Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis. / Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.

Submitted by Ricardo Cedraz Duque Moliterno (ricardo.moliterno@uefs.br) on 2015-10-01T23:29:45Z No. of bitstreams: 1 Aspergillus terreus isolamento identifica??o e avalia??o da capacidade catalitica na redu??o de cetonas pr? quirais.pdf: 1820055 bytes, checksum: c5c60d2c4b1c577c84c8b1baaa95660d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-01T23:29:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aspergillus terreus isolamento identifica??o e avalia??o da capacidade catalitica na redu??o de cetonas pr? quirais.pdf: 1820055 bytes, checksum: c5c60d2c4b1c577c84c8b1baaa95660d (MD5) Previous issue date: 2014-09-30 / The object of this inquiry is the isolation, the selection and the potential evaluation of a microorganism with biocatalytic activity in carrying out selective-stereo biorreduction of pro-chial ketones. In the research procedure, Fungi was isolated from soil samples contaminated with lead. Only one of the isolates fungi, identified as Aspergillus terreus, presented good catalytic activity in the reduction of acetophenone. The biomass was grown submerged in broth culture, inoculated with 1,1 x 103 (spores/mL of malt extract) and maintained at 30?C under orbital agitation. Morphological differences and catalytic activity were evaluated in function of the orbit of agitation during the growth process. The catalytic activity in terms of conversion of acetophenone and enantiomeric excess (S), ee_S, in 1-feniletanol, was determinate in conjunction with the growth curve of the fungus. The results were used to construct a graphic showing the variation of quality of the catalyst, according to age of biomass. Apart from acetophenone were tested o-Xacetophenone, p-Xacetophenone and m-Xacetophenone (X = methyl, methoxy, nitro, fluorine, bromine). For reaction with 24 hours growing cells (30?C; 150rpm/r = 50mm), the conversions were between 27% and 97% with ee_S between 41% and 83%. For reactions with cells in suspension in buffered medium (pH = 4.5 ? 6,5) was decrease in activity/selectivity at pH above 5.5. The kinetics of conversion was evaluated for biomasses with different ages and for various concentrations of acetophenone. An amount between 100mg and 200mg of biomass (dry mass) with 168 hours of culture can convert 100mg of acetophenone to 1(S)-feniletanou ee_S (91%) with 98% yield in 72 hours of reaction (93% at 48 hours). The development of this process described above, constitutes the body of this thesis. / O objetivo desta pesquisa ? o isolamento, a sele??o e a avalia??o de um microorganismo com atividade biocatalisadora na biorredu??o estereoseletiva de cetonas pro-quirais. No procedimento de investiga??o, fungos foram isolados de amostras de solo contaminadas com chumbo. Apenas um dos fungos isolados, identificado geneticamente como Aspergillus terreus, apresentou boa atividade catal?tica na redu??o de acetofenona. A biomassa foi cultivada submersa no caldo de cultura, inoculado com 1,1x103 (esporos/mL de extrato de malte) e mantido a 30? sob agita??o orbital. Diferen?as morfol?gicas e de atividade catal?tica foram avaliadas em fun??o da ?rbita de agita??o durante o crescimento. A atividade catal?tica, em termos de convers?o da acetofenona e do excesso enantiom?rico (S), ee_S, no 1-feniletanol, foi determinada em conjunto com a curva de crescimento do fungo. Os resultados foram usados para construir um gr?fico mostrando a varia??o da qualidade do catalisador em fun??o da idade da biomassa. Al?m de acetofenona, foram testadas o-Xacetofenona, p-Xacetofenona e m-Xacetofenona (X=metil, metoxi, nitro, fl?or, bromo). Para 24 horas de rea??o com c?lulas em crescimento (30?C; 150rpm/r = 50mm), as convers?es ficaram entre 94 e 100%, com ee_S ? 98% para acetofenona e para acetofenonas orta ou meta substitu?das. Com substituintes na posi??o para, a convers?o ficou entre 27% e 97%, com ee_S entre 41% e 83%. Para rea??es com c?lulas em suspens?o em meio tamponado (pH = 4,5 ? 6,5), houve queda na atividade/seletividade em pH acima de 5,5. A cin?tica de convers?o foi avaliada para biomassas com idades distintas e para v?rias concentra??es de acetofenona. Uma quantidade entre 100mg e 200mg de biomassa (massa seca) com 168 horas de cultura, pode converter 100mg de acetofenona a 1(S)-feniletanol (ee_S 91%), com 98% de rendimento em 72 horas de rea??o (93% em 48 horas). O desenvolvimento desse processo, acima descrito, constitui o corpo desta Tese.

Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis. / Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.