Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento. / Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.

O fungo Metarhizium anisopliae é amplamente estudado como modelo da interação parasita-hospedeiro em nível molecular. Este fungo tem a capacidade de infectar artrópodes suscetíveis de forma direta através de suas cutículas. Para tanto, o fungo, utiliza-se de um processo multifatorial envolvendo pressão mecânica e secreção de hidrolases. Dentre elas, destacam-se as quitinases, envolvidas tanto nos processos de morfogênese do próprio organismo quanto em processos de patogenia e nutrição. Estudos avaliando a expressão de genes possivelmente envolvidos no processo de infecção de hospedeiros ajudam a esclarecer o processo em si. Assim, quitinases são alvos de interesse para estudos de regulação e função. Neste sentido, estratégias para a geração de transformantes que não expressem ou que expressem genes em níveis aumentados são utilizados e aplicados em trabalhos deste e de outros grupos de pesquisa a fim de determinar-se o papel de genes em determinados processos. Este trabalho envolve o estudo do gene chi2, que codifica para uma quitinase (CHI2) de 42 kDa, cuja seqüência fora previamente caracterizada. Inicialmente, análises de regulação demonstraram que este gene é altamente regulado dependendo da fonte de carbono disponibilizada. Para estudar a função da quitinase CHI2, foram gerados mutantes nulos para o gene chi2 (chi2) utilizando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT), com taxa de recombinação homóloga dentre os transformantes de 1,3%. Experimentos de Western blot demonstraram a ausência de expressão de CHI2 nos transformantes. Assim como para a deleção, a superexpressão de chi2 (T33) foi realizada por Agro-transformação e análises de Western blot demonstraram a expressão aumentada e não regulada de CHI2. Bioensaios utilizando o inseto Dysdercus peruvianus demonstram diferenças de tempo letal mediano e tempo letal 90% (TL50 e TL90) entre as linhagens transformantes e selvagem, sendo maiores para o mutante sem expressão de chi2 22 e menores para o transformante superexpressando chi2 T33. Para avaliar a localização celular de CHI2, antisoro foi produzido em coelhos. Análises de microscopia óptica de imunofluorescência demonstraram diferenças marcantes na distribuição da enzima entre as linhagens selvagem e transformadas. Na linhagem selvagem, em hifas diferenciadas em apressório, a proteína encontra-se associada à parede celular, nas regiões de germinação do esporo, na extremidade da hifa, exatamente no ponto de formação do apressório e em todo o apressório, mas ausente no citoplasma e nos esporos. Já em hifas não diferenciadas, CHI2 apresenta-se associada à parede, mas sem pontos específicos e, portanto, difusa no citoplasma. Este fato evidencia possível rota de secreção. As linhagens deletadas não apresentaram fluorescência, indicando a ausência da proteína, sem nenhuma alteração fenotípica aparente. Portanto, CHI2 não teria papel na morfogênese. Linhagens superexpressando CHI2 não demonstraram localização específica de CHI2, cuja fluorescência foi mais intensa e difusa pela célula. Nestas linhagens, a quitinase CHI2 também pode ser detectada na parede celular dos conídios. Nenhuma alteração morfológica aparente foi detectada nos mutantes de superexpressão. Além disso, o gene chi2 sofre processos diferenciais de splicing, gerando duas espécies de transcritos. Uma delas é totalmente processada e outra retém o segundo íntron, como demonstrado por ensaios de Northern blotting. Demonstramos por ensaios de Western blot em géis SDS-PAGE-2D e espectrometria de massas que as duas proteínas diferentes são traduzidas a partir destes transcritos. Em trabalhos posteriores, transformantes carregando deleção ou superexpressando as diferentes formas poderão auxiliar no entendimento da função das formas de chitinase geradas e contribuirão para o conhecimento mais aprofundado da função das endoquitinases nos processos celulares. / Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883) is a filamentous fungi widely studied as a model for host-parasite interactions on its molecular basis. This fungus has the ability to infect susceptible arthropods in a direct manner through the host cuticle. The fungus uses a complex process involving mechanic pressure and secretion of hydrolases, among them chitinases, which act either in morphogenesis processes as in