Ubiquitin C-terminal hydrolase L1 (UCHL1) is a multifunctional protein primarily expressed in neuronal cells and involved in numerous cellular processes. UCHL1 has been linked with neurodegenerative diseases and a wide range of cancers but its specific role remains unknown. Previous UCHL1 knockdown studies have shown that UCHL1 controls the expression of pro- and anti-apoptotic genes as well as genes involved in cell cycle regulation but it is unknown how UCHL1 regulates these genes. We have shown that UCHL1 is cross-linked to DNA in DU145 but not in LNCaP or PC3 prostate cancer cells. Therefore, we hypothesized that UCHL1 regulates the expression of pro- or anti-apoptotic genes as well as the genes involved in the cell cycle through its interaction with DNA. By utilizing ChIP and ChIP-seq analyses it is possible to determine the UCHL1 target sequences on the genomic DNA. It was shown that UCHL1 is only expressed in DU145 but not in LNCaP, PC3 or C4-2 prostate cancer cell lines. Additionally, UCHL1 is expressed and cross-linked to DNA in HEK293T cells. It is believed that UCHL1 is silenced by upstream promoter methylation when it is not expressed. However, treatment with the epigenetic drugs 5-aza-2′-deoxycytidine and trichostatin A (TSA) did not result in induction of UCHL1 expression in LNCaP, PC3 or C4-2 prostate cancer cell lines. UCHL1 is also associated with p53. However, ChIP assay results have shown that UCHL1 and p53 do not bind to genomic DNA of upstream promoter regions CDKN1A and BAX genes. Additionally, through UCHL1 ChIP-seq analyses in DU145 and HEK293T cells, we discovered that UCHL1 co-localizes to the DNA with the shelterin complex shedding light on a new role of UCHL1 that has never been described before. / October 2014

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 μπορεί να ενεργοποιηθεί φαρμακολογικά σε καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού και μελετήθηκε ο μοριακός μηχανισμός της ενεργοποίησης. Το cDNA της ανθρώπινης καλλικρεΐνης 6 αρχικά κλωνοποιήθηκε με την τεχνική της διαφορικής παράθεσης των mRNAs βάσει της υπερέκφρασης σε πρωτοπαθή όγκο μαστού σε σχέση με την πλήρη αποσιώπηση στην μετάστασή του στον πνεύμονα, καθώς και στις περισσότερες μεταστατικές καρκινικές σειρές μαστού και δείγματα ιστών. Λόγω της καταστολής της έκφρασής της σε μεταστατικούς όγκους του μαστού, θεωρήθηκε ότι η κωδικοποιούμενη πρωτεΐνη (hK6)-μια νέα σερινοπρωτεάση- θα μπορούσε να έχει ογκοκατασταλτική δράση. Πρόσφατα δεδομένα δείχθουν ότι η hK6 αντιπροσωπεύει έναν νέο μοριακό δείκτη του καρκίνου, αφού αυξημένες συγκεντρώσεις της στον ορό είναι διαγνωστικές για τον καρκίνο των ωοθηκών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρακολούθηση της θεραπευτικής αγωγής. Οι φυσιολογικές λειτουργίες της hK6 δεν έχουν βρεθεί. Πρόσφατα, αλλαγές στην έκφραση του γονιδίου KLK6 έχουν συσχετιστεί με την παθογένεση των πιο κοινών νευροεκφυλιστικών νόσων, όπως Alzheimer’s και Parkinson’s. Σημαντικό, είναι το γεγονός της αποικοδόμησης της μυελίνης από την hK6, που πιστοποιεί την συμμετοχή της στην σκλήρυνση κατά πλάκας. Για τους παραπάνω λόγους η hK6, καθώς και το γονίδιο KLK6 αποτελούν ένα σημαντικό θεραπευτικό στόχο. Στην παρούσα εργασία, δείχθηκε ότι οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν την μεταγραφή καθώς και την ιστο-εξειδικευμένη έκφραση του γονιδίου KLK6 περιλαμβάνουν την δραστικότητα δύο υποκινητών. Επίσης κλωνοποιήθηκαν νέες ισομορφές του γονιδίου που προκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα και αντιστοιχούν στο 10-20% των KLK6 mRNAs. Προηγούμενη έρευνα δεν είχε παρατηρήσει εκτεταμένες γονιδιωματικές αλλαγές σε καρκινικούς όγκους στην γενετικό τόπο 19q13.4 που εδρεύει το γονίδιο KLK6, και σε συνδυασμό με την πιθανή ογκοκατασταλτική δράση της hK6, διερευνήθηκε η συμμετοχή επιγενετικών μηχανισμών στην αποσιώπηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6. Κατεργασία των καρκινικών κυτταρικών σειρών μαστού T47D και MDA-MB-231 με το απομεθυλιωτικό αντιδραστήριο 5-αζα-2΄-δεοξυκυτιδίνη επανενεργοποίησε την έκφραση του γονιδίου KLK6. Η τριχοστατίνη Α, αναστολέας των αποακετυλασών των ιστονών, επανενεργοποίησε την έκφραση KLK6 μόνο στα MDA-MB-231 κύτταρα. Επίσης, βρήκαμε ότι η καταστολή της έκφρασης KLK6 στις καρκινικές κυτταρικές σειρές μαστού συνδέεται με την μεθυλίωση συγκεκριμένων δινουκλεοτιδικών αλληλουχιών CpGs που βρίσκονται στον εγγύς υποκινητή του γονιδίου και σε θέσεις πρόσδεσης του μεταγραφικού παράγοντα Sp1. Η αποσιώπηση της έκφρασης λαμβάνει χώρα με την πρόσδεση του εξαρτώμενου από μεθυλίωση μεταγραφικού καταστολέα MeCP2 και την δημιουργία ετεροχρωματινικής δομής λόγω αποακετυλίωσης των ιστονών. Επειδή η επιγενετική αποσιώπηση του γονιδίου KLK6 υποδηλώνει ογκοκατασταλτικό ρόλο στον καρκίνο του μαστού, διαμολύνθηκε σταθερά το KLK6 cDNA στην μεταστική σειρά MDA-MB-231 με σκοπό τη διαπίστωση του πιθανού αυτού ρόλου. Τα σταθερά διαμολυσμένα κύτταρα