Au cours des dernières années, un nouveau mécanisme du développement tumoral a été décrit;<br />l'hyperméthylation des gènes suppresseurs de tumeur (GST). Les modifications « épigénétiques » ont été peu étudiées dans les cancers de l'enfant et aucune grande série de tumeurs pédiatriques existait avant 2002. Nous avons recherché ce type altérations dans deux groupes de tumeurs de l'enfant: les ependymomes et les neuroblastomes. Les ependymomes (EP) représentent la troisième tumeur la plus fréquente du système nerveux central (SNC) de l'enfant et n'a pas de marqueurs biologiques pronostiques identifiés. Le neuroblastome, quant à lui, est la tumeur solide extra crânienne la plus fréquente chez l'enfant et présente des anomalies génétiques et moléculaires qui ont été clairement liées au pronostic. Nos objectifs étaient de décrire un profil de méthylation de ces deux cancers de l'enfant et chercher des relations possibles avec l'évolution clinique. Dans la première étude, une série de 27 enfants avec un EP intracrânien et 7 avec papillome du plexus choroïde a été étudiée. Nous avons décrit et comparé le statut de méthylation de 19 gènes. Dans la deuxième étude, 62 neuroblastomes (NB) ont été évalués pour le statut de la méthylation de ces gènes. Nous n'avons pas trouvé de relation statistiquement significative entre la méthylation et l'évolution clinique, mais les méthylations ne semblent pas être distribuées sous une forme aléatoire dans les EP et les NB et peut représenter un mécanisme de développement et d'évolution tumorale. L'hyperméthylation a été corrélée au stade clinique des NB: stades 1, 2 et 4s étaient moins fréquemment méthylés que les stades 3 et 4 (p = 0.002). En conclusion, les résultats de nos séries indiquent que la méthylation des gènes suppresseurs peut avoir un rôle dans l'évolution et le développement des cancers de l'enfant.<br />L'étude des altérations épigénétiques est nécessaire pour améliorer la comprehension des mécanismes de la carcinogenèse dans les tumeurs pédiatriques. Ces altérations pourraient, donc, être utilisées comme des marqueurs de maladies ou d'évolutivité et les gènes méthylés pourraient être considérés comme des nouvelles cibles thérapeutiques.

La mucoviscidose (CF) est causée par des mutations sur le gène CFTR codant pour une protéine indispensable au maintien de l'homéostasie des transports hydro-électrolytiques au sein de l'épithélium des organes cibles de la pathologie, dérivés de l'endoderme (poumon, pancréas, appareil reproducteur). Entre ces différents tissus et au cours du développement fœtal, l'expression du gène varie, particulièrement dans le tissu pulmonaire où une répression est observée à l'âge adulte.Ce travail propose dans une première partie la caractérisation des modifications épigénétiques associées à la régulation spatio-temporelle physiologique de l'expression du gène CFTR dans les tissus humains sains adultes et fœtaux. Les résultats obtenus soulignent le rôle important des modifications post-traductionnelles des histones dans la régulation in vivo. Nous avons notamment observé i) un équilibre fin entre marques d'ouverture (acétylation) et de fermeture (H3K27Me3) de la chromatine sur la région promotrice du gène CFTR et ii) l'acétylation significative de régions cis-régulatrices intragéniques.La deuxième partie de ce travail consiste en l'évaluation des effets du SAHA, un inhibiteur d'histones déacétylases (HDACi) dans un modèle ex vivo d'épithélium nasal de patients atteints de mucoviscidose. Les résultats montrent que le SAHA ne restaure pas l'adressage membranaire de la protéine CFTR en contexte pathologique mucoviscidose (mutation p.(Phe508del)) dans des cellules CF différenciées en épithélium ex vivo. De plus, le SAHA induit une modification du profil inflammatoire des épithélia et une dé-différenciation épithéliale dans le modèle ex vivo montrant que les mécanismes d'action de cette molécule sont multiples et réversibles.Ce travail souligne la nécessité d'analyser in vivo les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la mucoviscidose et d'évaluer l'impact des molécules thérapeutiques sur les protéines endogènes dans un modèle d'épithélium différencié. / Cystic fibrosis (CF) is caused by mutations in the CFTR gene encoding for a protein essential to maintain the homeostasis of fluid and electrolyte transport in the epithelium of endoderm-derived organs (lung, pancreas, reproductive tract) that are affected in CF patients. CFTR expression greatly varies between these tissues and during fetal development, particularly in the lung where repression is observed in adulthood .In the first part of this work, we characterized epigenetic modifications associated with the spatio-temporal regulation of CFTR gene expression in healthy human adult and fetal tissues. Our results emphasize the important role of histone post-translational modifications in this regulation in vivo. Specifically, we observed i) a fine balance between active (acetylation) and repressive (H3K27Me3) marks in the promoter region and ii) significant acetylation in intragenic cis-regulatory regions.In the second part of this work, we evaluated the effects of SAHA, a histone deacetylase inhibitor (HDACi) in an ex vivo model of nasal epithelium of CF patients. Our results show that SAHA can not restore CFTR protein to the apical membrane in a p.(Phe508del)-CFTR context in ex vivo CF differentiated epithelial cells. In addition, SAHA induces a change in the inflammatory profile of epithelia and epithelial dedifferentiation in the ex vivo model showing that the mechanisms of action of this molecule are multiple and reversible.This work highlights the need to analyze in vivo the pathophysiological mechanisms involved in Cystic Fibrosis and to evaluate the impact of therapeutic molecules on the endogenous proteins in a differentiated epithelium model.

