioactives pouvant être à l'origine de sa capacité à prévenir l'inflammation, une des caractéristiques principales de l'entérocolite nécrosante. Toutefois, il n'existe pas de test ou de marqueur permettant de prédire le potentiel anti-inflammatoire des dons de lait maternel. Un test fonctionnel in vitro utilisant des cellules épithéliales intestinales a été développé et il a été possible d'identifier certains dons de lait maternel pouvant prévenir l'inflammation de façon significative, via la réduction de l'expression du signal NF-κB (nuclear factor kappa-B), à l'intérieur des cellules. À partir de ces données, un profil de certains facteurs bioactifs clés contenus dans le lait, tels que le facteur de croissance épidermique, les cytokines inflammatoires et les oligosaccharides, a été dressé pour différents dons de lait. Il fut possible de comparer la composition de ces dons en fonction de leur potentiel anti-inflammatoire et de tenter d'identifier une ou plusieurs molécules pouvant être à l'origine de la prévention de l'inflammation. / Necrotizing enterocolitis (NEC) is an inflammatory disease affecting the gastrointestinal tract in 5-10 % of premature infants weighing less than 1500 g at birth. It mainly results in the loss of tissue from the intestinal lining, which allows bacterial invasion, ultimately leading to necrosis of the intestine. Of the treatment options that may likely be able to prevent NEC, breast milk is the most effective approach. Indeed, the latter provides newborns with essential nutrients, but also bioactive substances that may be the origin of its ability to prevent inflammation, one of the main characteristics of NEC. However, there is no assay or marker to predict anti-inflammatory potential of breast milk samples. A functional in vitro test using intestinal epithelial cells has been developed and showed ability to identify certain donated breast milk that can significantly prevent inflammation, via the reduction of the expression of the NF-κB signal (nuclear kappa-B factor), inside cells. From these data, a profile of some key bioactive factors contained in milk, such as epidermal growth factor, inflammatory cytokines, and oligosaccharides, was dressed in different milk donations. It was possible to compare the composition of these donations according to their anti-inflammatory potential and to try to identify one or more molecules which could be the origin of the prevention of inflammation.

Le microbiote digestif humain joue un rôle essentiel et bénéfique pour son hôte mais il est également impliqué dans un nombre croissant de pathologies. Les connaissances sur la composition de cet écosystème ont récemment été révolutionnées grâce à l’utilisation de techniques moléculaires. Cependant, ces techniques comportent des limites importantes. C’est ainsi que le concept de « culturomique » a été introduit ; il consiste en la multiplication de milieux et conditions de culture et l’identification rapide de colonies bactériennes par spectrométrie de masse (MALDITOF) ou par amplification et séquençage du gène de l’ARN ribosomal 16S. Dans la première partie de ce travail, nous avons mis en évidence une association entre la présence de Clostridium butyricum dans les selles et la survenue d’entérocolite ulcéro-nécrosante que ce soit par méthodes de pyroséquençage et culture ou par PCR quantitative en temps réel spécifique de C. butyricum; identifié après séquençage du génome complet de toutes nos souches de C. butyricum, la présence du gène de la β-hémolysine (toxine). Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons montré par cuturomique que les bactéries à Gram-négatif (BGN) étaient fréquemment disséminées au sein du microbiote cutané transitoire des patients hospitalisés en réanimation ; le réservoir serait essentiellement digestif. En conclusion, le microbiote digestif constitue un réservoir sousestimé de bactéries pathogènes. La microbiologie moderne incluant les nouvelles méthodes de culture permet d’étendre de manière considérable les connaissances sur la composition de cet écosystème et son implication en pathologie humaine. / He human gut microbiota plays an important and beneficial role in its host but it is also involved in a growing number of diseases. Knowledge of the composition of this ecosystem have recently been revolutionized by the use of molecular techniques. However, these techniques have significant limitations. Thus, the concept of "culturomics" has been introduced; it consists of the multiplication of culture conditions and the rapid identification of bacterial colonies by mass spectrometry (MALDI-TOF) or by PCR 16S RNA gene sequencing. In the first part of this work, we have demonstrated an association between the presence of Clostridium butyricum in the stool and the occurrence of necrotizing enterocolitis whether by pyrosequencing methods and Culture or by quantitative PCR specific real time C. butyricum; identified after sequencing the complete genome of all our strains of C. butyricum, the presence of the gene of β-hemolysin (toxin). In the second part of this work, we showed by cuturomics that Gram-negative bacteria (BGN) were frequently spread out over the transitional skin microbiota of patients hospitalized in intensive care; the reservoir would essentially digestive. In conclusion, the gut microbiota is an underestimated reservoir of pathogenic bacteria. Modern microbiology including new culture-based methods is currently extending exponentially our knowledge on gut microbiota giving rise to new insights into the pathogenesis or the transmission of infectious diseases.

