Aus klinischen Studien ist bereits bekannt, dass die aus der Christrose (Helleborus purpurascens) isolierte makrozyklische Substanz MCS-18 in der Lage ist, eine pathologisch aktivierte Immunreaktion wie die rheumatoide Arthritis zu unterdrücken. In der vorliegenden Arbeit stand die Untersuchung der immunmodulatorischen Wirkung von MCS-18 auf dendritische Zellen (DZ) im Vordergrund. Um eine potente Immunantwort zu induzieren, müssen DZ reifen. Hier konnte in vitro gezeigt werden, dass MCS-18 in der Lage ist, die Expression der typischen Reifungsmarker wie CD80, CD86 und vor allem CD83 zu unterdrücken. Darüber hinaus konnte in vitro eine konzentrationsabhängige Reduktion der DZ- T-Zell - Clusterbildung und eine Blockade der DZ-vermittelten T-Zell Stimulation nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte zusätzlich eine dosisabhängige Reduktion der DZ-unabhängigen, anti-CD3/anti-CD28-vermittelten T-Zell Stimulation gezeigt werden. Ferner konnte eine konzentrationsabhängig reduzierte CCR7 -Expression auf der Oberfläche behandelter DZ und daraus resultierend eine eingeschränkte Migrationsfähigkeit der DZ entlang eines CCL19-Gradienten nachgewiesen werden. In vivo besitzt MCS-18 das Potential, die der EAE (ein Mausmodell der humanen Multiplen Sklerose) assoziierten Paralysesymptome sowohl bei prophylaktischer als auch bei einer realen Verhältnisse am nächsten kommenden therapeutischen Gabe zu reduzieren. Selbst bei der Induktion einer zweiten EAE konnte ein lang anhaltender immunsupprimierender Effekt von MCS-18 festgestellt werden. Am bedeutendsten für eine potentielle spätere therapeutische Anwendung am Menschen ist jedoch die Tatsache, dass MCS-18 auch oral verabreicht wirksam bleibt. Histologisch konnte bei mit MCS-18 behandelten Mäusen eine stark reduzierte Infiltration des Gehirns und Rückenmarks mit CD45+ Leukozyten nachgewiesen werden. Zusammengefasst zeigen sowohl die in vitro als auch die in vivo gewonnenen Daten das große therapeutische Potential von MCS-18 für die Therapie von autoimmunen oder anderen immunbedingten Erkrankungen auf.

Die Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste chronisch-entzündliche Erkrankung des zentralen Nervensystems und die häufigste Ursache erworbener Behinderung im jungen Erwachsenenalter. Histopathologisches Kennzeichen der MS sind fokale Läsionen, die durch Demyelinisierung, Entzündungsinfiltrat, gliale Narbenbildung, Astrozytose, Oligodendrozytenschädigung und unterschiedlich stark ausgeprägte Axondegeneration gekennzeichnet sind. Die Läsionen können im gesamten ZNS auftreten. Bei der Pathogenese der MS geht man von einem multifaktoriellen Geschehen aus. Nach dem derzeitigen Wissenstand ist die MS eine T-Zell-vermittelte Autoimmunerkrankung gegen bestimmte Bestandteile des zentralen Nervensystems, bei der zusätzlich genetische, epidemiologische und Umweltfaktoren eine Rolle spielen. MicroRNAs (miRNAs) haben wichtige Funktionen in der Genregulation und sind in viele physiologische Zellprozesse involviert. Man geht daher davon aus, dass miRNAs auch eine wichtige Rolle in der Pathogenese der MS spielen. Sowohl an MS-Patienten als auch im Tiermodell werden diesbezügliche Untersuchungen durchgeführt. Das wichtigste Tiermodell der MS ist die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE). In der vorliegenden Arbeit wurde die miRNA-Regulation ausgewählter miRNAs in EAE-Läsionen von C57/BL6 Mäusen (MOG35-55-induziert) und Weißbüschelaffen (MOG1-125-induziert) im Gegensatz zu Kontrollgewebe ermittelt und mit der bekannten miRNA-Regulation in aktiven humanen MS-Läsionen verglichen. Aus den EAE-Rückenmarksläsionen der Mäuse und den makrosezierten EAE-Hirnläsionen der Weißbüschelaffen wurde zunächst die RNA extrahiert. Im Anschluss erfolgte die Umschreibung in eine cDNA und dann eine miRNA-Detektion und -Quantifizierung mit Hilfe einer qPCR. Es konnte gezeigt werden, dass die miRNA-Regulation in den EAE-Läsionen von Mäusen und Weißbüschelaffen mit der miRNA-Hoch- und -Herabregulation in den aktiven humanen MS-Läsionen vergleichbar ist. Die im Menschen konservierten und regulierten miRNAs miR-155, miR-142-3p, miRNA-146a, miR-146b und miR-21 waren auch in Maus und Weißbüschelaffe in ähnlicher Weise hochreguliert.

