The correct development of multicellular organisms is tightly regulated by intrinsic and extrinsic factors at specific time points. Disturbance on any level of these multiple processes may result in drastic phenotypes or eventually death of the organism. The midbrain-hindbrain boundary (also termed isthmic organizer) is a region of high interest as well in early as also in later development. The isthmic region carries organizer identity by the expression and subsequent release of FGF8. False patterning events of this region in early developmental stages would therefore display dramatic results over time. As it has been shown that the midbrain-hindbrain boundary (mhb) in the zebrafish is a compartment (or lineage restriction) boundary I tried to understand the underlying molecular mechanism for its correct establishment. In this work I focused both on embryological, molecular and genetic means to characterize involved molecules and mechanisms. In the first part of the thesis I followed in vivo cell transplantation assays, having started with an unbiased one. Cells of either side the mhb were challenged with this boundary by bringing them into direct cell contact with their ectopic counterpart. In a biased approach, cells overexpressing mRNA of specific candidate genes were transplanted and their clonal distribution in host embryos was analyzed. In the second part of the thesis I started interfering with specific candidate genes by transiently knocking down their protein translation. The adhesion molecules of the Eph/ephrin class had been shown to restrict cell mixing and thereby creating compartment boundaries in other tissues, such as the hindbrain, in the zebrafish and other organisms. Additionally, we generated several stable genetic mutant lines in cooperation with the Tilling facility at the Max-Planck-Institute. The only acquired potential null mutant ephrinB2bhu2971 was analyzed and characterized further. I observed that a knock down or knock out of only one of the ephrinB2 ligands does not seem to be sufficient for a loss of compartment boundary formation. The combinatory approach of blocking translation of EphrinB2a in ephrinB2bhu2971 mutants gave very complex and interesting phenotypes, which need to be investigated further.

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The correct development of multicellular organisms is tightly regulated by intrinsic and extrinsic factors at specific time points. Disturbance on any level of these multiple processes may result in drastic phenotypes or eventually death of the organism. The midbrain-hindbrain boundary (also termed isthmic organizer) is a region of high interest as well in early as also in later development. The isthmic region carries organizer identity by the expression and subsequent release of FGF8. False patterning events of this region in early developmental stages would therefore display dramatic results over time. As it has been shown that the midbrain-hindbrain boundary (mhb) in the zebrafish is a compartment (or lineage restriction) boundary I tried to understand the underlying molecular mechanism for its correct establishment. In this work I focused both on embryological, molecular and genetic means to characterize involved molecules and mechanisms. In the first part of the thesis I followed in vivo cell transplantation assays, having started with an unbiased one. Cells of either side the mhb were challenged with this boundary by bringing them into direct cell contact with their ectopic counterpart. In a biased approach, cells overexpressing mRNA of specific candidate genes were transplanted and their clonal distribution in host embryos was analyzed. In the second part of the thesis I started interfering with specific candidate genes by transiently knocking down their protein translation. The adhesion molecules of the Eph/ephrin class had been shown to restrict cell mixing and thereby creating compartment boundaries in other tissues, such as the hindbrain, in the zebrafish and other organisms. Additionally, we generated several stable genetic mutant lines in cooperation with the Tilling facility at the Max-Planck-Institute. The only acquired potential null mutant ephrinB2bhu2971 was analyzed and characterized further. I observed that a knock down or knock out of only one of the ephrinB2 ligands does not seem to be sufficient for a loss of compartment boundary formation. The combinatory approach of blocking translation of EphrinB2a in ephrinB2bhu2971 mutants gave very complex and interesting phenotypes, which need to be investigated further.

