Die Ursachen für genetisch bedingte neurologische Entwicklungsstörungen sind sehr vielfältig. Aufgrund der heterogenen und unspezifischen klinischen Präsentation ist eine eindeutige Diagnosestellung durch eine rein klinische Beschreibung selten möglich. Eine frühzeitige und effiziente Diagnosestellung erspart den Betroffenen und auch dem Gesundheitssystem unnötige Untersuchungen und Krankenhausaufenthalte und verbessert die prognostischen und therapeutischen Möglichkeiten. Mit Hilfe der massiven Parallelsequenzierung, der Next-Generation-Sequencing Technologie, sind in den letzten Jahren bereits über tausend krankheitsassoziierte Gene für NDD identifiziert worden. Weltweit werden mittels der Sequenzierung und Auswertung von tausenden Exomen betroffener Menschen große Studien zur Identifizierung neuer valider Kandidatengene durchgeführt. Die Zahl valider Kandidatengene bleibt, im Vergleich zum Aufwand, jedoch hinter den Erwartungen zurück. Am Institut für Humangenetik Leipzig wird daher von jedem Fall einer neurologischen Entwicklungsstörung, soweit Material und Einwilligung der Betroffenen vorhanden sind, ein Trio-Exom sequenziert. Das bedeutet, dass die Exome der Eltern oder der Geschwister mit dem Exom des betroffenen Menschen verglichen werden. Somit ist es möglich, Varianten in bereits bekannten krankheitsassoziierten Genen zu finden und folgend eine genetische Diagnose zu stellen. Wenn in dieser Routinediagnostik keine Diagnosestellung möglich war, analysierte ich die Trio-Exome erneut auf Forschungsbasis, um mögliche, bisher noch nicht bekannte neue Kandidatengene zu finden, welche die Erkrankungen der Betroffenen erklären können. Um die Masse an Kandidatengenvarianten einzugrenzen, eine Vergleichbarkeit von verschiedenen Kandidatengenvarianten zu schaffen und die wissenschaftlichen Ressourcen bestmöglich zu nutzen, entwickelte ich einen Kandidatengenscore zur Priorisierung jeder einzelnen Variante. Dieser Score besteht aus 4 Übergruppen zusammengesetzt aus 12 verschiedenen Parametern, welche die Eigenschaften des konkreten Vererbungsmodus, des einzelnen Gens, der spezifischen Variante und Aspekte der Literaturrecherche widerspiegeln. Aus der untersuchten Kohorte von 198 Betroffenen mit neurologischen Entwicklungsstörungen konnten 63 Fälle in der Routinediagnostik mit einer klaren genetischen Diagnose geklärt und in den restlichen ungeklärten Fällen insgesamt 158 Kandidatengenvarianten identifiziert werden. Allein aus den Top 15% (21 Kandidatengene) der gescorten Kandidatengene, wurden bisher bereits 10 Gene als krankheitsverursachend durch Publikationen validiert. Diese Gene sind TANC2, GLS, ACTL6B, GRIN3B, CUX1, UNC13A, GRIA4, MAPK8IP3, CACNB4 und WDFY3. An den Publikationen von TANC2 und WDFY3 arbeitete ich im Zuge meiner Doktorarbeit aktiv als Co-Autor mit. Als Erstautor und als Grundlage dieser publikationsbasierten Dissertation konnte ich ein neues rezessiv-vererbtes Krankheitsbild ausgelöst durch Varianten im GLS-Gen beschreiben: Im Rahmen der wissenschaftlichen Auswertung der Trio-Exome und während der Entwicklung des Kandidatengenscores fielen zwei Fälle mit gleichem Kandidatengen und ähnlicher klinischer Symptomatik auf. Zwei nicht verwandte Kinder von gesunden Eltern besaßen rezessive Varianten im GLS-Gen, welches das Enzym Glutaminase kodiert. Beide Betroffenen verstarben innerhalb des ersten Lebensmonats an einer sich rasch entwickelnden epileptischen Enzephalopathie. Des Weiteren wurden in beiden Fällen verstorbene Geschwisterkinder beschrieben, welche an vergleichbaren Symptomen kurz nach der Geburt verstarben. Da das Enzym Glutaminase ein wichtiger Bestandteil der Glutamin/Glutamat-Homöostase ist und Glutamat einen wichtigen Neurotransmitter des Menschen darstellt, lag die Vermutung nahe, dass eine Störung des Glutamat-Stoffwechsels zu neurologischen Entwicklungsstörungen führen kann. In Zusammenarbeit mit der niederländischen Arbeitsgruppe um Prof. van Hasselt konnten erhöhte Glutaminkonzentrationen in den Trockenblutkarten des Neugeborenenscreenings der beiden verstorbenen Geschwister einer Familie nachgewiesen werden. Ebenfalls war es möglich, die von jeweils einem Elternteil vererbten compound heterozygoten Varianten in beiden Erbanlagen der verstorbenen Geschwister nachzuweisen und das gemeinsame Auftreten beider Varianten im genetischen Code der gesunden Geschwister auszuschließen. Somit konnte durch die Entwicklung des Kandidatengenscores mit Priorisierung der verschiedenen Kandidatengene und Fokussierung auf die vielversprechendsten Gene mit folgender intensiver wissenschaftlicher Evaluation ein neues autosomal rezessives Krankheitsbild beschrieben werden, welches aufgrund von Varianten im GLS-Gen zu einer neonatalen, tödlich verlaufenden Enzephalopathie führt. Mit Hilfe des Kandidatengenscores ist es gelungen, sich auf die überzeugendsten neuen Kandidatengene zu fokussieren, neue wissenschaftliche Kooperationen zu knüpfen und hierdurch die Liste an validen krankheitsassoziierten Genen, wie zum Beispiel des GLS-Gens, zu erweitern. Der Kandidatengenscore wird weiterhin am Institut für Humangenetik Leipzig erfolgreich eingesetzt.