pathogenesis and nutrition. Studies that evaluate the expression of genes possibly involved in the pathogenesis process may aid to clarify the process itself. Thus, chitinases genes become the aim for regulation, deletion and overexpression studies. Strategies for generating transformants lacking or overexpressing genes in levels above wild strains are currently being used and already applied in researches of our and other groups. This work involves the study of the chi2 gene, of which sequence has been already characterisized and codes for a 42 kDa chitinase (CHI2). Initially, regulation analysis showed that this gene is tightly regulated depending on the carbon source. The null chi2 mutants (chi2) were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT) and the homologous recombination rate was 1.3%. Western blotting assays demonstrated no CHI2 expression by the null transformants. The overexpression of chi2 (T33) was performed using ATMT and Western blotting analysis demonstrated non regulated high levels of CHI2 expression. Bioassays using the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus demonstrated distinct TL50 and TL90 values among the wild and modified strains, which were higher for chi2 and lower for T33. In order to evaluate the cellular localization of CHI2, antiserum was produced in rabbits. Optical imunomicroscopy assays demonstrated significantly differences in the enzyme distribution among the wild and transformed strains. In the wild strain, in apressorium differentiated hyphae, the protein is associated with the cell wall, at the germination spot of the conidia, at the distal extremity of the hyphae, exactly at the apressorium formation spot, all over the apressorium and absent at the cytoplasm and conidia. In non differentiated hyphae, CHI2 is also associated with the cell wall, without specific locations and diffused throughout the cytoplasm. Possibly, CHI2 is addressed to secretion. The null strains did not present fluorescence as expected, confirming the absence of the protein, but no morphological alterations were observed. The CHI2 overexpressing strains did not show specific location for CHI2 protein, and the fluorescence reached higher levels and diffused through the cell. Also, CHI2 was detected at the conidia cell wall. No apparent morphological changes were detected in both CHI2 null and overexpressing strains. Thus, CHI2 do not have a role in morphogenesis. It was also observed that this gene presents different patterns of splicing, generating two transcript species. One of them is completely processed, while a second one retains a 72 base pairs intron, as demonstrated by Northern blotting assays. Mass spectrometry demonstrated the synthesis of two different proteins from the transcripts. In future works, transformants carrying deletions or overexpressing the distinct forms of the protein will provide new insights about their function and will improve the knowledge about the overall function of endochitinases throughout the cell development.

Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento. / Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.

O fungo Metarhizium anisopliae é amplamente estudado como modelo da interação parasita-hospedeiro em nível molecular. Este fungo tem a capacidade de infectar artrópodes suscetíveis de forma direta através de suas cutículas. Para tanto, o fungo, utiliza-se de um processo multifatorial envolvendo pressão mecânica e secreção de hidrolases. Dentre elas, destacam-se as quitinases, envolvidas tanto nos processos de morfogênese do próprio organismo quanto em processos de patogenia e nutrição. Estudos avaliando a expressão de genes possivelmente envolvidos no processo de infecção de hospedeiros ajudam a esclarecer o processo em si. Assim, quitinases são alvos de interesse para estudos de regulação e função. Neste sentido, estratégias para a geração de transformantes que não expressem ou que expressem genes em níveis aumentados são utilizados e aplicados em trabalhos deste e de outros grupos de pesquisa a fim de determinar-se o papel de genes em determinados processos. Este trabalho envolve o estudo do gene chi2, que codifica para uma quitinase (CHI2) de 42 kDa, cuja seqüência fora previamente caracterizada. Inicialmente, análises de regulação demonstraram que este gene é altamente regulado dependendo da fonte de carbono disponibilizada. Para estudar a função da quitinase CHI2, foram