EINLEITUNG Das maligne Melanom stellt aufgrund seiner frühen Metastasierung und der Resistenz gegenüber den bisher bekannten Therapieansätzen eine der aggressivsten Tumorentitäten dar. Allerdings handelt es sich beim Melanom um einen antigenen und immunogenen Tumor. Dies schürt die Hoffnung, dass durch das bessere Verständnis der Mechanismen, die der Metastasierung, aber auch der Dysregulation des Immunsystems zugrunde liegen, Rückschlüsse auf neue Therapieansätze, beispielsweise unter Einbeziehung der Immunabwehr, gezogen werden können. Darüber hinaus würde die Entwicklung von Radiotracern, die eine frühzeitige Diagnose und möglicherweise auch die Auswahl von Patienten für eine personalisierte Tumortherapie ermöglichen, die Heilungschancen des malignen Melanoms wesentlich verbessern. Das Eph-Ephrin-System wiederum stellt ein vielfältiges Zellkommunikations-System dar, das sowohl in lebenswichtige als auch in pathologische Prozesse involviert ist. Beispielsweise nehmen Eph-Rezeptoren und Ephrine Einfluss auf die gerichtete Bewegung von neuronalen, endothelialen und inflammatorischen Zellen. Zudem beeinflussen sie die Bewegung von Tumorzellen und tragen so zur Tumorprogression bei. Ausgehend von diesem Hintergrund wurde die Hypothese formuliert, dass die Eph-Ephrin-vermittelte Interaktion von Melanomzellen und Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms beeinflusst. Im Speziellen sollte im Rahmen der vorliegenden Arbeit geprüft werden, ob die Rezeptor-Tyrosinkinase EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert. Darüber hinaus sollte getestet werden, ob der Rezeptor EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, aber über eine mutierte und damit funktionsunfähige Kinasedomäne verfügt, eine regulative Rolle übernimmt und antitumorigen wirkt. Aufbauend auf den Erkenntnissen zur Bedeutung von EphB4, EphB6 und EphrinB2 beim malignen Melanom sollten zudem verschiedene Ansätze zur Bildgebung der oben genannten Eph-Rezeptoren und Ephrine mittels PET etabliert und geprüft werden. ERGEBNISSE UND DISKUSSION Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde erstmalig gezeigt, dass die Membranproteine EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei den ausgewählten humanen Melanomzellen und den inflammatorischen Zellen exprimiert werden und somit potentielle Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen darstellen. Infolge der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen, die als Modell für Tumor-assoziierte Makrophagen dienten, kam es zu einer verminderten Adhäsion und/oder Migration der Melanomzellen sowie im Falle der A375- und A2058-Melanomzellen zu einer verstärkten Sekretion des proinflammatorischen Zytokins IL-6. Aufgrund der breiten Wirkung von IL-6 ergeben sich daraus vielfältige Einflussmöglichkeiten auf das Tumormikromilieu. Diese wurden im Rahmen der vorliegenden Arbeit jedoch nicht näher charakterisiert, da erste Ergebnisse eine Beteiligung des Eph-Ephrin-Systems ausschlossen. Während die Überexpression von EphB6 keinen Einfluss auf die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften der A375-Melanomzellen hatte, führte die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 zu einer verminderten Migration der Zellen im intakten Zellverband. Des Weiteren bewirkte EphB4 eine verstärkte Adhäsion der A375-Zellen an das Extrazellularmatrix-Protein Fibronektin, wodurch die Migration dieser Melanomzellen, im Sinne einer Metastasierung, zusätzlich beeinträchtigt wird. Die erhöhte mRNA-Expression des Liganden EphrinB2 in den A375-Melanomzellen führte zu einer verminderten chemotaktischen Migration der Zellen. Um den Einfluss von EphB4 auf die Tumorprogression und Tumorangiogenese beim malignen Melanom in vivo untersuchen zu können, wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein murines Xenograft-Modell mit subkutanen A375 pIRES- bzw. A375 EphB4-Tumoren etabliert. Die Auswertung der Tumorvolumina sowie der [18F]FDG-, [18F]FMISO- und Hoechst 33342-Anreicherung in den Tumoren ergab, dass die erhöhte EphB4-Proteinbiosynthese zu tendenziell