Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium. / To infect their arthropod hosts, Metarhizium anisopliae produces a series of hydrolytic enzymes and several morphological changes, including the formation of structures called appressoria and blastospores. These infective structures represent crucial stages of penetration and dissemination in the insect host, repectively. In addition, the appressorium is a structure conserved among phytopathogenic and entomopathogenic fungi. The emp1 gene (encodes an extracellular matrix protein) from Magnaporthe grisea showed an important role in appressorium differentiation, as well as pathogenicity and virulence. Our goal was evaluate the possible role of an ortholog gene emp1 in M. anisopliae by transcriptional analysis and construction of functional mutants by insertional mutagenesis mediated by agrotransformation. We generated transformants strains containing the gene inactivation cassette of emp1 (pPZP::bar::emp1), which was constructed by subcloning of flanking portions 5’ (1.515bp) and 3’ (1.513bp) fused in a expression cassette of bar gene (resistance to glufosinate ammonium). The frequency of transformation observed in this round was higher than 60%, but only 1,5% of the transformants there is evidence of homologous recombination. We also analysed the transcriptional profile of emp1 under three conditions previously standardized, such as differentiated cells in appressorium, hyphae (vegetative growth) and blastospores. Accordingly, we observed the presence of transcripts of this gene in all growth condition tested. In a second step of this work, we evaluated the transcriptional profile of putative chitinases of the M. anisopliae in those different stages of cellular diferentiation. This class of proteins is directly involved in fungal cell wall remodeling during cellular diferentiation, as well as degradation of chitin in the host cuticle during the penetration stage. Originally we characterized three genes of chitinases (chit1, chi2 and chi3), but apart from these, the in silico analysis of the genome revealed 20 putative chitinases. This diversity may be reponsible for differents functions that the set of chitinases enzymes have in the chitin degradation during the life and infection cycle of the fungus. It is therefore important: (i) validate transcriptionally the putative chitinases and (ii) attemping to assign function to each one of them. Chitinases transcript survey was performed using cDNAs from three cell types: appressorium, vegetative growth and blastospores. In the appressorium condition ten species of transcripts were detected being six from the subgroup A chitinases, three from group B and one from group D. No transcripts of subgroup C chitinases were detected. Both in vegetative growth and blastospores seven species of transcripts of the subgroup A, and one from group D were detected. Chitinases from subgroup B differed - three species of transcripts were detected during vegetative growth and six were detected in blastospores. This study of several putative genes (as emp1 and chitinases) of M. anisopliae, under different approaches, may represent an important preliminary outcome to shed a light in the functions of these genes during life cycle and infection of Metarhizium.

Metarhzium anisopliae é um fungo entomopatogênico que infecta uma variedade de artrópodes. É o entomopatógeno melhor caracterizado, tendo a capacidade de penetrar ativamente através da cutícula de seus hospedeiros. Durante a infecção, Metarhizium produz hidrolases, como proteases, lípases e quitinases que auxiliam na penetração da cutícula de seus hospedeiros e também estão relacionadas ao processo de colonização. Nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo de genes que atuam na etapa de penetração dos hospedeiros, em especial, caracterizando o sistema de degradação da quitina em M. anisopliae. Três genes que codificam quitinases já foram caracterizados em M. anisopliae: o gene chit1, que codifica uma endoquitinase de 42 kDa (BOGO, 1998), o gene chi2 que codifica uma quitinase de 42 kDa e o gene chi3 que codifica uma endo/exo quitinase de 30 kDa (SILVA et al., 2005). Entretanto, apenas a quitinase de 30 kDa foi demonstrada ser produzida durante o processo de penetração. A função dos outros dois genes não foi ainda determinada. O objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene chit1 em M. anisopliae por meio da superexpressão da endoquitinase de 42 KDa. Neste, e em trabalhos anteriores do grupo, o gene chit1 foi clonado e caracterizado e sua ORF foi clonada em um vetor de expressão baseado no promotor homólogo do gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006). Em outra construção a ORF chit1 foi clonada na orientação anti-senso no mesmo vetor de expressão. Neste trabalho, a superexpressão, bem como a supressão da expressão pelo anti-senso, foram analisadas em relação à produção da endoquitinase de 42 KDa e as linhagens construídas foram testadas em bioensaios utilizando o carrapato B. microplus, para se verificar sua participação no processo de infecção de carrapatos. Possíveis alterações morfológicas no ciclo normal de desenvolvimento também foram analisadas. Os resultados mostram um aumento na expressão da endoquitinase na construção de superexpressão em relação à linhagem selvagem de M. anisopliae. Em