gerados mutantes nulos para o gene chi2 (chi2) utilizando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT), com taxa de recombinação homóloga dentre os transformantes de 1,3%. Experimentos de Western blot demonstraram a ausência de expressão de CHI2 nos transformantes. Assim como para a deleção, a superexpressão de chi2 (T33) foi realizada por Agro-transformação e análises de Western blot demonstraram a expressão aumentada e não regulada de CHI2. Bioensaios utilizando o inseto Dysdercus peruvianus demonstram diferenças de tempo letal mediano e tempo letal 90% (TL50 e TL90) entre as linhagens transformantes e selvagem, sendo maiores para o mutante sem expressão de chi2 22 e menores para o transformante superexpressando chi2 T33. Para avaliar a localização celular de CHI2, antisoro foi produzido em coelhos. Análises de microscopia óptica de imunofluorescência demonstraram diferenças marcantes na distribuição da enzima entre as linhagens selvagem e transformadas. Na linhagem selvagem, em hifas diferenciadas em apressório, a proteína encontra-se associada à parede celular, nas regiões de germinação do esporo, na extremidade da hifa, exatamente no ponto de formação do apressório e em todo o apressório, mas ausente no citoplasma e nos esporos. Já em hifas não diferenciadas, CHI2 apresenta-se associada à parede, mas sem pontos específicos e, portanto, difusa no citoplasma. Este fato evidencia possível rota de secreção. As linhagens deletadas não apresentaram fluorescência, indicando a ausência da proteína, sem nenhuma alteração fenotípica aparente. Portanto, CHI2 não teria papel na morfogênese. Linhagens superexpressando CHI2 não demonstraram localização específica de CHI2, cuja fluorescência foi mais intensa e difusa pela célula. Nestas linhagens, a quitinase CHI2 também pode ser detectada na parede celular dos conídios. Nenhuma alteração morfológica aparente foi detectada nos mutantes de superexpressão. Além disso, o gene chi2 sofre processos diferenciais de splicing, gerando duas espécies de transcritos. Uma delas é totalmente processada e outra retém o segundo íntron, como demonstrado por ensaios de Northern blotting. Demonstramos por ensaios de Western blot em géis SDS-PAGE-2D e espectrometria de massas que as duas proteínas diferentes são traduzidas a partir destes transcritos. Em trabalhos posteriores, transformantes carregando deleção ou superexpressando as diferentes formas poderão auxiliar no entendimento da função das formas de chitinase geradas e contribuirão para o conhecimento mais aprofundado da função das endoquitinases nos processos celulares. / Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883) is a filamentous fungi widely studied as a model for host-parasite interactions on its molecular basis. This fungus has the ability to infect susceptible arthropods in a direct manner through the host cuticle. The fungus uses a complex process involving mechanic pressure and secretion of hydrolases, among them chitinases, which act either in morphogenesis processes as in pathogenesis and nutrition. Studies that evaluate the expression of genes possibly involved in the pathogenesis process may aid to clarify the process itself. Thus, chitinases genes become the aim for regulation, deletion and overexpression studies. Strategies for generating transformants lacking or overexpressing genes in levels above wild strains are currently being used and already applied in researches of our and other groups. This work involves the study of the chi2 gene, of which sequence has been already characterisized and codes for a 42 kDa chitinase (CHI2). Initially, regulation analysis showed that this gene is tightly regulated depending on the carbon source. The null chi2 mutants (chi2) were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT) and the homologous recombination rate was 1.3%. Western blotting assays demonstrated no CHI2 expression by the null transformants. The overexpression of chi2 (T33) was performed using ATMT and Western blotting analysis demonstrated non regulated high levels of CHI2 expression. Bioassays using the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus demonstrated distinct TL50 and TL90 values among the wild and modified strains, which were higher for chi2 and lower for T33. In order to evaluate the cellular localization of CHI2, antiserum was produced in rabbits. Optical imunomicroscopy assays demonstrated significantly differences in the