Chaque spermatozoïde transmet non seulement le génome paternel, mais également une information épigénétique, portée par l'organisation structurale du génome, ou épigénome. Malgré son importance lors du développement embryonnaire, peu de données décrivent l'épigénome transmis par le gamète mâle. Ce travail étudie la reprogrammation de l'épigénome lors de la différenciation post-méiotique des cellules germinales males, ou spermiogenèse. Ce processus implique une restructuration globale de la chromatine caractérisée par l'enlèvement de la majorité des histones, associées à l'ADN dans les cellules somatiques, et leur remplacement par des protéines nucléaires spécifiques du gamète male. <br />Ce travail met en évidence dans les cellules post-méiotiques, un dialogue original entre les modifications post-traductionnelles des histones et la présence de nouveaux variants d'histones associés à l'hétérochromatine péricentrique. La reprogrammation épigénétique des régions de contrôle de l'empreinte parentale a également été analysée. De plus, de nouvelles fonctions ont été mises en évidence pour plusieurs protéines chaperones, notamment HSP70.2, Npm3 et NAP1L4, qui seraient impliquées dans l'incorporation de variants d'histones ou de protéines basiques spécifiques lors des étapes tardives de la spermiogenèse.<br />Ainsi, l'action coordonnée de plusieurs voies de réorganisation de la chromatine participe à la mise en place de l'épigénome transmis par les spermatozoïdes.

FOXL2 constitue un gène majeur de la différenciation et de la fonction ovarienne. Chez l’Homme, l’haploinsuffisance de ce gène induit des malformations palpébrales qui peuvent être associées ou non à une insuffisance ovarienne prématurée (BPES de type I ou II). Dans certains cas, des anomalies de l’expression de FOXL2 sont liées à des délétions de régions situées très en amont du gène, témoignant de la présence d’activateurs distaux. L’existence de cette régulation à longue distance a aussi été mise en évidence dans l’espèce caprine par notre équipe. La mutation naturelle PIS (Polled Intersex Syndrome) induit à l’état homozygote l’absence d’expression du gène FOXL2 dans les gonades XX, conduisant au développement de testicules à la place d’ovaires. Ainsi, au cours de mon doctorat j’ai été amenée à travailler sur deux aspects différents : (i) l’analyse des cibles/voies activées par FOXL2 dans la gonade, et (ii) l’étude de la régulation à distance de l’expression de FOXL2.En ce qui concerne le premier point, l’analyse du rôle d’un gène candidat, Dmxl2, chez la souris a nécessité la mise en place d’une invalidation conditionnelle de ce gène (Knock-out ou KO) dans les gonades (le KO total étant létal à la naissance). Chez les mâles, une diminution de 60% de la production de spermatozoïdes a été observée à la puberté pendant la première vague de spermatogénèse.En ce qui concerne le second point, l’étude d’une région régulatrice potentielle de l’expression de FOXL2 a permis de définir des éléments très conservés présentant un profil épigénétique caractéristique de régions de type « enhancers ». J’ai ensuite établi un modèle in vitro « d’édition de l’épigénome » du locus FOXL2, en utilisant la technologie CRISPR/dCas9-p300 pour modifier la marque épigénétique H3K27ac et activer l’expression de ce gène. A long terme, ces travaux pourraient aboutir à la création de « médicaments épigénétiques » pour soutenir l’expression de FOXL2 et rétablir la fertilité des patientes atteintes d’une mutation de ce gène. / FOXL2 is a major gene for ovarian differentiation and functions. In humans, FOXL2 haploinsufficiency induces eyelid malformations with or without premature ovarian failure (BPES type I or II). In some cases, abnormalities of FOXL2 expression are related to deletions of regions located far upstream of this gene, indicating the presence of distal activators. The existence of this long-range regulation has also been demonstrated in the goat species by our laboratory. The natural mutation PIS (Polled Intersex Syndrome) when homozygous induces the silencing of FOXL2 expression in XX gonads, leading to the development of testes instead of ovaries. Thus, during my PhD, I worked on two different aspects: (i) the analysis of FOXL2-activated targets/pathways in the gonad, and (ii) the study of the long-range regulation of FOXL2 expression.Regarding the first point, gene function analysis of the candidate gene Dmx12 required the establishment of a conditional knock-out in the mouse gonad (Dmxl2 total KO is lethal at birth). In males, a 60% decrease in sperm production was observed at puberty during the first wave of spermatogenesis.Regarding the second point, the study of a putative regulatory region of FOXL2 expression allowed to define highly conserved elements harbouring typical enhancer epigenetic profile. Then, I established an in vitro model of FOXL2 locus “epigenome editing”, using the CRISPR/dCas9-p300 technology to modify the epigenetic mark H3K27ac. In the long term, this work may lead to the development of "epigenetic drugs" to support the expression of FOXL2 and restore the fertility of patients with a mutation of this gene.