kleineren Tumoren führte. Diese waren zudem signifikant schwächer perfundiert und wiesen im Inneren größere hypoxische Areale auf als die A375 pIRES-Tumoren. Somit zeigte EphB4 neben seiner antimetastasischen Wirkung in vitro auch eine antitumorigene Wirkung in vivo, wobei letztere möglicherweise auf eine Störung der Gefäßbildung zurückzuführen ist. Da eine adäquate Blutversorgung der Tumoren für die Metastasierung von Tumorzellen von Bedeutung ist, könnte dies auch auf eine antimetastatische Wirkung in vivo hinweisen. Des Weiteren wurde im Rahmen der vorliegenden Arbeit ein neuer, 18F-markierter EphB4 Kinaseinhibitor (Verbindung [18F]2) getestet. Dieser zeigte im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell eine geringe Tumoranreicherung, die von der EphB4-Proteinbiosynthese in den Tumoren unabhängig war. Darüber hinaus kam es zur schnellen hepatobiliären Ausscheidung von Verbindung [18F]2, was deren radiopharmazeutischer Anwendung im Wege steht. SCHLUSSFOLGERUNG UND AUSBLICK Insbesondere die erhöhte Proteinbiosynthese von EphB4 hatte im Falle der untersuchten A375-Melanomzellen zu einer verminderten Migration und zu einer erhöhten Adhäsion der Zellen geführt. Somit konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass EphB4 die Metastasierungs-relevanten Eigenschaften dieser Zellen in vitro beeinträchtigt. Darüber hinaus deuteten Untersuchungen am A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell auf eine antitumorigene Wirkung des EphB4-Rezeptors in vivo hin. Aufgrund dessen muss der anfänglich formulierten Hypothese, dass EphB4 im Zusammenspiel mit seinem Liganden EphrinB2 die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms fördert, widersprochen werden. Eine regulative Beteiligung des Kinase-defizienten Rezeptors EphB6, der ebenfalls zur Bindung von EphrinB2 fähig ist, konnte im Rahmen der vorliegenden Arbeit nicht sicher nachgewiesen werden. Allerdings ergeben sich aufgrund der Expression der Rezeptoren EphB4 und EphB6 sowie deren Ligand EphrinB2 sowohl auf den untersuchten Melanomzellen als auch auf den verschiedenen Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen interessante Interaktionsmöglichkeiten dieser Zellen. Deren Einfluss auf die Progression und Metastasierung des malignen Melanoms sollte in weiterführenden Experimenten untersucht werden. Das im Rahmen der vorliegenden Arbeit etablierte A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell ermöglicht die In vivo-Charakterisierung von Radiotracer, die gegen Rezeptor-Tyrosinkinasen im Allgemeinen oder aber selektiv gegen EphB4 gerichtet sind. Da Verbindung [18F]2 eine ungünstige Pharmakokinetik zeigte, was wahrscheinlich auf die hohe Lipophilie des Radiotracers zurückzuführen ist, sollten sich zukünftige Untersuchungen mit der chemischen Modifikation dieser Verbindung beschäftigen, mit dem Ziel die Lipophilie und damit die biologische Halbwertszeit des Radiotracers zu verbessern. Zusätzlich sollte die Entwicklung von Radiotracern auf der Basis von löslichen Eph-Rezeptoren und Ephrinen (sEph bzw. sEphrin) weiter vorangetrieben werden.:1 EINLEITUNG 1.1 Die Bedeutung des Tumor-Mikromilieus bei der Entstehung des malignen Melanoms 1.2 Die Metastasierung des malignen Melanoms als limitierender Einflussfaktor auf die Tumortherapie 1.3 Die Rolle des Eph-Ephrin-Systems bei der Tumorprogression und Metastasierung 1.4 Zielstellung 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Material 2.1.1 Eukaryotische Zellen 2.1.2 Prokaryotische Zellen 2.1.3 Versuchstiere 2.1.4 Plasmide 2.1.5 Kits 2.1.6 Antikörper 2.1.7 Verbrauchsmaterialien 2.1.8 Chemikalien, Medien und Enzyme 2.1.9 Puffer und Lösungen 2.1.10 Geräte 2.2 Molekularbiologische Methoden 2.2.1 RNA-Isolierung aus Zellen 2.2.2 DNase-Behandlung 2.2.3 Quantitative Echtzeit RT-PCR (qRT-PCR) 2.2.4 Klonierung von humanem EphB4, EphB6 und EphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pIRES2-AcGFP1 2.2.4.1 Prinzip 2.2.4.2 Restriktionshydrolyse 2.2.4.3 Dephosphorylierung und Glättung der cDNA mittels Alkalischer Phosphatase und Klenow-Fragment 2.2.4.4 Agarose-Gelelektrophorese 