enzyme distribution among the wild and transformed strains. In the wild strain, in apressorium differentiated hyphae, the protein is associated with the cell wall, at the germination spot of the conidia, at the distal extremity of the hyphae, exactly at the apressorium formation spot, all over the apressorium and absent at the cytoplasm and conidia. In non differentiated hyphae, CHI2 is also associated with the cell wall, without specific locations and diffused throughout the cytoplasm. Possibly, CHI2 is addressed to secretion. The null strains did not present fluorescence as expected, confirming the absence of the protein, but no morphological alterations were observed. The CHI2 overexpressing strains did not show specific location for CHI2 protein, and the fluorescence reached higher levels and diffused through the cell. Also, CHI2 was detected at the conidia cell wall. No apparent morphological changes were detected in both CHI2 null and overexpressing strains. Thus, CHI2 do not have a role in morphogenesis. It was also observed that this gene presents different patterns of splicing, generating two transcript species. One of them is completely processed, while a second one retains a 72 base pairs intron, as demonstrated by Northern blotting assays. Mass spectrometry demonstrated the synthesis of two different proteins from the transcripts. In future works, transformants carrying deletions or overexpressing the distinct forms of the protein will provide new insights about their function and will improve the knowledge about the overall function of endochitinases throughout the cell development.

Metarhizium anisopliae é considerado um organismo modelo para estudos relacionados com interações entre artrópodes e microrganismos. Durante estas interações ocorre a secreção de várias proteínas, incluindo enzimas hidrolíticas que degradam a cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. As quitinases de Metarhizium vêm sendo alvo de muitos estudos, pois além de participar da degradação da cutícula, estas enzimas têm funções importantes na biologia do fungo, participando do remodelamento da parede celular. Este trabalho teve como objetivo identificar proteínas secretadas diferencialmente expressas durante o cultivo do fungo, em condições que mimetizam a interação com o hospedeiro e validar as quitinases propostas pela análise in silico do projeto genoma de M. anisopliae. Sobrenadantes de culturas do fungo na presença de glicose, quitina cristalina e N-acetilglicosamina foram analisados utilizando eletroforese uni e bidimensional seguida de análise por espectrometria de massas (MS). Através de comparação com bancos de dados (NCBI e proteínas preditas de M. anisopliae) identificamos 38 proteínas, das quais quatro são quitinases: a quitinase CHIT30 (chi3), a quitinase CHIT42 (chit1) e duas quitinases preditas pela análise in silico, as quitinases B4 e D1. Estas análises permitiram identificar algumas proteínas secretadas ainda não descritas para Metarhizium e validar duas novas quitinases. / Metarhizium anisopliae is considered a model organism for studies concerning interactions between arthropods and microorganisms. During these interactions the secretion of several proteins occurs, including hydrolytic enzymes that degrade the host cuticle during the penetration stage. Metarhizium chitinases have been the target of many studies, because, besides participating in the degradation of the cuticle, these enzymes have important functions in the biology of the fungus participating in the remodeling of the cell wall. This work aimed to identify secreted proteins differentially expressed during the growth of the fungus under conditions that mimic the interaction with the host, and to validate the chitinases proposed by in silico analysis of the M. anisopliae genome project. Supernantants from cultures of the fungus in the presence of glucose, crystalline chitin and N-acetylglucosamine were analyzed using one and twodimensional gel electrophoresis followed by analysis by mass spectrometry (MS). Trough comparison with databases (NCBI and predicted proteins of M. anisopliae) we identified 38 proteins, four of which are chitinases: chitinase CHIT30 (chi3), chitinase CHIT42 (chit1) and two chitinases predicted by in silico analysis, chitinases B4 and D1. This analysis allowed the identification of some undescribed proteins secreted by Metarhizium and validated two new chitinases.