La spermatogénèse, processus de production des gamètes mâles, représente un modèle physiologique pertinent pour l’étude de la dynamique de la chromatine. En effet, une réorganisation drastique du génome est observée en fin de spermatogénèse, lors des étapes post-méiotiques du développement de la lignée germinale mâle. Ces réorganisations visent d’une part à compacter le génome afin de le protéger avant et lors de la fécondation et d’autre part à établir un épigénome mâle spécifique nécessaire pour le développement embryonnaire précoce. La chromatine organisée en nucléosomes est alors totalement remaniée de manière à ce que les protamines remplacent les histones dans les spermatozoïdes. Cette réorganisation est initiée par une vague d’acétylation des histones à l’échelle du génome, suivie par un remplacement massif des histones par de petites protéines basiques, les protéines de transition et les protamines. Les mécanismes moléculaires responsables de cette réorganisation de la chromatine sont très mal connus. Mon travail de thèse vise à explorer ces mécanismes en utilisant une approche d’invalidation de gènes chez la souris correspondant à des acteurs épigénétiques exprimés spécifiquement en post-méiose : le facteur nucléaire Nut (Nuclear protein in Testis) et le variant de l’histone H2A, H2A.L.2. Nous avons démontré que la protéine Nut recrute l’acétyltransferase p300 et induit l’hyperacétylation de l’histone H4 précisément au niveau des résidus lysines en position 5 et 8. Cette acétylation est nécessaire à l’interaction avec le premier bromodomaine de Brdt initiant le processus de remplacement des histones par les protamines. Ainsi, le facteur Nut est l’élément majeur de la vague d’acétylation des histones. Nous avons également mis en évidence le rôle crucial de H2A.L.2 dans “ l’ouverture ” de la structure du nucléosome permettant ainsi son invasion par les protéines de transition. Ces protéines vont à leur tour générer une plateforme pour le recrutement et la maturation des protamines et induire la formation de structures transitoires avant l’étape de compaction finale du génome des spermatozoïdes matures. Ces études nous ont ainsi permis d’établir pour la première fois un modèle moléculaire cohérent permettant de comprendre la programmation épigénétique post-méiotique du génome mâle et son impact sur la fertilité masculine. / Spermatogenesis, the process of producing male gametes, represents a relevant physiological model for the study of chromatin dynamics. Indeed, a drastic reorganization of the genome is observed at the end of spermatogenesis, during post-meiotic stages of the development of the male germ cells. These reorganizations are intended both to compact the genome to protect it before and during fertilization and to establish a specific male epigenome necessary for early embryonic development. In spermatozoa, during these post-meiotic stages, chromatin is completely reorganized so that the protamines replace the histones. This reorganization is initiated by a wave of genome-wide histone acetylation, followed by massive replacement of histones by small basic proteins, transition proteins and protamines. The molecular mechanisms responsible for this reorganization of the genome remain very poorly known today. My thesis aims to explore these mechanisms by using gene inactivation in mouse of epigenetic actors specifically expressed in post-meiotic germ cells : the nuclear factor Nut (Nuclear protein in Testis) and the histone H2A variant, H2A.L.2. We have demonstrated that the Nut protein interacts and stimulates the p300 acetyltransferase activity and induces the hyperacetylation of histone H4 precisely on the lysine residues at 5 and 8 positions. This acetylation is necessary for the interaction with the first bromodomain of Brdt initiating the process of histone replacement by protamines. Thus, the Nut factor is the main element of the histone acetylation wave. We have also deciphered the crucial role of H2A.L.2 in the “opening ” of nucleosomal structures in post-meiotic germ cells thus allowing its invasion by the transition proteins. These transition proteins will in turn generate a platform for the recruitment and maturation of protamines and induce the formation of transient structures before the final compaction of the mature sperm genome. These studies allowed us to establish for the first time a coherent molecular model for understanding the post-meiotic epigenetic programming of the male genome and its impact on male fertility.