2.2.4.5 Gelextraktion 2.2.4.6 Ligation 2.2.4.7 Herstellung Transformations-kompetenter E. coli 2.2.4.8 Transformation kompetenter E. coli 2.2.4.9 Plasmid-Isolierung 2.2.5 Klonierung von humanem sEphB4, sEphB6 und sEphrinB2 in den eukaryotischen Expressionsvektor pSecTag2B 2.2.5.1 Prinzip 2.2.5.2 PCR zur Gewinnung der cDNA für sEphrinB2, sEphB4 und sEphB6 2.2.5.3 Agarose-Gelelektrophorese und Gelextraktion 2.2.5.4 TOPO-TA-Klonierung, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.2.5.5 Restriktionshydrolyse, Ligation, Transformation und Plasmid-Isolierung 2.3 Zellbiologische Methoden 2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen 2.3.2 Kontrolle von Zellkulturen auf Mykoplasmen-Kontamination 2.3.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen 2.3.4 Transfektion und Antibiotikaselektion von COS-7-Zellen 2.3.5 Transfektion und Antibiotika-Selektion von A375-Zellen 2.3.6 Fluoreszenz-aktivierte Zellanalyse und -sortierung (FACS) von transfizierten A375-Zellen 2.3.7 Fluoreszenzmikroskopie von transfizierten A375-Zellen 2.3.8 Bestimmung der Zellproliferation und Zellvitalität mittels Wachstumskurve 2.3.9 Differenzierung humaner THP-1-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen Zellen (THP-1(M)) 2.3.10 Differenzierung humaner HL-60-Leukämiezellen zu Makrophagen-artigen (HL-60(M)) und Granulozyten-artigen (HL-60(G)) Zellen 2.3.11 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) und anschließende Trennung mittels Magnet-aktivierter Zell Separierung (MACS) 2.3.12 Adhäsionsassay 2.3.12.1 Adhäsion an Fibronektin 2.3.12.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 2.3.13 Migrationsassay 2.3.13.1 Boyden-Kammer-Assay 2.3.13.2 Wundheilungsassay 2.4 Proteinbiochemische Methoden 2.4.1 Proteinisolierung aus Zellkulturen 2.4.2 Proteinisolierung aus Gewebeproben 2.4.3 Proteinbestimmung 2.4.4 SDS-PAGE 2.4.5 Western Blotting und Immundetektion 2.4.6 Enzym-gekoppelter Immunadsorptionsassay (ELISA) 2.4.6.1 IL-6-ELISA 2.4.6.2 pEphB4-ELISA 2.4.7 Gewinnung und Reinigung der rekombinanten, löslichen Eph Rezeptoren sEphB4 und sEphB6 2.4.7.1 Gewinnung von COS-7-Zellkulturüberständen 2.4.7.2 Reinigung von sEphB4 und sEphB6 aus den COS-7-Zellkulturüberständen mittels Ni2+-Affinitätschromatographie 2.4.7.3 Regeneration der Ni2+-NTA-Agarose 2.4.7.4 Entfernung von Salzen und Imidazol mittels Schneller Protein-Flüssigkeitschromatographie (FPLC) 2.4.7.5 Entfernung von Salzen und Imidazol mit Hilfe von Zentrifugalkonzentratoren 2.4.7.6 Gefriertrocknung 2.5 Tierexperimentelle Arbeiten 2.5.1 Etablierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 2.5.2 Fluoreszenz-Bildgebung 2.5.3 Magnet-Resonanz-Tomographie 2.5.4 Untersuchung der Tumorperfusion mittels Hoechst 33342 2.6 Radiochemische und Radiopharmakologische Methoden 2.6.1 Darstellung und Radiomarkierung von EphB4-Kinaseinhibitoren 2.6.2 Untersuchung des Einflusses der Verbindungen 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität mittels MTT-Test 2.6.3 Untersuchung der zellulären Bindung und Aufnahme der Verbindung [18F]2 2.6.4 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 2.6.5 Bioverteilung 2.6.6 Metabolitenanalyse 2.6.7 Autoradiographie 2.7 Histologische Methoden 2.7.1 Anfertigung von Gefrierschnitten 2.7.2 Nachweis von Hoechst 33342 in Gefrierschnitten 2.7.3 Anfertigung von Paraffinschnitten 2.7.4 Nachweis von EphB4 in Paraffinschnitten 2.8 Statistische Auswertung 3 ERGEBNISSE 3.1 Genexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.2 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.3 Kokultivierung humaner Melanomzellen mit HL-60(M) 3.3.1 Etablierung eines Kokultur-Modells mit anschließender Trennung der humanen Melanomzellen von den HL 60(M)-Zellen 3.3.2 Einfluss der Kokultur auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der humanen Melanomzellen 3.3.2.1 Adhäsionsassay 3.3.2.2 Migrationsassay 3.3.3 Einfluss der Kokultur auf die Sekretion von Interleukin-6 durch die humanen Leukämie- und Melanomzellen 3.4 Überexpression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei A375 Melanomzellen 3.4.1 