O fungo filamentoso Metarhizium anisopliae é o entomopatógeno melhor caracterizado em nível molecular, em especial em relação a sua patogênese, principalmente pelo isolamento de genes diferencialmente expressos durante a infecção de hospedeiros. A infecção é um processo multifatorial complexo e os genes candidatos devem ser analisados funcionalmente. Para tal, uma das estratégias mais bem sucedidas é o desenvolvimento de sistemas para a geração de mutantes nulos por inativação gênica, mediada por recombinação homóloga. Neste trabalho, esta estratégia foi aplicada ao fungo M. anisopliae por intermédio da Agro-transformação. Inicialmente, padronizamos este sistema utilizando como alvo o gene trp1 deste fungo, envolvido no anabolismo do aminoácido triptofano. Obtivemos uma freqüência de recombinação homóloga em torno de 20 % para este locus. Como a integração do DNA exógeno é majoritariamente ectópica, nos valemos desta característica para construir uma biblioteca de mutantes de inserção e procedemos a uma caracterização preliminar de conídeos de mutantes morfológicos em relação a sua sensibilidade à radiação UV-A. Mostramos assim que este sistema é aplicável para o estudo funcional de genes no fungo. Dentre os prováveis fatores envolvidos no processo de infecção de M. anisopliae estão algumas hidrolases e o nosso grupo tem se dedicado a caracterização das quitinases neste fungo. As quitinases em particular são atraentes do ponto de vista de sua função, pois estão presentes em todos os fungos para o remodelamento da sua parede celular, composta por quitina, nos processos de crescimento e diferenciação, mas também nos processos de nutrição e patogênese. No sentido de estudar a função de um gene específico caracterizamos o gene chi3, o qual codifica para a quitinase bifuncional CHIT30. Clonamos a região 5´ flanqueadora e a análise in silico revelou a presença de possíveis elementos canônicos de regulação, dentre eles um associado à resposta ao choque térmico. Análises por qRT-PCR revelaram aumento dos níveis de transcritos do gene chi3 em condições de estresse térmico. Mutantes inativados deste gene foram gerados por Agro-transformação e os mesmos apresentaram menor produção de quitinases após o choque térmico e maior TL50 em bioensaios utilizando como modelo o inseto Dysdercus peruvianus. Para determinar a localização subcelular da quitinase CHIT30 foram gerados transformantes com um cassete para a expressão da proteína de fusão CHIT30 marcada com a proteína repórter GFP. Análises por microscopia confocal revelaram que a proteína de fusão está associada à parede celular, provavelmente seguindo a via de secreção de proteínas. Nossos resultados mostram que o gene chi3 apresenta regulação complexa. A expressão da quitinase CHIT30 de forma constitutiva parece ser letal e os mutantes nulos não demonstraram fenótipos claramente detectáveis em experimentos convencionais. O mutante Δchi3 apresentou eficiência diminuída na infecção do inseto D. peruvianus e a sua função na biologia do fungo é também complexa e ainda requer melhor detalhamento. / Metarhizium anisopliae is the best characterized enthomopathogenic fungus at the molecular level. The cloning of differentially expressed genes during the infection process is the main approach to study the infection process. The search for pathogenicity determinants has revealed that the process is complex and multifactorial. The characterization of putative genes related to the infection process has been made by the generation of null mutants via homologous recombination at the wild–type loci by using inactivation cassettes. In this work, we have developed a strategy for the generation of null mutants of the tryptophan anabolic gene trp1. Using Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT), 22% efficiency of homologous recombination at the trp1 locus was achieved. Due to the high frequency of ectopic integration of the trp1 gene inactivation cassette, we applied this as a tool to generate an insertional library to isolate functional mutants. Morphological mutants were tested for their susceptibility to UV-A radiation. Therefore, we demonstrated the feasibility of this methodology in forward genetics studies in M. anisopliae. During fungal penetration through the host cuticle, hydrolases are tough to be crucial for infection consolidation. Chitinases are some of these enzymes and could be involved in cell wall modification or nutrient acquisition and pathogenicity. In order to contribute to the understanding of the role of specific chitinase genes in Metarhizium, we further characterized the CHIT30 chitinase encoding gene chi3. The 5´ upstream cloning and in silico analysis showed that some putative regulatory sequences are present, in particular a stress response element. Quantitative RT-PCR analysis detected an increase in chi3 transcripts during heatshock. ATMT gene inactivation was conducted for the chi3 gene. Mutants produced a lower level of chitinases during heat shock and were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. To uncover the subcellular localization of the CHIT30 chitinase, we have generated transformants to produce a GFP labelled CHIT30. Confocal microscopy analysis showed that the fusion protein was located at the cell wall. The chi3 gene possesses a complex regulation and the constitutive expression of the CHIT30 chitinase appears to be lethal. Null chi3 gene mutants were less virulent to the insect Dysdercus peruvianus. The function of this gene in virulence to insects is not clear. More studies will be necessary to fully understand the role of chitinases in fungi.