experimentos de bioensaio com carrapatos (Boophilus microplus) não foram observadas diferenças na eficiência de infecção da linhagemdo fungo que superexpressa o gene chit1 nem daquela contendo a construção antisenso, havendo 100% de mortalidade no terceiro dia após a infecção, comparável com a linhagem selvagem. Também não foram detectadas alterações no desenvolvimento, na morfologia e na produção de esporos nas linhagens transformantes em relação à linhagem selvagem do fungo. / M. anisopliae is an entomopathogenic fungi that infects a variety of arthropods. It is the best characterized entomopathogen having the capacity to penetrate actively through host-cuticle. During the infection, Metarhizium produces hidrolases, as proteases, lipases and chitinases that assist the penetration of cuticle of its hosts and also is related to the host-colonization process. Our group has focused the study of genes that act on the penetration stage, in special, characterizing the system of chitin degradation in M. anisopliae. Three genes that codify for chitinases have already been characterized in M. anisopliae: the gene chit1, that codifies an endochitinase of 42 kDa (BOGO, 1998), the gene chi2 that codifies for a chitinase of 42 kDa and the gene chi3 that codifies an endo/exo acting chitinase (SILVA et al., 2005). However, only chitinase 30 kDa was demonstrated to be produced during the penetration process. The function of the other two genes is still not determined. In this work we studied the function of the gene chit1 in Metarhizium by means of overexpression of the chitinase. Here, and in previous work of the group, the gene chit1 was cloned and characterized and its ORF was cloned in a expression vector based on the homologous promoter of the gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006) . In other construction the chit1 ORF was cloned in the anti-sense orientation in the same vector. The overexpression, as well as the suppression of the expression in the anti-sense, was analyzed in relation to the production of 42 KDa endochitinase and the infectivity of the overexpressing transformants tested in bioassay using tick B. microplus to verify its participation in the process of infection. Possible morphologic alterations in the normal cycle of development had been also analyzed. The results shown an increase in the expression of 42 KDa endochitinase in the transformants in relation to the wild-type M. anisopliae. In bioassay experiments using ticks differences in the efficiency of infection were not observed neither in the overexpressing transformants nor in the anti-sense construct as compared to the wild-type. Also alterations in development, morphology and production of conidia in the transformants were not detected.

As superóxido dismutases são metaloenzimas amplamente distribuídas entre os organismos e desempenham um importante papel na defesa celular contra os danos provocados por espécies reativas de oxigênio mediados pelo radical superóxido, um subproduto do metabolismo oxidativo. As SODs são classificadas em quatro grupos, dependendo de seu cofator metálico, em CuZnSOD; MnSOD, FeSOD e NiSOD. Além de sua função intrínseca, as SODs estão implicadas em outros processos com a adesão e a sinalização celular e na patogenicidade. Em particular, a participação das SODs em processos patogênicos tem se mostrado muito ampla, abrangendo os mais variados sistemas patógeno-hospedeiro. Visando estudar o processo de penetração do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae em carrapatos, as enzimas com atividade SOD foram descritas e parcialmente caracterizadas, apresentando três tipo de atividade: CuZn, Mn e Fe.Para melhor caracterizar as SODs de M. anisopliae, neste trabalho purificamos e caracterizamos a CuZnSOD. A enzima apresenta uma massa presumida em géis desnaturantes de ~20 KDa. A etapa de cromatografia de gel filtração foi substituída, com sucesso, por uma cromatografia de afinidade, apresentando ganho no rendimento total de 92%, em relação ao rendimento final encontrado na purificação utilizando-se resina Sephacel Sephadex G-150. Em relação à amostra inicial (P95%), o fator de purificação foi de 140% maior. Padronizamos um ensaio enzimático de quantificação e discriminação da atividades SODs, que se mostrou adequado e eficaz para a detecção de SODs em extratos celulares brutos e/ou fracionados. Nos ensaios espectrofotométricos, a CuZnSOD purifica de M. anisopliae foi inibida por 2 mM de KCN. Inibição da atividade em presença de 2 mM de peróxido de hidrogênio também foi observada. PMSF (2 mM) e cloreto de mercúrio (5 mM) inibiram a atividade da enzima, indicando que pode estar ocorrendo uma inibição inespecífica através de resíduos de serina e cisteínas não reativos, presente na enzima. A purificação de cada uma das SODs descritas para M. anisopliae, é um passo importante para a elucidação da função destas enzimas durante processo metabólicos e no processo de infecção de M. anisopliae em seus hospedeiros. A produção de anticorpos mono- e policlonais contra estas proteínas,e sua posterior aplicação na determinação da localização celular de cada uma, é um destes passos. Além disso, pode facilitar o isolamento de genes que codificam para as SODs, possibilitando a obtenção de mutantes e/ou linhagens transgênicas e estudos da expressão destas proteínas.

Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium. / To infect their arthropod hosts, Metarhizium anisopliae produces a series of hydrolytic enzymes and several morphological changes, including the formation of structures called appressoria and blastospores. These infective structures represent crucial stages of penetration and dissemination in the insect host, repectively. In addition, the appressorium is a structure conserved among phytopathogenic and entomopathogenic fungi. The emp1 gene (encodes an extracellular matrix protein) from Magnaporthe grisea showed an important role in appressorium differentiation, as well as pathogenicity and virulence. Our goal was evaluate the possible role of an ortholog gene emp1 in M. anisopliae by transcriptional analysis and construction of functional mutants by insertional mutagenesis mediated by agrotransformation. We generated transformants strains containing the gene inactivation cassette of emp1 (pPZP::bar::emp1), which was constructed by subcloning of flanking portions 5’ (1.515bp) and 3’ (1.513bp) fused in a expression cassette of bar gene (resistance to glufosinate ammonium). The frequency of transformation observed in this round was higher than 60%, but only 1,5% of the transformants there is evidence of homologous recombination. We also analysed the transcriptional profile of emp1 under three conditions previously standardized, such as differentiated cells in appressorium, hyphae (vegetative growth) and blastospores. Accordingly, we observed the presence of transcripts of this gene in all growth condition tested. In a second step of this work, we evaluated the transcriptional profile of putative chitinases of the M. anisopliae in those different stages of cellular diferentiation. This class of proteins is directly involved in fungal cell wall remodeling during cellular diferentiation, as well as degradation of chitin in the host cuticle during the penetration stage. Originally we characterized three genes of chitinases (chit1, chi2 and chi3), but apart from these, the in silico analysis of the genome revealed 20 putative chitinases. This diversity may be reponsible for differents functions that the set of chitinases enzymes have in the chitin degradation during the life and infection cycle of the fungus. It is therefore important: (i) validate transcriptionally the putative chitinases and (ii) attemping to assign function to each one of them. Chitinases transcript survey was performed using cDNAs from three cell types: appressorium, vegetative growth and blastospores. In the appressorium condition ten species of transcripts were detected being six from the subgroup A chitinases, three from group B and one from group D. No transcripts of subgroup C chitinases were detected. Both in vegetative growth and blastospores seven species of transcripts of the subgroup A, and one from group D were detected. Chitinases from subgroup B differed - three species of transcripts were detected during vegetative growth and six were detected in blastospores. This study of several putative genes (as emp1 and chitinases) of M. anisopliae, under different approaches, may represent an important preliminary outcome to shed a light in the functions of these genes during life cycle and infection of Metarhizium.