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Aus klinischen Studien ist bereits bekannt, dass die aus der Christrose (Helleborus purpurascens) isolierte makrozyklische Substanz MCS-18 in der Lage ist, eine pathologisch aktivierte Immunreaktion wie die rheumatoide Arthritis zu unterdrücken. In der vorliegenden Arbeit stand die Untersuchung der immunmodulatorischen Wirkung von MCS-18 auf dendritische Zellen (DZ) im Vordergrund. Um eine potente Immunantwort zu induzieren, müssen DZ reifen. Hier konnte in vitro gezeigt werden, dass MCS-18 in der Lage ist, die Expression der typischen Reifungsmarker wie CD80, CD86 und vor allem CD83 zu unterdrücken. Darüber hinaus konnte in vitro eine konzentrationsabhängige Reduktion der DZ- T-Zell - Clusterbildung und eine Blockade der DZ-vermittelten T-Zell Stimulation nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Arbeit konnte zusätzlich eine dosisabhängige Reduktion der DZ-unabhängigen, anti-CD3/anti-CD28-vermittelten T-Zell Stimulation gezeigt werden. Ferner konnte eine konzentrationsabhängig reduzierte CCR7 -Expression auf der Oberfläche behandelter DZ und daraus resultierend eine eingeschränkte Migrationsfähigkeit der DZ entlang eines CCL19-Gradienten nachgewiesen werden. In vivo besitzt MCS-18 das Potential, die der EAE (ein Mausmodell der humanen Multiplen Sklerose) assoziierten Paralysesymptome sowohl bei prophylaktischer als auch bei einer realen Verhältnisse am nächsten kommenden therapeutischen Gabe zu reduzieren. Selbst bei der Induktion einer zweiten EAE konnte ein lang anhaltender immunsupprimierender Effekt von MCS-18 festgestellt werden. Am bedeutendsten für eine potentielle spätere therapeutische Anwendung am Menschen ist jedoch die Tatsache, dass MCS-18 auch oral verabreicht wirksam bleibt. Histologisch konnte bei mit MCS-18 behandelten Mäusen eine stark reduzierte Infiltration des Gehirns und Rückenmarks mit CD45+ Leukozyten nachgewiesen werden. Zusammengefasst zeigen sowohl die in vitro als auch die in vivo gewonnenen Daten das große therapeutische Potential von MCS-18 für die Therapie von autoimmunen oder anderen immunbedingten Erkrankungen auf.

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Das Proteasom ist das zentrale proteolytische System in eukaryontischen Zellen, welches die Mehrzahl der intrazellulären Proteine abbaut. Da viele essentielle Prozesse in der Zelle proteolytisch reguliert werden, besitzt das Proteasom eine außerordentliche biologische Bedeutung. Die Erforschung des Proteasoms im ZNS steht erst am Anfang, dennoch zeigen zahlreiche Untersuchungen, dass Inhibition bzw. Störung des Ubiquitin-Proteasom-Systems mit vielen neurologischen oder neurodegenerativen Erkrankungen einhergeht. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit nach Veränderungen des Proteasoms in Entzündungsprozessen im ZNS am Beispiel der experimentellen autoimmunen Encephalomyelitis (EAE) in der Maus gesucht. Schwerpunkt der Untersuchungen war das Proteasom in Astrozyten. Astrozyten stellen die größte Gruppe unter den Gliazellen dar und besitzen vielfältige Funktionen, zu denen neben klassischen housekeeping Funktionen auch Aufgaben bei der Immunantwort zählen. Der enge und für Neurone essentielle Kontakt prädestiniert Astrozyten, neuronale Erkrankungen mit auszulösen und zu modulieren. In dieser Arbeit wurden in primär isolierten Astrozyten Immunproteasomen (IP) detektiert. Durch Experimente mit der Astrozytenzelllinie TSA-3 konnte gezeigt werden, dass Astrozyten im unstimulierten Zustand nur Standardproteasom besitzen, auf Stimulation jedoch mit der Bildung von IP reagieren. Das Fehlen von IP in Astrozyten unter in vivo Bedingungen deckte sich mit den Strukturanalysen von Proteasomen aus dem Großhirn von Mäusen verschiedener Altersstufen, den mRNA-Expressionsanalysen sowie immunhistologischen Untersuchungen von Hirngewebe aus EAE Mäusen. Die aus dem Großhirn isolierten Proteasomen nach Induktion einer EAE durch Myelin-Oligodendrocyten-Glycoprotein (MOG) enthielten keine IP. Dennoch erfolgt eine Aktivitätsveränderung im Proteasom vor dem Auftreten der ersten EAE Symptome, die in vitro zu einer effizienteren Epitopgenerierung aus einem MOG-Peptid führt. / The proteasome is the central proteolytic system in all eukaryotic cells catalysing the degradation of the majority of intracellular proteins. Since many essential processes are proteolytically controlled, the proteasome is of crucial biological importance. Yet numerous investigations show that many neurological or neurodegenerative diseases go along with inhibition and/or changes of the ubiquitin-proteasome-system. Therefore the present thesis investigates the proteasome system during inflammatory processes in the CNS, namely during experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a widely used animal model for human multiple sclerosis. Main focus of the investigations was the proteasome in astrocytes. Astrocytes embody the largest group of glial cells in the CNS and possess various functions. Apart from classical housekeeping functions astrocytes take part in the immune reaction in the CNS. Their close and essential contact to neurons predestines astrocytes to cause and modulate neural diseases. In the present work immune proteasome subunits were detected in primary astrocytes isolated from newborn mice. On the other hand, when grown under resting conditions the murine astrocyte cell line, TSA-3, contains standard proteasome only, however, when treated with interferon gamma, these cells produce immune proteasomes, too. Subunit analyses of proteasomes isolated from the cerebrum of mice of different age, measurement of the mRNA expression level of proteasome subunits as well as immune-histological investigations of brain tissue from mice confirmed the absence of immune proteasome in astrocytes under in vivo conditions. Proteasomes isolated from mouse brain after induction of EAE by active immunization with myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) did not contain immune subunits. Nevertheless an activity change in the proteasomes isolated from brains before onset of EAE was observed, which lead to a more efficient epitope generation from MOG peptide.