O fungo Metarhizium anisopliae é amplamente estudado como modelo da interação parasita-hospedeiro em nível molecular. Este fungo tem a capacidade de infectar artrópodes suscetíveis de forma direta através de suas cutículas. Para tanto, o fungo, utiliza-se de um processo multifatorial envolvendo pressão mecânica e secreção de hidrolases. Dentre elas, destacam-se as quitinases, envolvidas tanto nos processos de morfogênese do próprio organismo quanto em processos de patogenia e nutrição. Estudos avaliando a expressão de genes possivelmente envolvidos no processo de infecção de hospedeiros ajudam a esclarecer o processo em si. Assim, quitinases são alvos de interesse para estudos de regulação e função. Neste sentido, estratégias para a geração de transformantes que não expressem ou que expressem genes em níveis aumentados são utilizados e aplicados em trabalhos deste e de outros grupos de pesquisa a fim de determinar-se o papel de genes em determinados processos. Este trabalho envolve o estudo do gene chi2, que codifica para uma quitinase (CHI2) de 42 kDa, cuja seqüência fora previamente caracterizada. Inicialmente, análises de regulação demonstraram que este gene é altamente regulado dependendo da fonte de carbono disponibilizada. Para estudar a função da quitinase CHI2, foram gerados mutantes nulos para o gene chi2 (chi2) utilizando-se transformação mediada por Agrobacterium tumefaciens (ATMT), com taxa de recombinação homóloga dentre os transformantes de 1,3%. Experimentos de Western blot demonstraram a ausência de expressão de CHI2 nos transformantes. Assim como para a deleção, a superexpressão de chi2 (T33) foi realizada por Agro-transformação e análises de Western blot demonstraram a expressão aumentada e não regulada de CHI2. Bioensaios utilizando o inseto Dysdercus peruvianus demonstram diferenças de tempo letal mediano e tempo letal 90% (TL50 e TL90) entre as linhagens transformantes e selvagem, sendo maiores para o mutante sem expressão de chi2 22 e menores para o transformante superexpressando chi2 T33. Para avaliar a localização celular de CHI2, antisoro foi produzido em coelhos. Análises de microscopia óptica de imunofluorescência demonstraram diferenças marcantes na distribuição da enzima entre as linhagens selvagem e transformadas. Na linhagem selvagem, em hifas diferenciadas em apressório, a proteína encontra-se associada à parede celular, nas regiões de germinação do esporo, na extremidade da hifa, exatamente no ponto de formação do apressório e em todo o apressório, mas ausente no citoplasma e nos esporos. Já em hifas não diferenciadas, CHI2 apresenta-se associada à parede, mas sem pontos específicos e, portanto, difusa no citoplasma. Este fato evidencia possível rota de secreção. As linhagens deletadas não apresentaram fluorescência, indicando a ausência da proteína, sem nenhuma alteração fenotípica aparente. Portanto, CHI2 não teria papel na morfogênese. Linhagens superexpressando CHI2 não demonstraram localização específica de CHI2, cuja fluorescência foi mais intensa e difusa pela célula. Nestas linhagens, a quitinase CHI2 também pode ser detectada na parede celular dos conídios. Nenhuma alteração morfológica aparente foi detectada nos mutantes de superexpressão. Além disso, o gene chi2 sofre processos diferenciais de splicing, gerando duas espécies de transcritos. Uma delas é totalmente processada e outra retém o segundo íntron, como demonstrado por ensaios de Northern blotting. Demonstramos por ensaios de Western blot em géis SDS-PAGE-2D e espectrometria de massas que as duas proteínas diferentes são traduzidas a partir destes transcritos. Em trabalhos posteriores, transformantes carregando deleção