La recherche en bactériologie et virologie est à la fois de nature cognitive et appliquée. Elle consiste à fédérer et mettre en place une capacité de recherche multidisciplinaire et pouvoir l'intégrer sur un champ très vaste de microorganismes et de maladies. Les nouvelles avancées conceptuelles et technologiques dans le domaine de la génomique, notamment les avancées dans les techniques à haut débit (séquençage, PCR...) permettent actuellement d’avoir rapidement des génomes bactériens et viraux entiers, ou seulement sur quelques gènes d’une grande population. Les progrès dans ce domaine permettent l’accès à ces informations en évitant une combinaison de plusieurs méthodologies, et à moindre coûts. Dans notre travail de thèse, nous avons été porté à analyser et traiter les données de deux études genomiques et métagenomiques, mettant en évidence avantages, limites et attentes liés à ces techniques. La première étude porte sur l'analyse génomique de nouveaux virus géants et chlamydia infectant Vermamoeba vermiformis. La deuxième étude concerne le pyroséquençage 16S de microbiote intestinal de nouveau-nés atteint de l'entérocolite nécrosante. Pour le premier projet du travail de thèse, nous avons analysé les génomes de trois nouvelles espèces de Chlamydiae et onze virus giants (premiers membres de deux probables nouvelles familles) qui se multiplient naturellement dans Vermamoeba vermiformis. L'objectif étant de mettre en évidence les caractéristiques génétiques spécifiques à ces micro-organismes. La deuxième partie a été consacrée à l'analyse des données de pyroséquençage 16S des selles de nouveau-nés atteints de l'entérocolite nécrosante. / Research in bacteriology and virology is both cognitive and applied. It involves federating and developing a multidisciplinary research capacity and being able to integrate it into a very broad field of microorganisms and diseases. New genomic and conceptual advances in genomics, including advances in high-throughput techniques, now permit rapid bacterial and viral genomes, or only a few genes of a large population. Progress in this area allows access to this information by avoiding a combination of several methodologies and at lower costs. In our thesis work, we were led to analyze and process the data of two genomic and metagenomic studies, highlighting advantages, limitations and expectations related to these techniques. The first study focuses on the genomic analysis of new giant viruses and chlamydia infecting Vermamoeba vermiformis. The second study concerns the 16S pyrosequencing of intestinal microbiota of neonates with necrotizing enterocolitis. The first project of the thesis work analyzed the genomes of three new species of Chlamydiae and eleven giant viruses (first members of two probable new families) which naturally multiply in Vermamoeba vermiformis. The objective is to highlight the genetic characteristics specific to these microorganisms. The second part was devoted to the analysis of 16S pyrosequencing data from neonatal enterocolitis neonatal stools. The goal was to identify an agent responsible for this disease.