που προέκυψαν, είχαν μικρότερο ρυθμό πολλαπλασιασμού, ενώ δεν μπορούσαν να σχηματίσουν αποικίες σε μαλακό άγαρ. Συμπερασματικά στην παρούσα διατριβή δείχθηκε ότι το γονίδιο KLK6 αποτελεί πιθανό ογκοκατασταλτικό γονίδιο, που αποσιωπάται σε καρκινικές σειρές μαστού μέσω μεθυλίωσης του γονιδιωματικού DNA, καθώς και δημιουργίας ετεροχρωματινικής δομής στον εγγύς υποκινητή του. Η φαρμακολογική ενεργοποίηση της έκφρασης του γονιδίου KLK6 μέσω επιγενετικών φαρμάκων, είναι πιθανό να ανοίξει νέους δρόμους για την αντιμετώπιση του καρκίνου του μαστού. / In the present thesis it was shown that the human kallikrein 6 gene is pharmacologically modulated in breast cancer cell lines and the molecular mechanism accounting for the modulation was analyzed. The cDNA encoding human kallikrein 6 (protease M) was originally cloned by mRNA differential display as being over expressed in a primary breast tumor but completely inactivated in its lung metastasis, and in the majority of metastatic breast cancer cell lines and tissue specimens. Based on this expression pattern, it was suggested that the encoded protein (hK6)-a novel serine protease-could play a suppressor role in cancer progression. Recent evidence suggests that hK6 represents a novel cancer biomarker, since elevated serum concentrations of hK6 are diagnostic of ovarian cancer and can be exploited for monitoring therapeutic response to treatment. The physiological function(s) of hK6 have not been elucidated. Recently, aberrant expression of the KLK6 gene has been implicated in the pathogenesis of most common neurodegenerative disorders, such as Alzheimer’s and Parkinson’s disease. In addition, hK6 is involved in enhanced proteolysis of myelin basic protein associated with multiple sclerosis. Therefore, hK6 and KLK6 gene, represent potential therapeutic targets for pharmacological intervention. In the present study, we have shown that the mechanisms regulating KLK6 transcription and tissue-specific expression involve the action of two different promoters. Also, new KLK6 splice variants were cloned, and shown to account for 10-20% of all KLK6 mRNA species. Previous study had shown no gross genomic alterations in tumor speciments in the KLK6 genomic locus 19q13.4, and in accordance with putative tumor suppressor activity the involvement of epigenetic mechanisms in KLK6 gene silencing in breast cancer was studied. Treatment of KLK6-negative T47D and MDA-MB-231 human breast cancer cell lines with the demethylating agent 5-aza-2\\\\\\\\

Dans la première partie du travail, nous avons étudié l’expression génique dans les cancers thyroïdiens survenus après l’explosion de la centrale nucléaire de Tchernobyl. L’incidence des cancers thyroïdiens papillaires a fortement augmenté après l’accident de Tchernobyl chez les enfants, offrant l’opportunité exceptionnelle d’étudier les caractéristiques moléculaires des cancers thyroïdiens radioinduits. Contrairement aux études précédentes qui comportaient toutes des facteurs confondants, nous avons pu investiguer l’expression des ARN messagers des tumeurs et de leurs tissus contra-latéraux normaux de patients exposés et de patients non exposés aux retombées radioactives, en utilisant une cohorte de patients appariés pour l’âge et l’ethnicité. L’irradiation d’une population conduit au développement de cancers dans une fraction de cette population. Les individus atteints peuvent l’avoir été de manière stochastique, ou à cause d’une prédisposition ou sensibilité particulière à l’irradiation. La comparaison des tumeurs exposées et non exposées permet d’étudier l’effet de l’irradiation, et celle des tissus normaux contralatéraux offre la possibilité d’étudier la susceptibilité aux radiations dont les implications sont nombreuses en médecine (radio-diagnostic, cancers secondaires) et en radioprotection. L’expression génomique complète a été analysée sur puces Affymetrix pour les tissus de 45 patients. Vingt-deux de ces patients ont été exposés aux retombées de Tchernobyl, vingt-trois autres, appariés selon l'âge et résidant dans les mêmes régions de l'Ukraine, n'ont pas été exposés à l’irradiation. Notre travail a mis en évidence l’existence d’une signature transcriptionnelle permettant de différencier les tissus normaux exposés des non exposés, les gènes qui composent cette signature ayant trait à la prolifération ;nos résultats suggèrent qu’un niveau plus élevé de prolifération dans les tissus normaux pourrait être associé aux cancers radioinduits, soit en tant que facteur prédisposant au cancer, soit en tant que conséquence de la radiation.