Fluoreszenzmikroskopie und FACS 3.4.2 mRNA-Expression von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.3 Proteinbiosynthese von EphB4, EphB6 und EphrinB2 3.4.4 Proliferationsverhalten 3.5 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten von A375-Melanomzellen 3.5.1 Einfluss auf die Adhäsion 3.5.1.1 Adhäsion an Fibronektin 3.5.1.2 Adhäsion an HL-60(M)-Zellen 3.5.2 Einfluss auf die Migration 3.5.2.1 Boyden-Kammer-Assay 3.5.2.2 Wundheilungsassay 3.5.3 Einfluss der Kokultur mit HL-60(M)-Zellen auf das Adhäsions- und Migrationsverhalten der A375-Melanomzellen 3.6 Einfluss von EphB4, EphB6 und EphrinB2 auf das inflammatorische Potential von A375-Melanomzellen und HL 60(M)-Zellen 3.7 Charakterisierung eines murinen Tumor-Xenograft-Modells mit subkutanen A375-pIRES/EphB4-Tumoren 3.7.1 Charakterisierung des Tumorwachstums 3.7.2 Nachweis der EphB4-Proteinbiosynthese 3.7.3 Charakterisierung des Tumormetabolismus und der Tumorperfusion mit [18F]FDG 3.7.4 Charakterisierung der Tumorperfusion mit Hoechst 33342 3.7.5 Charakterisierung der CD31-Proteinbiosynthese 3.7.6 Charakterisierung hypoxischer Areale mit [18F]FMISO 3.8 Charakterisierung eines neuen, 18F-radiomarkierten EphB4-Kinaseinhibitors als Radiotracer zur Bildgebung von EphB4 mittels Kleintier-PET 3.8.1 Einfluss von Verbindung 2 auf die Zellproliferation und Zellvitalität 3.8.2 Einfluss von Verbindung 2 auf die EphB4-Phosphorylierung 3.8.3 Charakterisierung der Zellaufnahme von Verbindung [18F]2 3.8.4 Charakterisierung des In-vivo-Metabolismus von Verbindung [18F]2 im A375-pIRES/EphB4-Tumor-Xenograft-Modell 3.8.4.1 Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographie 3.8.4.2 Autoradiographie 3.8.4.3 Bioverteilung 3.8.4.4 Metabolitenanalyse 3.9 Reinigung und Charakterisierung rekombinanter, löslicher Eph-Rezeptoren 3.9.1 Proteinbiosynthese und Sekretion von sEphB4 und sEphB6 3.9.2 Reinigung von rekombinantem sEphB4 und sEphB6 aus COS-7-Zellkulturüberständen 4 DISKUSSION 4.1 Therapiemöglichkeiten und Bedeutung von Tumor-assoziierten inflammatorischen Zellen beim malignen Melanom 4.2 Vorkommen von EphB4, EphB6 und EphrinB2 bei humanen Melanomzellen und inflammatorischen Zellen 4.3 Einfluss der Kokultur von Melanomzellen mit HL-60(M) auf die metastatischen und inflammatorischen Eigenschaften der Zellen 4.4 Einfluss von EphB4 auf das Wachstum und die Vaskularisierung von A375-Tumoren in vivo 4.5 Kinaseinhibitoren als potentielle Radiotracer für die In vivo-Bildgebung von Eph-Rezeptoren 4.6 Entwicklung löslicher Eph-Rezeptoren und Ephrin-Liganden als Grundlage für die In vivo-Bildgebung des Eph-Ephrin-Systems 5 SCHLUSSFOLGERUNGEN UND AUSBLICK 6 ZUSAMMENFASSUNG 7 LITERATURVERZEICHNIS 8 DANKSAGUNG 9 VERÖFFENTLICHUNGEN UND KONFERENZBEITRÄGE

Die Eph-Familie, welche die Eph-Rezeptoren und die ephrin-Liganden umfasst, repräsentiert die größte Subgruppe der Rezeptortyrosinkinasen. Sowohl die Eph-Rezeptoren als auch die ephrin-Liganden sind Membran-assoziierte Proteine, deren Interaktion einen Typ der Zellkontakt-vermittelten Kommunikation darstellt und vielfältigste zelluläre Funktionen beeinflusst. Die aktuellen Eph/ephrin-bezogenen Forschungsschwerpunkte liegen vor allem im Bereich der Entwicklungs- und Tumorbiologie, wie z.B. dem Einfluss der Eph-Familie auf Angiogenese und Axonaussprossung. Die Rolle des Eph/ephrin-Systems in der Entwicklung der Atherosklerose und bei Reparaturmechanismen wie der Reendothelialisierung ist jedoch noch weitgehend unerforscht. Die vorliegende Arbeit befasst sich anhand von in vitro Experimenten mit HUVEC und HUAEC mit dem Einfluss des Liganden ephrin-A1 und des Rezeptors EphA2 auf die endotheliale Proliferation und Migration als elementare Mechanismen der Reendothelialisierung.