Il apparait de nos jours évident que les cancers ne peuvent se réduire uniquement à des aberrations génétiques, et qu'un nouveau paramètre est à prendre en considération, l'épigénétique. Au cours de ma thèse je me suis efforcé de caractériser la protéine fusion BRD4-NUT. Cette protéine résulte d'une translocation t(15;19) observée dans les carcinomes de la ligne médiane (NMC), extrêmement agressifs et létaux. La protéine BRD4 possède un double bromodomaine capable de s'associer à la chromatine acétylée, et recrute divers facteurs sur la chromatine. NUT est une protéine de fonction inconnue exprimée exclusivement au cours de la spermatogenèse. J'ai pu démontrer que la protéine fusion BRD4-NUT était suffisante pour induire la tumorigenèse, par un mécanisme de séquestration de la proteine histone acétyltransférase (HAT) CBP/p300. NUT interagit avec CBP/p300 et suractive son activité d'acétylation, créant des foci hyperacétylés de chromatine. BRD4-NUT empêche ainsi CBP/p300 d'aller co-activer la transcription de nombreux gènes, et bloque notamment la réponse apoptotique p53-dépendante. Une inhibition de BRD4-NUT – par siRNA, mutation des bromodomaines ou dérégulation de l'acétylation des foci par des inhibiteurs des histones déacétylases (HDAC) – réenclenche la voie d'apoptose et la mort de ces cellules tumorales. Cette étude est un exemple précis de l'impact qu'une dérégulation épigénétique peut avoir sur l'homéostasie cellulaire et son mécanisme d'induction de la tumorigenèse. Je me suis également interessé à caracteriser la protéine NUT lors de son contexte physiologique, la spermatogenèse, ou lors de son expression illégitime dans des lignées tumorales sans fusion avec BRD4. La protéine NUT est exprimée au niveau des stades de maturation des cellules germinales spermatides, et pourrait participer au remodelage du génome et à l'établissement de l'épigénome final du spermatozoïde. Nut semble également conférer un avantage prolifératif lors de son expression anormale dans au moins trois lignées cellulaires, U2OS, A549 et A7R5. Ainsi, la protéine NUT, seule ou fusionnée avec BRD4, est un facteur Cancer/Testiculaire capable d'influer négativement sur l'homéostasie des cellules somatiques dans lesquelles ses fonctions, normalement restreintes à la spermatogenèse, participent à la tumorigenèse.