<p><p>La deuxième partie du travail a été consacrée à la caractérisation in vitro de différentes lignées cellulaires humaines de cancers thyroïdiens. Ces lignées sont souvent employées comme modèles pour l’étude et le développement d’approches thérapeutiques pour ces cancers mais notre laboratoire a démontré que ces lignées s’étaient dédifférenciées au cours de leur propagation in vitro et que leurs profils transcriptionnels se rapprochaient essentiellement des tumeurs les plus dédifférenciées, les cancers anaplasiques. Nous avons tenté de ré-induire dans ces lignées l’expression des marqueurs de différenciation de la thyroïde au moyen d’agents épigénétiques, l’idée étant que ces gènes dont l’expression est caractéristique de la thyroïde ne s’expriment plus suite à l’action de mécanismes épigénétiques comme la méthylation au niveau de leurs promoteurs. Les cancers thyroïdiens dédifférenciés étant les plus agressifs et ayant perdu l’expression des facteurs de différenciation dont le transporteur sodium/iodure (NIS), ils sont inaccessibles au traitement par l’iode radioactif I131. La réexpression des marqueurs de différenciation thyroïdienne permettrait d’une part d’employer plus adéquatement les lignées comme modèle d’étude des cancers différenciés, et d’autre part d’envisager l’emploi de(s) substances(s) qui ont permis cette réexpression en tant que médicaments pour les cancers dédifférenciés. Nos travaux montrent que les traitements épigénétiques des lignées cancéreuses ne permettent pas une réinduction significative de la différenciation mais tendent à démontrer que l’inactivation épigénétique provoque dans ces lignées la perte de l’expression de gènes n’ayant aucun rôle utile pour la cellule au cours des milliers de réplications in vitro / In the first part of the work, we studied gene expression in thyroid cancers following the explosion of the Chernobyl nuclear power plant. The incidence of thyroid papillary cancers rose sharply after the Chernobyl accident in children, providing an exceptional opportunity to study the molecular characteristics of radiation-induced thyroid cancers. Unlike previous studies that included confounding factors, we were able to investigate the expression of messenger RNA from tumors and their normal contra-lateral tissue of patients exposed and not exposed to the fallout using a cohort of patients matched for age and ethnicity. The irradiation of a population leads to the development of cancer in a fraction of the population. Affected individuals may have been stochastically, or because of a particular predisposition or susceptibility to irradiation. Comparison of tumors exposed and unexposed allows to study the effect of irradiation, and the contra-lateral normal tissue offers the possibility to study the susceptibility to radiation whose implications are numerous: medical (radio - diagnosis, secondary cancers ) and radiation protection. The complete gene expression was analyzed on Affymetrix for tissues of 45 patients. Twenty- two of these patients were exposed to fallout from Chernobyl, twenty-three, matched for age and residing in the same regions of Ukraine have not been exposed to radiation. Our work has demonstrated the existence of a transcriptional signature allowing to differentiate exposed and unexposed normal tissues, and the genes that compose the signature are related to proliferation; our results suggest that a higher level of proliferation in normal tissues may be associated with radiation-induced cancers, either as a predisposing factor for cancer,or as a result of the radiation.<p><p>The second part was devoted to the in vitro characterization of different human cell lines of thyroid cancer. These lines are often used as models for the study and development of therapeutic approaches for these cancers, but our laboratory has demonstrated that these cell lines dedifferentiated during their in vitro propagation and their transcriptional profiles are essentially closer to the most dedifferentiated tumors, the anaplastic cancers. We tried to re- induce in these lines the expression of differentiation markers of thyroid using epigenetic agents, the idea being that these genes whose expression is characteristic of thyroid are no longer expressed due to epigenetic mechanisms such as methylation of their promoters. Dedifferentiated thyroid cancers are more aggressive and have lost the expression of differentiation factors including sodium/iodide transporter(NIS), they are inaccessible to treatment with radioactive iodine I131. Re-expression of thyroid differentiation markers could allow in one hand to use more adequately cell lines as models to study differentiated cancers, and secondly to consider the used substances that helped this re-expression as drugs for the dedifferentiated cancers. Our work shows that epigenetic treatments for cancer cell lines do not allow a significant re-induction of differentiation but tend to demonstrate that the epigenetic inactivation in these cell lines causes the loss of expression of genes that have no useful role in the cells over thousands of replication in vitro .<p><p> / Doctorat en Sciences biomédicales et pharmaceutiques / info:eu-repo/semantics/nonPublished