ou superexpressando as diferentes formas poderão auxiliar no entendimento da função das formas de chitinase geradas e contribuirão para o conhecimento mais aprofundado da função das endoquitinases nos processos celulares. / Metarhizium anisopliae (Metschn.) Sorokin (1883) is a filamentous fungi widely studied as a model for host-parasite interactions on its molecular basis. This fungus has the ability to infect susceptible arthropods in a direct manner through the host cuticle. The fungus uses a complex process involving mechanic pressure and secretion of hydrolases, among them chitinases, which act either in morphogenesis processes as in pathogenesis and nutrition. Studies that evaluate the expression of genes possibly involved in the pathogenesis process may aid to clarify the process itself. Thus, chitinases genes become the aim for regulation, deletion and overexpression studies. Strategies for generating transformants lacking or overexpressing genes in levels above wild strains are currently being used and already applied in researches of our and other groups. This work involves the study of the chi2 gene, of which sequence has been already characterisized and codes for a 42 kDa chitinase (CHI2). Initially, regulation analysis showed that this gene is tightly regulated depending on the carbon source. The null chi2 mutants (chi2) were constructed by Agrobacterium tumefaciens mediated transformation (ATMT) and the homologous recombination rate was 1.3%. Western blotting assays demonstrated no CHI2 expression by the null transformants. The overexpression of chi2 (T33) was performed using ATMT and Western blotting analysis demonstrated non regulated high levels of CHI2 expression. Bioassays using the cotton stainer bug Dysdercus peruvianus demonstrated distinct TL50 and TL90 values among the wild and modified strains, which were higher for chi2 and lower for T33. In order to evaluate the cellular localization of CHI2, antiserum was produced in rabbits. Optical imunomicroscopy assays demonstrated significantly differences in the enzyme distribution among the wild and transformed strains. In the wild strain, in apressorium differentiated hyphae, the protein is associated with the cell wall, at the germination spot of the conidia, at the distal extremity of the hyphae, exactly at the apressorium formation spot, all over the apressorium and absent at the cytoplasm and conidia. In non differentiated hyphae, CHI2 is also associated with the cell wall, without specific locations and diffused throughout the cytoplasm. Possibly, CHI2 is addressed to secretion. The null strains did not present fluorescence as expected, confirming the absence of the protein, but no morphological alterations were observed. The CHI2 overexpressing strains did not show specific location for CHI2 protein, and the fluorescence reached higher levels and diffused through the cell. Also, CHI2 was detected at the conidia cell wall. No apparent morphological changes were detected in both CHI2 null and overexpressing strains. Thus, CHI2 do not have a role in morphogenesis. It was also observed that this gene presents different patterns of splicing, generating two transcript species. One of them is completely processed, while a second one retains a 72 base pairs intron, as demonstrated by Northern blotting assays. Mass spectrometry demonstrated the synthesis of two different proteins from the transcripts. In future works, transformants carrying deletions or overexpressing the distinct forms of the protein will provide new insights about their function and will improve the knowledge about the overall function of endochitinases throughout the cell development.