Les protéines du groupe Polycomb sont des régulateurs épigénétiques impliqués dans divers processus développementaux et cellulaires. Le complexe Polycomb Répressif 1 (PRC1) est bien caractérisé chez les animaux, cependant sa composition et sa fonction restent énigmatiques dans les plantes. Sur base d'homologie de séquences trois homologues de la sous-unité de base BMI1 du complexe PRC1 animal ont été identifiés dans Arabidopsis: AtBMI1a, AtBMI1b et AtBMI1c. L'interaction de ces trois protéines avec les composantes PRC1 connues (i.e. AtRING1ab, et LHP1) a été démontrée. Des analyses génétiques et moléculaires ont permis d'attribuer aux protéines AtBMI1ab et AtRING1ab un rôle essentiel dans la répression des caractères embryonnaire lors de la croissance végétative. Un nouvel interactant d'AtRING1a, une protéine à domaine PHD de la famille AL (Alfine-Like) a été identifiée dans criblage d'une banque de ADNc. Par différentes techniques l'association entre les protéines de la famille AL et les membres de bases du complexe PRC1 (i.e. AtBMI1ab, AtRING1ab et LHP1) a été démontrée. Les protéines AL sont nucléaires et se lient in vitro à H3k4me3, une marque active de la chromatine. Des analyses génétiques ont révélé que les protéines AL et AtBMI1ab régulent la germination en réprimant l'expression de gènes impliqués dans le développement de la graine. Au niveau chromatinien, les protéines PRC1 interviennent dans la transition d'une chromatine active, marquée par du H3K4me3 vers une chromatine répressive enrichie en H3K27me3. Nous proposons que les protéines AL reconnaissent la marque active et recrutent la fonction répressive des protéines à domaine RING du complexe PRC1 afin d'induire la répression transcriptionelle. / Polycomb group (PcG) proteins are critical epigenetic repressors implicated in various developmental and cellular processes. While the Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) is evolutionary conserved and its functions extensively studied in Arabidopsis, the PRC1 complex composition and function remain still enigmatic in plants. Our work focuses on several Arabidopsis RING-domain proteins to unravel PRC1-like functions in the regulation of various processes during plant development. Based on sequence similarity we identified three homologues of the animal PRC1 core subunit BMI1: AtBMI1a, AtBMI1b and AtBMI1c. These proteins were found to interact with other PRC1-like components, AtRING1a, AtRING1b and LHP1. Genetic and molecular analyses demonstrated that AtBMI1a/b and AtRING1a/b play crucial roles in stable repression of embryonic traits to allow proper somatic growth. Comparative transcriptome analyses were performed to uncover genetic networks underlying seedling growth and the flower development defects of several different PRC1-like and PRC2 Arabidopsis mutants. Our data revealed overlapping and non-overlapping gene categories of misregulated genes in Atring1a/b, Atbmi1a/b and lhp1 mutants. The Atring1a/b mutant showed particular disturbed expression of flower developmental genes. Accordingly, phenotypic and molecular analyses of the mutant flowers confirmed that AtRING1a/b play a critical role in cell fate determination and in different aspects of flower development. To better understand the broad function of AtRING1a/b, we performed yeast two-hybrid screen and identified PHD-domain proteins of the ALFIN-LIKE (AL) family as binding partners. In vitro AL proteins bind the active mark for gene transcription, H3K4me3. By various methods, both in vitro and in planta, we provided strong evidence for the physical interaction between AL and PRC1 RING-domain proteins. We uncovered that al6/7 similar to Atbmi1a/b mutants exhibit seed germination defects, which are associated with the derepression of several seed related genes. Consistently on the corresponding chromatin a delay of the remodeling from active H3K4me3 labeled to a repressive H3K27me3 marked chromatin could be detected. We propose that through binding to H3K4me3 AL6/7 function as scaffold proteins to target PRC1 RING-domain proteins to active chromatin in order to establish gene silencing. Taken together, the presented work contributes significantly to the knowledge of PRC1 complex(es) in Arabidopsis at both biological function and complex composition levels. It opens several exciting perspectives for future research in the field.

La spermatogénèse, processus de production des gamètes mâles, représente un modèle physiologique pertinent pour l’étude de la dynamique de la chromatine. En effet, une réorganisation drastique du génome est observée en fin de spermatogénèse, lors des étapes post-méiotiques du développement de la lignée germinale mâle. Ces réorganisations visent d’une part à compacter le génome afin de le protéger avant et lors de la fécondation et d’autre part à établir un épigénome mâle spécifique nécessaire pour le développement embryonnaire précoce. La chromatine organisée en nucléosomes est alors totalement remaniée de manière à ce que les protamines remplacent les histones dans les spermatozoïdes. Cette réorganisation est initiée par une vague d’acétylation des histones à l’échelle du génome, suivie par un remplacement massif des histones par de petites protéines basiques, les protéines de transition et les protamines. Les mécanismes moléculaires responsables de cette réorganisation de la chromatine sont très mal connus. Mon travail de thèse vise à explorer ces mécanismes en utilisant une approche d’invalidation de gènes chez la souris correspondant à des acteurs épigénétiques exprimés spécifiquement en post-méiose : le facteur nucléaire Nut (Nuclear protein in Testis) et le variant de l’histone H2A, H2A.L.2. Nous avons démontré que la protéine Nut recrute