A degradação de quitina é importante para o remodelamento da parede celular em fungos filamentosos e crucial para o rompimento da cutícula de hospedeiros artrópodes durante a infecção de fungos entomopatogênicos. Além disso a quitina é uma importante fonte nutricional. Para que a quitina possa ser eficientemente utilizada, a atividade de b-Nacetilglicosaminidases (NAGases) deve estar presente. Após a ação de quitinases sobre a quitina, gerando dímeros de N-acetilglicosamina (GlcNAc)2, NAGases hidrolisam suas ligações β-1-4 produzindo GlcNAc livre. Fungos filamentosos possuem, em média, 15 a 25 quitinases, mas somente duas NAGases, o que leva a questões sobre a real importância destas enzimas. Em escala genômica, foram identificadas no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae duas NAGases da família GH20 (MaNAG1 e MaNAG2) e duas NAGases da família GH3 (MaNAG3 e MaNAG4) das glicosil hidrolases. Análises filogenéticas sugerem subsequentes duplicações ocorrendo principalmente no clado de MaNAG2, resultando na presença de ortólogos em um amplo espectro de ascomicetos com diferentes estilos de vida. MaNAG1 agrupou majoritariamente com espécies entomopatogênicas. MaNAG3 e MaNAG4 apresentaram alta similaridade de sequências e conservação de domínios com NAGases GH3 de bactérias O perfil transcricional dos genes das NAGases GH20 e GH3 foi avaliado por qPCR, em oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. As NAGases apresentaram perfis de transcrição diferenciais em resposta às diferentes condições, indicando a ausência de um padrão de regulação gênica em comum. Os perfis de expressão variáveis também sugerem que elas não devem possuir funções totalmente redundantes. Ensaios de transcrição relativa mostraram a indução da expressão de MaNAG1, MaNAG2 e MaNAG4 por quitina 1%, enquanto MaNAG3 foi induzida em meio suplementado com GlcNAc 0,25%. As relações evolutivas de MaNAG3 e MaNAG4 e a regulação de suas expressões por substratos quitinosos são a primeira evidência do envolvimento de NAGases GH3 em processos celulares fisiológicos em ascomicetos, apontando para sua potencial relevância na diferenciação celular durante o ciclo de vida de M. anisopliae. Com o objetivo de avançar no estudo funcional das NAGases de M. anisopliae, foram gerados vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de NAGases e linhagens transformantes foram obtidas utilizando-se a metodologia de transformação de fungos mediada por Agrobacterium tumefaciens. / Chitin degradation is important for filamentous fungi cell wall remodeling and, in entomopathogenic fungi, this process is pivotal for breaching the arthropod host cuticles during infection. Chitin is an important nutrient and to be efficiently used, β-Nacetylglucosaminidases (NAGases) activity must be present. After chitinase action on chitin generating N-acetylglucosamine dimers (GlcNAc)2, NAGases hydrolyze theirs β-1-4 linkages producing free GlcNAc. Filamentous fungi have between 15 to 25 chitinases, but only two NAGases; then, questions arise about the actual importance of these enzymes. On a genomic scale, were identified in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae two GH20 NAGases (MaNAG1 and MaNAG2) and two GH3 NAGases (MaNAG3 and MaNAG4) from glycoside hydrolases. Phylogenetic analysis suggested subsequent duplications occurring mainly in MaNAG2 clade, resulting in ortholog clusters in several ascomycetes with a broad range life style. MaNAG1 clusters mostly with entomopathogenic species clades. MaNAG3 and MaNAG4 showed high sequence similarity and domain conservation with bacterial GH3 NAGases Transcriptional profiles of GH20 and GH3 NAGase genes were evaluated by qPCR from eight culture conditions, representing different stages of development and different nutritional states. NAGases showed differential transcript profiles in response to different conditions, indicating an absence of a common gene regulation pattern. The variable expression profiles also suggest they may not have totally redundant roles. Relative transcription assays showed MaNAG1, MaNAG2 and MaNAG4 expression induction by chitin 1%, while MaNAG3 was induced in medium supplemented with GlcNAc 0.25%. Evolutionary relationships of MaNAG3 and MaNAG4 and their expression regulated by chitinous substrates are the first evidence of GH3 NAGases involvement in physiological cell process in entomopathogenic fungi, therefore, pointing to potential relevance on cell differentiation during M. anisopliae life cycle. In order to proceed on functional studies of M. anisopliae NAGases, vectors were constructed to produce knockout mutants for four NAGases genes and transformant strains were obtained by using fungi transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens.