Metarhzium anisopliae é um fungo entomopatogênico que infecta uma variedade de artrópodes. É o entomopatógeno melhor caracterizado, tendo a capacidade de penetrar ativamente através da cutícula de seus hospedeiros. Durante a infecção, Metarhizium produz hidrolases, como proteases, lípases e quitinases que auxiliam na penetração da cutícula de seus hospedeiros e também estão relacionadas ao processo de colonização. Nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo de genes que atuam na etapa de penetração dos hospedeiros, em especial, caracterizando o sistema de degradação da quitina em M. anisopliae. Três genes que codificam quitinases já foram caracterizados em M. anisopliae: o gene chit1, que codifica uma endoquitinase de 42 kDa (BOGO, 1998), o gene chi2 que codifica uma quitinase de 42 kDa e o gene chi3 que codifica uma endo/exo quitinase de 30 kDa (SILVA et al., 2005). Entretanto, apenas a quitinase de 30 kDa foi demonstrada ser produzida durante o processo de penetração. A função dos outros dois genes não foi ainda determinada. O objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene chit1 em M. anisopliae por meio da superexpressão da endoquitinase de 42 KDa. Neste, e em trabalhos anteriores do grupo, o gene chit1 foi clonado e caracterizado e sua ORF foi clonada em um vetor de expressão baseado no promotor homólogo do gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006). Em outra construção a ORF chit1 foi clonada na orientação anti-senso no mesmo vetor de expressão. Neste trabalho, a superexpressão, bem como a supressão da expressão pelo anti-senso, foram analisadas em relação à produção da endoquitinase de 42 KDa e as linhagens construídas foram testadas em bioensaios utilizando o carrapato B. microplus, para se verificar sua participação no processo de infecção de carrapatos. Possíveis alterações morfológicas no ciclo normal de desenvolvimento também foram analisadas. Os resultados mostram um aumento na expressão da endoquitinase na construção de superexpressão em relação à linhagem selvagem de M. anisopliae. Em experimentos de bioensaio com carrapatos (Boophilus microplus) não foram observadas diferenças na eficiência de infecção da linhagemdo fungo que superexpressa o gene chit1 nem daquela contendo a construção antisenso, havendo 100% de mortalidade no terceiro dia após a infecção, comparável com a linhagem selvagem. Também não foram detectadas alterações no desenvolvimento, na morfologia e na produção de esporos nas linhagens transformantes em relação à linhagem selvagem do fungo. / M. anisopliae is an entomopathogenic fungi that infects a variety of arthropods. It is the best characterized entomopathogen having the capacity to penetrate actively through host-cuticle. During the infection, Metarhizium produces hidrolases, as proteases, lipases and chitinases that assist the penetration of cuticle of its hosts and also is related to the host-colonization process. Our group has focused the study of genes that act on the penetration stage, in special, characterizing the system of chitin degradation in M. anisopliae. Three genes that codify for chitinases have already been characterized in M. anisopliae: the gene chit1, that codifies an endochitinase of 42 kDa (BOGO, 1998), the gene chi2 that codifies for a chitinase of 42 kDa and the gene chi3 that codifies an endo/exo acting chitinase (SILVA et al., 2005). However, only chitinase 30 kDa was demonstrated to be produced during the penetration process. The function of the other two genes is still not determined. In this work we studied the function of the gene chit1 in Metarhizium by means of overexpression of the chitinase. Here, and in previous work of the group, the gene chit1 was cloned and characterized and its ORF was cloned in a expression vector based on the homologous promoter of the gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006) . In other construction the chit1 ORF was cloned in the anti-sense orientation in the same vector. The overexpression, as well as the suppression of the expression in the anti-sense, was analyzed in relation to the production of 42 KDa endochitinase and the infectivity of the overexpressing transformants tested in bioassay using tick B. microplus to verify its participation in the process of infection. Possible morphologic alterations in the normal cycle of development had been also analyzed. The results shown an increase in the expression of 42 KDa endochitinase in the transformants in relation to the wild-type M. anisopliae. In bioassay experiments using ticks differences in the efficiency of infection were not observed neither in the overexpressing transformants nor in the anti-sense construct as compared to the wild-type. Also alterations in development, morphology and production of conidia in the transformants were not detected.