l’acétyltransferase p300 et induit l’hyperacétylation de l’histone H4 précisément au niveau des résidus lysines en position 5 et 8. Cette acétylation est nécessaire à l’interaction avec le premier bromodomaine de Brdt initiant le processus de remplacement des histones par les protamines. Ainsi, le facteur Nut est l’élément majeur de la vague d’acétylation des histones. Nous avons également mis en évidence le rôle crucial de H2A.L.2 dans “ l’ouverture ” de la structure du nucléosome permettant ainsi son invasion par les protéines de transition. Ces protéines vont à leur tour générer une plateforme pour le recrutement et la maturation des protamines et induire la formation de structures transitoires avant l’étape de compaction finale du génome des spermatozoïdes matures. Ces études nous ont ainsi permis d’établir pour la première fois un modèle moléculaire cohérent permettant de comprendre la programmation épigénétique post-méiotique du génome mâle et son impact sur la fertilité masculine. / Spermatogenesis, the process of producing male gametes, represents a relevant physiological model for the study of chromatin dynamics. Indeed, a drastic reorganization of the genome is observed at the end of spermatogenesis, during post-meiotic stages of the development of the male germ cells. These reorganizations are intended both to compact the genome to protect it before and during fertilization and to establish a specific male epigenome necessary for early embryonic development. In spermatozoa, during these post-meiotic stages, chromatin is completely reorganized so that the protamines replace the histones. This reorganization is initiated by a wave of genome-wide histone acetylation, followed by massive replacement of histones by small basic proteins, transition proteins and protamines. The molecular mechanisms responsible for this reorganization of the genome remain very poorly known today. My thesis aims to explore these mechanisms by using gene inactivation in mouse of epigenetic actors specifically expressed in post-meiotic germ cells : the nuclear factor Nut (Nuclear protein in Testis) and the histone H2A variant, H2A.L.2. We have demonstrated that the Nut protein interacts and stimulates the p300 acetyltransferase activity and induces the hyperacetylation of histone H4 precisely on the lysine residues at 5 and 8 positions. This acetylation is necessary for the interaction with the first bromodomain of Brdt initiating the process of histone replacement by protamines. Thus, the Nut factor is the main element of the histone acetylation wave. We have also deciphered the crucial role of H2A.L.2 in the “opening ” of nucleosomal structures in post-meiotic germ cells thus allowing its invasion by the transition proteins. These transition proteins will in turn generate a platform for the recruitment and maturation of protamines and induce the formation of transient structures before the final compaction of the mature sperm genome. These studies allowed us to establish for the first time a coherent molecular model for understanding the post-meiotic epigenetic programming of the male genome and its impact on male fertility.

Titre du projet: Recherche de marqueurs moléculaires précoces de l’anomalie florale mantled du palmier à huile Objectifs : - identifier des marqueurs d’expression de la variation somaclonale mantled par comparaison entre les transcriptomes conformes et variants.- valider la capacité de discrimination des marqueurs sélectionnés lors des stades précoces du processus in vitro. Stratégie et Méthode: Analyse transcriptomique de l’inflorescence normale de palmier à huile et construction d’un transcriptome de référence. Technique : RNAseq, séquençage Illumina.Identification des séquences et voies de régulation d’intérêt. Technique: analyse bioinformatique des données de séquençage.Comparaison entre les trancriptomes issus d’inflorescences normales vs. mantled par re-séquençage de banques obtenues ) partir de différents génotypes clonaux. Technique : Illumina.Identification des séquences présentant de manière cohérente des profils d’expression dépendant du phénotype. Technique : analyse bioinformatique des données de séquençage, analyse statistique des profils d’expression. Validation des marqueurs candidats sur des paires de régénérants normal/mantled issus de lignées clonales variées, ainsi que sur des cultures in vitro à différents stades du processus de régénération. Technique : PCR quantitative (q-PCR). / Project title : Search for early molecular markers of the mantled floral variation of oil palmObjectives : - identifying expression markers of the mantled somaclonal variation through the comparison between the true-to-type and the variant transcriptome. - assessing the discriminating power of the selected markers at early stages of the in vitro process.Strategy and Methods : Transcriptomic analysis of the normal oil palm inflorescence, construction of a reference transcriptome. Technique : RNAseq, Illumina sequencing.Identification of sequences and pathways of interest. Technique : bioinformatic analysis of sequencing data.Comparison between the normal and the mantled inflorescence transcriptome through the re-sequencing of libraries generated from several different clonal lines. Technique : Illumina. Identification of sequences displaying consistently a phenotype-dependent differential expression pattern. Technique : bioinformatic analysis of sequencing data, statistical analysis of expression patterns. Validation of candidate markers on normal/mantled regenerant palm pairs from different clonal lines and on normal-/mantled-derived in vitro cultures at various stages of the industrial regeneration process. Technique : quantitative PCR (q-PCR).