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX TABELLENVERZEICHNIS XI 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1 1.2 Die Migration von Endothelzellen 6 1.3 Die Eph-Familie 9 1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 16 2 MATERIAL 17 2.1 Geräte 17 2.2 Zellkulturmaterial 18 2.3 Verwendete Kulturmedien 18 2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19 2.5 Verwendete Kit-Systeme 19 2.6 Verwendete Oligonukleotide 20 2.7 Verwendete Plasmide 21 2.8 Konstruierte Plasmide 23 2.9 Chemikalien 23 2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23 3 METHODEN 24 3.1 Zellbiologische Methoden 24 3.2 Proteinbiochemische Methoden 28 3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32 3.4 Scratch Assay 44 3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44 3.6 Wundheilungsassay 45 3.7 Migrationsassay 48 3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49 3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49 4 ERGEBNISSE 50 4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50 4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56 4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58 4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63 4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65 4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67 4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68 4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69 4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73 4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75 4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78 4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80 4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81 5 DISKUSSION 84 5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84 5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86 5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90 5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93 5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106 6 ZUSAMMENFASSUNG 109 6.1 In deutscher Sprache 109 6.2 In englischer Sprache 111 7 LITERATURVERZEICHNIS 113 8 DANKSAGUNG 133 9 ANHANG 134 10 ERKLÄRUNGEN 138 10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138 10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140 / The Eph-family represents the largest subgroup of tyrosine kinase receptors. Both the Eph-receptors and the ephrin-ligands are membrane-associated proteins whose interaction is a way of contact-dependent communication that influences a wide variety of cellular functions. In scientific research the Eph-family is known for its impact on developmental and tumour-biology, whereas the role of Eph-receptors and ephrin-ligands in atherosclerosis and repair mechanisms is still not well understood. The aim of the present study was to examine the influence of the ligand ephrin-A1 and its interaction with its receptor EphA2 on endothelial proliferation and migration by performing cellcultural experimentation using HUVEC and HUAEC.:INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS IX TABELLENVERZEICHNIS XI 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die Rolle des Endothels in der Atherosklerose 1 1.2 Die Migration von Endothelzellen 6 1.3 Die Eph-Familie 9 1.4 Potentielle Funktionen der Eph-Familie in der endothelialen Proliferation und Migration 14 1.5 Zielstellung der Arbeit 16 2 MATERIAL 17 2.1 Geräte 17 2.2 Zellkulturmaterial 18 2.3 Verwendete Kulturmedien 18 2.4 Verwendete Zelllinien und E. coli Stämme 19 2.5 Verwendete Kit-Systeme 19 2.6 Verwendete Oligonukleotide 20 2.7 Verwendete Plasmide 21 2.8 Konstruierte Plasmide 23 2.9 Chemikalien 23 2.10 Puffer, Gele, Lösungen 23 3 METHODEN 24 3.1 Zellbiologische Methoden 24 3.2 Proteinbiochemische Methoden 28 3.3 Molekularbiologische und gentechnische Methoden 32 3.4 Scratch Assay 44 3.5 Beurteilung der Zellproliferation mittels BrdU-Inkorporation 44 3.6 Wundheilungsassay 45 3.7 Migrationsassay 48 3.8 Baculovirale Talin-RFP- und Aktin-GFP-Expression 49 3.9 Datenanalyse und statistische Auswertung 49 4 ERGEBNISSE 50 4.1 Molekularbiologische und proteinbiochemische Charakterisierung verschiedener Eph/ephrine in proliferierenden Endothelzellen 50 4.2 Molekularbiologische Charakterisierung von ephrin-A1, EphA2 und EphA4 unter Kontaktinhibition in HUVEC 56 4.3 Einfluss eines Zellzyklusarrests auf die Expression verschiedener ephrin-Liganden und Eph-Rezeptoren