La dysbiose est une cause importante dans la survenue de maladies, favorisant la prolifération de pathogènes ou induisant l’inflammation. L’étude de ce phénomène est devenue possible grâce aux approches d’analyse génomique (AG) associé avec d’autres techniques. L’entérocolite nécrosante (ECN) et l’infection du pied diabétique (IPD) demeurent deux maladies associées à la dysbiose dans lesquels différents bactéries ont été décrites, notamment C. butyricum dans l’ECN, E. coli et S. aureus dans l’IPD. Dans le cadre de l’ECN, C. butyricum demeure l’espèce la plus fréquente chez les ECN. L’identification clusters liés géographiquement et en fonction du temps. Le portage asymptomatique est suggéré par une similarité génomique des souches patients et contrôles. La prédiction d’un gène de β-hémolysine ainsi leur effet cytotoxique sur les cellules Jurkat avait été observé. De même, sur les cellules Caco-2 malgré le KO du gène de β-hémolysine. En se basant sur l’analyse physico-chimique du surnageant bactérien, nous avons suggéré que la fraction cytotoxique est protéique. La purification de la fraction cytotoxique a permis de trouver une protéine codant pour PspC family possédant un domain conservé commun avec celui de la toxine A/B. L’inactivation du gène codant pour cette protéine n’a pas supprimé l’effet cytotoxique, suggérant la présence d’une combinaison gènes. En parallèle, nous avons ciblé l’impact de C. neonatale par qRPC spécifique rpoB. Cette espèce était plus fréquente chez les patients, ainsi de clones géographiques ont été identifiées. Enfin, des SNPs ont été observés dans des gènes de virulence dans le cas des E. coli et S. aureus isolés de l’IPD. / Dysbiosis remains a main cause during the establishment of several diseases, by promoting bacterial translocation, leading to inflammation process. Specific microorganisms were involved in the pathogenesis of dysbiosis-associated diseases, notably necrotizing enterocolitis (NEC) and diabetic foot (DF). This was possible by the implication of whole-genome analysis (WGA) in association with other techniques. In case of NEC, C. butyricum was significantly associated with in NEC; tested on a South-East French cohort. Geographical and/or temporal clusters were identified, thus genomic relationship between NEC-associated isolates and controls, suggesting the presence of asymptomatic carriage. Genes encoding for β-hemolysin was detected and C. butyricum supernatant exhibited cytotoxic effect on Jurkat cells. Cytotoxic effect was also presented on Caco-2 cells. Supernatant of β-hemolysin-mutant C. butyricum showed enterotoxic effect. Basing on physico-chemical data, we assumed that the evaluated fraction was a protein. Proteomics analysis revealed that PspC family was the cytotoxic protein. This protein owned a glucan-binding domain, shared by C. difficile toxin A/B. The KO of PspC gene was enterotoxic, suggesting by this the existence of a combination of genes. In parallel, a specific rpoB-based qPCR was developed to identify C. neonatale. We found that, C. neonatale was more prevalent in NEC than in controls. Although co-identified in association with C. butyricum. C. neonatale clones were distinguished especially in strains isolated from the same hospital. Regarding to DF infection, SNPs were identified within S. aureus and E. coli genomes, especially in virulent genes.