Metarhzium anisopliae é um fungo entomopatogênico que infecta uma variedade de artrópodes. É o entomopatógeno melhor caracterizado, tendo a capacidade de penetrar ativamente através da cutícula de seus hospedeiros. Durante a infecção, Metarhizium produz hidrolases, como proteases, lípases e quitinases que auxiliam na penetração da cutícula de seus hospedeiros e também estão relacionadas ao processo de colonização. Nosso grupo de pesquisa tem se dedicado ao estudo de genes que atuam na etapa de penetração dos hospedeiros, em especial, caracterizando o sistema de degradação da quitina em M. anisopliae. Três genes que codificam quitinases já foram caracterizados em M. anisopliae: o gene chit1, que codifica uma endoquitinase de 42 kDa (BOGO, 1998), o gene chi2 que codifica uma quitinase de 42 kDa e o gene chi3 que codifica uma endo/exo quitinase de 30 kDa (SILVA et al., 2005). Entretanto, apenas a quitinase de 30 kDa foi demonstrada ser produzida durante o processo de penetração. A função dos outros dois genes não foi ainda determinada. O objetivo deste trabalho foi estudar a função do gene chit1 em M. anisopliae por meio da superexpressão da endoquitinase de 42 KDa. Neste, e em trabalhos anteriores do grupo, o gene chit1 foi clonado e caracterizado e sua ORF foi clonada em um vetor de expressão baseado no promotor homólogo do gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006). Em outra construção a ORF chit1 foi clonada na orientação anti-senso no mesmo vetor de expressão. Neste trabalho, a superexpressão, bem como a supressão da expressão pelo anti-senso, foram analisadas em relação à produção da endoquitinase de 42 KDa e as linhagens construídas foram testadas em bioensaios utilizando o carrapato B. microplus, para se verificar sua participação no processo de infecção de carrapatos. Possíveis alterações morfológicas no ciclo normal de desenvolvimento também foram analisadas. Os resultados mostram um aumento na expressão da endoquitinase na construção de superexpressão em relação à linhagem selvagem de M. anisopliae. Em experimentos de bioensaio com carrapatos (Boophilus microplus) não foram observadas diferenças na eficiência de infecção da linhagemdo fungo que superexpressa o gene chit1 nem daquela contendo a construção antisenso, havendo 100% de mortalidade no terceiro dia após a infecção, comparável com a linhagem selvagem. Também não foram detectadas alterações no desenvolvimento, na morfologia e na produção de esporos nas linhagens transformantes em relação à linhagem selvagem do fungo. / M. anisopliae is an entomopathogenic fungi that infects a variety of arthropods. It is the best characterized entomopathogen having the capacity to penetrate actively through host-cuticle. During the infection, Metarhizium produces hidrolases, as proteases, lipases and chitinases that assist the penetration of cuticle of its hosts and also is related to the host-colonization process. Our group has focused the study of genes that act on the penetration stage, in special, characterizing the system of chitin degradation in M. anisopliae. Three genes that codify for chitinases have already been characterized in M. anisopliae: the gene chit1, that codifies an endochitinase of 42 kDa (BOGO, 1998), the gene chi2 that codifies for a chitinase of 42 kDa and the gene chi3 that codifies an endo/exo acting chitinase (SILVA et al., 2005). However, only chitinase 30 kDa was demonstrated to be produced during the penetration process. The function of the other two genes is still not determined. In this work we studied the function of the gene chit1 in Metarhizium by means of overexpression of the chitinase. Here, and in previous work of the group, the gene chit1 was cloned and characterized and its ORF was cloned in a expression vector based on the homologous promoter of the gene tef1-α (ptef1-α, NAKAZATO et al., 2006) . In other construction the chit1 ORF was cloned in the anti-sense orientation in the same vector. The overexpression, as well as the suppression of the expression in the anti-sense, was analyzed in relation to the production of 42 KDa endochitinase and the infectivity of the overexpressing transformants tested in bioassay using tick B. microplus to verify its participation in the process of infection. Possible morphologic alterations in the normal cycle of development had been also analyzed. The results shown an increase in the expression of 42 KDa endochitinase in the transformants in relation to the wild-type M. anisopliae. In bioassay experiments using ticks differences in the efficiency of infection were not observed neither in the overexpressing transformants nor in the anti-sense construct as compared to the wild-type. Also alterations in development, morphology and production of conidia in the transformants were not detected.