in Endothelzellen 58 4.4 Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 mittels siRNA 63 4.5 Einfluss einer siRNA-vermittelten Hemmung von ephrin-A1 und EphA2 auf die Proliferation von HUVEC 65 4.6 Überexpression von ephrin-A1 mittels eines adenoviralen Vektors 67 4.7 Einfluss einer Überexpression von ephrin-A1 auf die Proliferation von HUVEC 68 4.8 Reinitiation von Proliferation und Migration in HUVEC mittels Scratch Assay 69 4.9 Einfluss der Modulation des ephrin-A1- sowie EphA2-Gehaltes auf das Wundheilungsverhalten von HUVEC 73 4.10 Charakterisierung des Migrationsverhaltens von HUVEC unter veränderter ephrin-A1-Expression mittels live cell imaging 75 4.11 Einfluss einer veränderten ephrin-A1-Expression auf den EphA2-Phosphorylierungsstatus 78 4.12 Grenzzonenverhalten von HUVEC an ephrin-A1-beschichteten Oberflächen 80 4.13 Fluoreszenzmikroskopische Charakterisierung fokaler Adhäsionen und des Aktin-Zytoskelettes unter modulierter ephrin A1 Expression 81 5 DISKUSSION 84 5.1 Die Eph-Familie im Kontext der Reendothelialisierung 84 5.2 Einfluss des Eph/ephrin Systems auf das Proliferationsverhalten von Zellen 86 5.3 Auswirkungen einer ephrin-A1-EphA2-Wechselwirkung auf die Proliferation 90 5.4 Einfluss der Eph-Familie auf die zelluläre Migration und Wundheilung 93 5.5 Zusammenfassende Betrachtung und Ausblick 106 6 ZUSAMMENFASSUNG 109 6.1 In deutscher Sprache 109 6.2 In englischer Sprache 111 7 LITERATURVERZEICHNIS 113 8 DANKSAGUNG 133 9 ANHANG 134 10 ERKLÄRUNGEN 138 10.1 Erklärungen zur Eröffnung des Promotionsverfahrens 138 10.2 Erklärung über die Einhaltung der aktuellen gesetzlichen Vorgaben im Rahmen der Dissertation 140

Membrane attachment of ephrin ligands plays an important role in Eph receptor activation. Membrane anchorage is thought to provide a clustering effect to ephrins that is necessary for stimulation of Eph receptor kinase activity. The presence of soluble A-type ephrin in conditioned media of numerous cultured cancer cell lines and normal endothelial cells prompted me to question the purpose of ephrin release. In this thesis I show that ephrin A1, a potent angiogenic factor, is released from several cancer cell lines and is a substrate for tissue transglutaminase, a multifunctional enzyme with the ability to form covalent crosslinks between substrate proteins. I show that tissue transglutaminase crosslinking primes soluble ephrin A1 to promote Eph A2 activity. These results suggest a role for soluble A-type ephrins in promoting Eph receptor activity at distant sites and also indicate that ephrin A1 may be acting as a soluble angiogenic factor during tumor neovascularization.

Diss. (sammanfattning) Stockholm : Karol. inst., 2003. / Härtill 4 uppsatser.

Thesis (Ph.D.) -- University of Texas Southwestern Medical Center at Dallas, 2005. / Campus access only. Vita. Bibliography: 70-76..

Membrane attachment of ephrin ligands plays an important role in Eph receptor activation. Membrane anchorage is thought to provide a clustering effect to ephrins that is necessary for stimulation of Eph receptor kinase activity. The presence of soluble A-type ephrin in conditioned media of numerous cultured cancer cell lines and normal endothelial cells prompted me to question the purpose of ephrin release. In this thesis I show that ephrin A1, a potent angiogenic factor, is released from several cancer cell lines and is a substrate for tissue transglutaminase, a multifunctional enzyme with the ability to form covalent crosslinks between substrate proteins. I show that tissue transglutaminase crosslinking primes soluble ephrin A1 to promote Eph A2 activity. These results suggest a role for soluble A-type ephrins in promoting Eph receptor activity at distant sites and also indicate that ephrin A1 may be acting as a soluble angiogenic factor during tumor neovascularization.

京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第18169号 / 医博第3889号 / 新制||医||1003(附属図書館) / 31027 / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 渡邉 大, 教授 大森 治紀, 教授 髙橋 良輔 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DGAM