Contexte : Près de 2,5 millions de nouveau-nés meurent chaque année et plus de 80 % d'entre eux ont un petit poids à la naissance (PPN). Le PPN est une entité clinique complexe impliquant le retard de croissance in utero (RCIU) et la naissance prématurée (NPM). Les nouveau-nés survivants sont exposés à un risque élevé de morbidités périnatales graves (telles que la dysplasie broncho-pulmonaire, l'entérocolite nécrosante, l'encéphalopathie néonatale) en raison des effets dévastateurs de l'inflammation utéro-fœtale sur les organes fœtaux vulnérables. Il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour la protection fœtale ante partum. Parmi les nombreux médiateurs pro-inflammatoires, l'IL-1β se distingue par ses effets délétères. Notre laboratoire a conçu un nouvel antagoniste allostérique du récepteur de l'IL-1, Rytvela, qui s'est avéré efficace contre la NPM lorsqu'il est administré en prophylaxie. Objectif : Cette étude vise à mieux caractériser Rytvela en évaluant son efficacité dans la prévention de la NPM et du RCIU lorsqu'il est administré après l'insulte inflammatoire initiale selon un cadre clinique plus réaliste. Méthodes : Des souris gravides CD-1 ont reçu une injection d'agents pro-inflammatoires/pro-travail, soit l’IL-1β (1 μg i.u.) ou le LPS (10 μg i.p.) aux jours 16-17 de la gestation. Rytvela (2 mg/kg/jour s.c.) a été administré à différents intervalles de temps (0,5h, 2h, 4h, 6h) après l’induction inflammatoire. Le taux de NPM, la survie et le poids des souriceaux ont été évalués. Des analyses histologiques des poumons, intestins et cerveau des nouveau-nés ont été réalisées. Résultats : Toutes les grossesses traitées avec Rytvela ont été menées à terme dans le modèle de l’IL-1β, alors que le taux de NPM était de 57 % dans le groupe non traité. La survie, la croissance et le poids des souriceaux ont été considérablement améliorés avec Rytvela administré 0,5 h post-inflammation (avec une survie presque doublée des portées). L'analyse histologique a révélé dans tous les modèles une morphogenèse fœtale protégée, y compris une alvéolarisation pulmonaire préservée, des villosités intestinales intactes et un arbre cérébrovasculaire protégé associé à une masse cérébrale préservée. Conclusion : Rytvela est efficace dans la prévention de la NPM et du RCIU lorsqu'il est administré en post-inflammatoire. Il présente un effet maximal lorsqu'il était administré rapidement (0,5 h après IL-1β/LPS) et maintenait des effets protecteurs fœtaux significatifs avec une administration retardée (jusqu'à 6 h après IL-1β/LPS). Rytvela améliore la survie et la santé néonatale en préservant l'intégrité et la croissance des tissus fœtaux. Par conséquent, Rytvela est un nouveau prototype thérapeutique prometteur et sécuritaire pour le traitement de la NPM et du RCIU. / Background: Over 2.5 million newborns die yearly and more than 80% of them are of low birthweight (LBW). LBW is a complex clinical entity involving fetal growth restriction (FGR) and preterm birth (PTB). Surviving neonates face a higher risk of serious perinatal morbidities (such as bronchopulmonary dysplasia, necrotizing enterocolitis, neonatal encephalopathy) due to the devastating effects of utero-fetal inflammation on vulnerable fetal organs. There is currently no efficient treatment for fetal antepartum protection. Among the many proinflammatory mediators, IL-1β stands out for its detrimental effects. The host lab has designed a novel allosteric IL-1 receptor antagonist, Rytvela, which has been shown to be effective against PTB when administered prophylactically. Objective: This study aims to further characterize Rytvela by evaluating its efficacy in preventing PTB and FGR when administered after the initial inflammatory insult according to a more realistic clinical setting. Methods: Pregnant CD-1 mice were injected with proinflammatory/prolabour agents, either IL-1β (1 μg i.u.) or LPS (10 μg i.p.) on days 16-17 of gestation. Rytvela (2 mg/kg/day s.c.) was administered at different time intervals (0.5, 2, 4, 6 h) after initial inflammatory insults. PTB rate, neonatal survival, and weight were assessed. Histological analyses of the lungs, intestines, and brain of the neonates were performed. Results: All pregnancies treated with Rytvela were carried to term in the IL-1β model, while the PTB rate was 57% in the untreated group. Pup survival, growth and weight were considerably improved with Rytvela administered 0.5h post-inflammatory insults (with a nearly 2-fold increase in litters survival). Histological analysis revealed in all models a protected morphogenesis of vulnerable fetal organs including preserved lung alveolarization, intact intestinal villi integrity, and protected cerebrovascular tree associated with preserved brain mass. Conclusion: Rytvela is efficient in preventing PTB and FGR when administered post-inflammatory insults. It exhibited maximum effect when administered promptly (0.5h post-IL-1β/LPS) and maintained significant fetal protective effects with delayed administration (up to 6h post- IL-1β/LPS). Rytvela improved birth outcome by preserving fetal tissue integrity and growth. Hence, Rytvela is a promising new and safe therapeutic prototype for treatment of PTB and FGR.