As superóxido dismutases são metaloenzimas amplamente distribuídas entre os organismos e desempenham um importante papel na defesa celular contra os danos provocados por espécies reativas de oxigênio mediados pelo radical superóxido, um subproduto do metabolismo oxidativo. As SODs são classificadas em quatro grupos, dependendo de seu cofator metálico, em CuZnSOD; MnSOD, FeSOD e NiSOD. Além de sua função intrínseca, as SODs estão implicadas em outros processos com a adesão e a sinalização celular e na patogenicidade. Em particular, a participação das SODs em processos patogênicos tem se mostrado muito ampla, abrangendo os mais variados sistemas patógeno-hospedeiro. Visando estudar o processo de penetração do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae em carrapatos, as enzimas com atividade SOD foram descritas e parcialmente caracterizadas, apresentando três tipo de atividade: CuZn, Mn e Fe.Para melhor caracterizar as SODs de M. anisopliae, neste trabalho purificamos e caracterizamos a CuZnSOD. A enzima apresenta uma massa presumida em géis desnaturantes de ~20 KDa. A etapa de cromatografia de gel filtração foi substituída, com sucesso, por uma cromatografia de afinidade, apresentando ganho no rendimento total de 92%, em relação ao rendimento final encontrado na purificação utilizando-se resina Sephacel Sephadex G-150. Em relação à amostra inicial (P95%), o fator de purificação foi de 140% maior. Padronizamos um ensaio enzimático de quantificação e discriminação da atividades SODs, que se mostrou adequado e eficaz para a detecção de SODs em extratos celulares brutos e/ou fracionados. Nos ensaios espectrofotométricos, a CuZnSOD purifica de M. anisopliae foi inibida por 2 mM de KCN. Inibição da atividade em presença de 2 mM de peróxido de hidrogênio também foi observada. PMSF (2 mM) e cloreto de mercúrio (5 mM) inibiram a atividade da enzima, indicando que pode estar ocorrendo uma inibição inespecífica através de resíduos de serina e cisteínas não reativos, presente na enzima. A purificação de cada uma das SODs descritas para M. anisopliae, é um passo importante para a elucidação da função destas enzimas durante processo metabólicos e no processo de infecção de M. anisopliae em seus hospedeiros. A produção de anticorpos mono- e policlonais contra estas proteínas,e sua posterior aplicação na determinação da localização celular de cada uma, é um destes passos. Além disso, pode facilitar o isolamento de genes que codificam para as SODs, possibilitando a obtenção de mutantes e/ou linhagens transgênicas e estudos da expressão destas proteínas.

A degradação de quitina é importante para o remodelamento da parede celular em fungos filamentosos e crucial para o rompimento da cutícula de hospedeiros artrópodes durante a infecção de fungos entomopatogênicos. Além disso a quitina é uma importante fonte nutricional. Para que a quitina possa ser eficientemente utilizada, a atividade de b-Nacetilglicosaminidases (NAGases) deve estar presente. Após a ação de quitinases sobre a quitina, gerando dímeros de N-acetilglicosamina (GlcNAc)2, NAGases hidrolisam suas ligações β-1-4 produzindo GlcNAc livre. Fungos filamentosos possuem, em média, 15 a 25 quitinases, mas somente duas NAGases, o que leva a questões sobre a real importância destas enzimas. Em escala genômica, foram identificadas no fungo entomopatogênico Metarhizium anisopliae duas NAGases da família GH20 (MaNAG1 e MaNAG2) e duas NAGases da família GH3 (MaNAG3 e MaNAG4) das glicosil hidrolases. Análises filogenéticas sugerem subsequentes duplicações ocorrendo principalmente no clado de MaNAG2, resultando na presença de ortólogos em um amplo espectro de ascomicetos com diferentes estilos de vida. MaNAG1 agrupou