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In der Arbeit wurde die Rolle von Bakterien für das Entstehen von Autoimmunität untersucht. Insbesondere wurde untersucht, inwieweit Bakterien entweder spezifisch (über "Kreuzreaktivität") oder antigenunabhängig (über "Bystander-Aktivierung") eine Aktivierung von autoreaktiven CD4+- T-Zellen induzieren können. Es konnte gezeigt werden, dass es bei dem untersuchten, MBP-spezifischen T-Zellrezeptor multiple, natürlich vorkommende, kreuzreaktive Peptide mikrobiellen Ursprungs gibt, die eine Aktivierung der T-Zellen hervorrufen und in vivo experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) induzieren können. Weiterhin wurde untersucht, inwieweit Lipopolysaccharid (LPS) als unspezifischer Aktivator des Immunsystems eine Aktivierung der autoreaktiven T-Zellen in vitro hervorrufen kann und inwieweit in vivo EAE durch LPS hervorgerufen werden kann. Es wurde gezeigt, dass LPS in vitro einen kleinen Anteil der CD4+ - T-Zellen aktiviert. Wurden den transgenen T+alpha- -Mäusen LPS appliziert, erkrankten diese an EAE. Somit gibt es sowohl in vitro als auch in vivo in den T+alpha- -Mäusen Hinweise für eine Relevanz von "Bystander-Aktivierung". Abschließend wurde diskutiert, inwieweit entweder "Kreuzreaktivität" oder "Bystander-Aktivierung" als Auslöser für Autoimmunität unter physiologischen Bedingungen in Frage kommt. Aufgrund der in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse wurde postuliert, dass keine der beiden Mechanismen alleiniger Auslöser sei, da es aufgrund der Häufigkeit von Infektionen, kreuzreaktiven Peptiden und des Vorkommens von autoreaktiven T-Zellen auch in gesunden Individuen ansonsten sehr viel häufiger zu Autoimmunität kommen müsste. Unter bestimmten Bedingungen könnte die Aktivierung von T-Zellen über Kreuzreaktivität oder über "Bystander-Aktivierung" Autoimmunität auslösen oder verstärken, wenn bereits andere Mechanismen des Immubnsystems, die Autoimmunität verhindern, versagt haben. / In this thesis the role of bacteria for the induction of autoimmunity was investigated. In detail, it was examined whether bacteria are able to activate autoreactive CD4+-T-cells antigen-specific ("cross-reactivity") or antigen-unspecific ("bystander-activation"). It was shown that the examined transgenic MBP-peptide specific T-cell-receptor recognized many natural occurring cross-reactive peptides of microbial origin, which induced an activation of the T-cells in vitro and which could induce autoimmune encephalomyelitis (EAE) in the T-cell-receptor transgenic mice in vivo. Furthermore, it was examined, whether lipopolysaccharide (LPS) as activator of the innate immune system could induce an unspecific activation of the autoreactive T-cells in vitro and whether administration of LPS in the transgenic mice could induce EAE in vivo. It was shown that LPS activates a small percentage of CD4+ - T-cells. Application of LPS to the transgenic T+alpha- mice induced EAE. Therefore, the role of bystander-activation was indicated in vitro and in vivo. Finally, it was discussed, whether either cross-reactivity or bystander-activation could be sufficient for inducing autoimmunity under physiologic conditions. Due to the results presented in this work, it is postulated that none of the both mechanisms could be inductor of autoimmunity alone. If one of these mechanisms was sufficient, autoimmunity in humans should be a frequent event, because infections and autoreactive T cells are both findings which occur in healthy humans very often. However, under certain conditions either cross-reactivity or bystander-activation could trigger or exacerbate autoimmunity, when other mechanisms which inhibit autoimmunity have failed.

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