Deregulierung des RAS/MAPK Signalwegs führen nicht nur zur Krebsentstehung, sondern sind auch mitverantwortlich für Entwicklungsstörungen, dieals Keimbahnmutationen in Schlüsselregulatoren des MAPK Signalwegs zurückzuführen sind, werden aufgrund überlappender Phänotypen unter dem Begriff RASopathien subsumiert. Obwohl die Inzidenz für solide Tumore bei diesen Patienten gering ist, wird ein Zusammenhang zum Auftreten verschiedener Leukämieformen deutlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Mutationen zweier Schlüsselregulatoren des MAPK Signalwegs, PTPN11 und BRAF, hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur neoplastischen Transformation analysiert. Zur Durchführung funktioneller Assays wurden Zelllinien mit lentiviraler Vektoren mit NS-, LS- oder NS und Leukämie-assoziierten SHP2 oder CFC-assoz. BRAF Mutationen (Mut), generiert. Die Testung des neoplastischen Potentials erfolgte anhand nicht-tumorigenen humanen sowie an 208F Ratten-Zelllinie. SHP2/BRAF-Mutationen haben eine spindel-ähnliche Zellmorphologie, Proliferation sowie das Dichte- und Anker-unabhängiges Wachstum in 208F gefördert. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass RASopathie-assoziierte Mutationen zu einem Transformationsphänotyp führen können, ähnlich wie die klassischen Ras Onkogenen. Um zu testen, ob Mut-SHP2 das in vivo Tumorwachstum beeinflusst, wurden SHP2-208F-Zellen in Nacktmäuse injiziert. Eine Förderung des Tumorwachstums konnte sowohl durch mut- als auch durch wt-SHP2 beobachtet werden. RASopathie-assoziierte mutierte Proteine führten auch zu einer moderaten Aktivierung des MAPK-Signalwegs. Eine erhöhte Bindungsstärke zu GAB1 konnte mittels ein TAP-Assay ermittelt werden. Auf transkriptioneller Ebene konnte einer Gensignatur, die sowohl durch RASopathien als auch der klassischen onkogenen BRAF identifiziert werden.Die Ergebnisse dieser Studie können für ein besseres Verständnis der Downstream-liegenden Mechanismen von RASopathie-bezogenen Signalwegen und ihrer Beteiligung an der Tumorprogression beitragen / Deregulation of the Ras/MAPK signaling is implicated in a variety of human diseases, including cancer and developmental disorders. The RASopathies are characterized by an overlapping phenotype in patients and result from germline mutations in key regulators of the MAPK signaling cascade. Although the incidence of solid tumors is rather low, reports on different leukemia forms have increased. In this work, a group of mutations in the genes PTPN11 and BRAF were selected for expression in cell lines for a comprehensive molecular and phenotypic characterization. Non-tumorigenic human cell lines and the rat 208F fibroblasts were transduced with lentiviral particles with SHP2/BRAF wildtype (wt), Noonan (NS)-, NS- and leukemia- or LS–associated SHP2 mutations (mut) and CFC-associated BRAF mutations to identify their potential roles in neoplastic transformation. Mutations in both genes promoted cell morphology alterations, cell proliferation, density- and anchorage-independent growth in rat fibroblasts. These results suggested that RASopathies-associated mutations in both genes confer a transformation phenotype in vitro similar to the classical oncogenes. To investigate whether mutations in SHP2 contribute to tumor growth in vivo, 208F cells expressing wt/mut SHP2 were injected in nude mice. Both wt/mut SHP2 expressing cells promoted tumor growth. Additionally, RASopathies-associated mutant SHP2 and BRAF proteins constitutively activate the MAPK signaling in a moderate manner compared to oncogenic BRAF. To identify modifications in the protein interaction of mut-SHP2, TAP assays were performed. Mut-SHP2 proteins showed an increased binding strength to GAB1 compared to wt. Finally, a microarray analysis revealed a gene cluster commonly regulated in both RASopathies and the oncogenic BRAF. The findings of this work might be useful for a better understanding of the downstream mechanisms of RASopathies-related signaling and their involvement in cancer progression.

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