majoritariamente com espécies entomopatogênicas. MaNAG3 e MaNAG4 apresentaram alta similaridade de sequências e conservação de domínios com NAGases GH3 de bactérias O perfil transcricional dos genes das NAGases GH20 e GH3 foi avaliado por qPCR, em oito diferentes condições de cultivo, representando diferentes estágios de desenvolvimento ou diferentes estados nutricionais. As NAGases apresentaram perfis de transcrição diferenciais em resposta às diferentes condições, indicando a ausência de um padrão de regulação gênica em comum. Os perfis de expressão variáveis também sugerem que elas não devem possuir funções totalmente redundantes. Ensaios de transcrição relativa mostraram a indução da expressão de MaNAG1, MaNAG2 e MaNAG4 por quitina 1%, enquanto MaNAG3 foi induzida em meio suplementado com GlcNAc 0,25%. As relações evolutivas de MaNAG3 e MaNAG4 e a regulação de suas expressões por substratos quitinosos são a primeira evidência do envolvimento de NAGases GH3 em processos celulares fisiológicos em ascomicetos, apontando para sua potencial relevância na diferenciação celular durante o ciclo de vida de M. anisopliae. Com o objetivo de avançar no estudo funcional das NAGases de M. anisopliae, foram gerados vetores para a construção de mutantes nulos para os quatro genes de NAGases e linhagens transformantes foram obtidas utilizando-se a metodologia de transformação de fungos mediada por Agrobacterium tumefaciens. / Chitin degradation is important for filamentous fungi cell wall remodeling and, in entomopathogenic fungi, this process is pivotal for breaching the arthropod host cuticles during infection. Chitin is an important nutrient and to be efficiently used, β-Nacetylglucosaminidases (NAGases) activity must be present. After chitinase action on chitin generating N-acetylglucosamine dimers (GlcNAc)2, NAGases hydrolyze theirs β-1-4 linkages producing free GlcNAc. Filamentous fungi have between 15 to 25 chitinases, but only two NAGases; then, questions arise about the actual importance of these enzymes. On a genomic scale, were identified in the entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae two GH20 NAGases (MaNAG1 and MaNAG2) and two GH3 NAGases (MaNAG3 and MaNAG4) from glycoside hydrolases. Phylogenetic analysis suggested subsequent duplications occurring mainly in MaNAG2 clade, resulting in ortholog clusters in several ascomycetes with a broad range life style. MaNAG1 clusters mostly with entomopathogenic species clades. MaNAG3 and MaNAG4 showed high sequence similarity and domain conservation with bacterial GH3 NAGases Transcriptional profiles of GH20 and GH3 NAGase genes were evaluated by qPCR from eight culture conditions, representing different stages of development and different nutritional states. NAGases showed differential transcript profiles in response to different conditions, indicating an absence of a common gene regulation pattern. The variable expression profiles also suggest they may not have totally redundant roles. Relative transcription assays showed MaNAG1, MaNAG2 and MaNAG4 expression induction by chitin 1%, while MaNAG3 was induced in medium supplemented with GlcNAc 0.25%. Evolutionary relationships of MaNAG3 and MaNAG4 and their expression regulated by chitinous substrates are the first evidence of GH3 NAGases involvement in physiological cell process in entomopathogenic fungi, therefore, pointing to potential relevance on cell differentiation during M. anisopliae life cycle. In order to proceed on functional studies of M. anisopliae NAGases, vectors were constructed to produce knockout mutants for four NAGases genes and transformant strains were obtained by using fungi transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens.

Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium. / To infect their arthropod hosts, Metarhizium anisopliae produces a series of hydrolytic enzymes and several morphological changes, including the formation of structures called appressoria and blastospores. These infective structures represent crucial stages of penetration and dissemination in the insect host, repectively. In addition, the appressorium is a structure conserved among phytopathogenic and entomopathogenic fungi. The emp1 gene (encodes an extracellular matrix protein) from Magnaporthe grisea showed an important role in appressorium differentiation, as well as pathogenicity and virulence. Our goal was evaluate the possible role of an ortholog gene emp1 in M. anisopliae by transcriptional analysis and construction of functional mutants by insertional mutagenesis mediated by agrotransformation. We generated transformants strains containing the gene inactivation cassette of emp1 (pPZP::bar::emp1), which was constructed by subcloning of flanking portions 5’ (1.515bp) and 3’ (1.513bp) fused in a expression cassette of bar gene (resistance to glufosinate ammonium). The frequency of transformation observed in this round was higher than 60%, but only 1,5% of the transformants there is evidence of homologous recombination. We also analysed the transcriptional profile of emp1 under three conditions previously standardized, such as differentiated cells in appressorium, hyphae (vegetative growth) and blastospores. Accordingly, we observed the presence of transcripts of this gene in all growth condition tested. In a second step of this work, we evaluated the transcriptional profile of putative chitinases of the M. anisopliae in those different stages of cellular diferentiation. This class of proteins is directly involved in fungal cell wall remodeling during cellular diferentiation, as well as degradation of chitin in the host cuticle during the penetration stage. Originally we characterized three genes of chitinases (chit1, chi2 and chi3), but apart from these, the in silico analysis of the genome revealed 20 putative chitinases. This diversity may be reponsible for differents functions that the set of chitinases enzymes have in the chitin degradation during the life and infection cycle of the fungus. It is therefore important: (i) validate transcriptionally the putative chitinases and (ii) attemping to assign function to each one of them. Chitinases transcript survey was performed using cDNAs from three cell types: appressorium, vegetative growth and blastospores. In the appressorium condition ten species of transcripts were detected being six from the subgroup A chitinases, three from group B and one from group D. No transcripts of subgroup C chitinases were detected. Both in vegetative growth and blastospores seven species of transcripts of the subgroup A, and one from group D were detected. Chitinases from subgroup B differed - three species of transcripts were detected during vegetative growth and six were detected in blastospores. This study of several putative genes (as emp1 and chitinases) of M. anisopliae, under different approaches, may represent an important preliminary outcome to shed a light in the functions of these genes during life cycle and infection of Metarhizium.

As superóxido dismutases são metaloenzimas amplamente distribuídas entre os organismos e desempenham um importante papel na defesa celular contra os danos provocados por espécies reativas de oxigênio mediados pelo radical superóxido, um subproduto do metabolismo oxidativo. As SODs são classificadas em quatro grupos, dependendo de seu cofator metálico, em CuZnSOD; MnSOD, FeSOD e NiSOD. Além de sua função intrínseca, as SODs estão implicadas em outros processos com a adesão e a sinalização celular e na patogenicidade. Em particular, a participação das SODs em processos patogênicos tem se mostrado muito ampla, abrangendo os mais variados sistemas patógeno-hospedeiro. Visando estudar o processo de penetração do fungo filamentoso Metarhizium anisopliae em carrapatos, as enzimas com atividade SOD foram descritas e parcialmente caracterizadas, apresentando três tipo de atividade: CuZn, Mn e Fe.Para melhor caracterizar as SODs de M. anisopliae, neste trabalho purificamos e caracterizamos a CuZnSOD. A enzima apresenta uma massa presumida em géis desnaturantes de ~20 KDa. A etapa de cromatografia de gel filtração foi substituída, com sucesso, por uma cromatografia de afinidade, apresentando ganho no rendimento total de 92%, em relação ao rendimento final encontrado na purificação utilizando-se resina Sephacel Sephadex G-150. Em relação à amostra inicial (P95%), o fator de purificação foi de 140% maior. Padronizamos um ensaio enzimático de quantificação e discriminação da atividades SODs, que se mostrou adequado e eficaz para a detecção de SODs em extratos celulares brutos e/ou fracionados. Nos ensaios espectrofotométricos, a CuZnSOD purifica de M. anisopliae foi inibida por 2 mM de KCN. Inibição da atividade em presença de 2 mM de peróxido de hidrogênio também foi observada. PMSF (2 mM) e cloreto de mercúrio (5 mM) inibiram a atividade da enzima, indicando que pode estar ocorrendo uma inibição inespecífica através de resíduos de serina e cisteínas não reativos, presente na enzima. A purificação de cada uma das SODs descritas para M. anisopliae, é um passo importante para a elucidação da função destas enzimas durante processo metabólicos e no processo de infecção de M. anisopliae em seus hospedeiros. A produção de anticorpos mono- e policlonais contra estas proteínas,e sua posterior aplicação na determinação da localização celular de cada uma, é um destes passos. Além disso, pode facilitar o isolamento de genes que codificam para as SODs, possibilitando a obtenção de mutantes e/ou linhagens transgênicas e estudos da expressão destas proteínas.