Les phospholipases A2 constituent une superfamille de protéines comprenant au moins onze phospholipases A2 sécrétées (sPLA2) et douze phospholipases A2 intracellulaires. Ces protéines catalysent l'hydrolyse des phospholipides en position sn-2, libérant un acide gras et un lysophospholipide. Elles contrôlent ainsi la production d'une variété de médiateurs lipidiques qui sont importants pour de multiples fonctions cellulaires dans différents contextes physiologiques ou physiopathologiques (maladies inflammatoires et cancer). La sPLA2 de groupe X a été clonée au laboratoire en 1997 et possède des propriétés moléculaires uniques. Son ARN messager est présent dans différents tissus, mais semble peu régulé par des stimuli proinflammatoires. L'enzyme est unique dans sa capacité à libérer des médiateurs lipidiques à partir des phospholipides cellulaires ou des lipoprotéines et possède aussi des propriétés antimicrobiennes variées. Un élément clé de la régulation fonctionnelle de la sPLA2 de groupe X est vraisemblablement lié à la présence d'un propeptide dans sa partie N-terminale. Le lieu de la maturation protéolytique de la sPLA2 de groupe X (dans la cellule avant sécrétion ou à l'extérieur après sécrétion du proenzyme), les protéases impliquées et la régulation de cette maturation dans des conditions physiologiques ou physiopathologiques sont inconnus. Le travail de cette thèse a permis de mieux comprendre comment peut s'effectuer la maturation de la sPLA2 de groupe X et quels sont ses rôles physiologiques et physiopathologiques. Concernant la maturation, nos études in vitro sur protéines purifiées et en cellules transfectées (HEK293) ont permis de montrer qu'une protéase de type furine contribue de façon majeure à l'activation de l'enzyme, vraisemblablement au cours de sa sécrétion. Nos travaux suggèrent aussi qu'une maturation est possible par d'autres protéases et dans le milieu extracellulaire comme par exemple dans les cellules LOVO. Nous avons aussi tenté de mettre en évidence cette maturation dans des tissus murins dans certaines conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous avons notamment trouvé que la sPLA2-X était la sPLA2 majeure présente dans l'acrosome des spermatozoïdes. Enfin nous avons observé un polymorphisme présent dans le propeptide de la sPLA2 humaine qui conduit à la formation d'une protéine inactive et rapidement dégradée. Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons montré que la forme active de la sPLA2 de groupe X, mais pas son proenzyme était capable i) de stimuler la prolifération cellulaire dans un contexte de cancer colorectal, ii) d'exercer une action toxique contre le parasite de la malaria P.falciparum lors de l'infection de globules rouges humains, et iii) de contrôler la réaction acrosomique des spermatozoïdes de souris, avec un impact important sur le taux de fécondité dans des tests de fécondation in vitro.

Les molécules d’adhésion jonctionnelles JAM-B et JAM-C forment une paire récepteur/ligand impliquée dans la régulation de nombreux mécanismes biologiques dont l’inflammation, l’hématopoïèse et la spermatogénèse. Dans la moelle osseuse, l’interaction entre JAM-C et JAM-B, respectivement exprimée par les cellules souches hématopoïétiques (CSH) et les cellules stromales, joue un rôle dans la rétention et la quiescence des CSH. Dans le testicule, JAM-C participe à la polarisation des spermatides en différenciation en interagissant avec JAM-B exprimée par les cellules de Sertoli. GRASP55 (Golgi ReAssembly and Stacking Protein of 55 kDa), identifiée au laboratoire comme un interacteur intracellulaire des protéines JAMs, est une protéine de l’appareil de Golgi participant à l’architecture et la dynamique de celui-ci ainsi qu’au transport protéique non-conventionnel.Le but de mon travail de thèse a été d’étudier le rôle de GRASP55 in vivo par des approches génétiques et pharmacologiques. Nous avons ainsi pu mettre en évidence que l’expression de GRASP55 par la spermatide ronde permet la localisation polarisée de JAM-C et le déroulement correct de la spermatogénèse. A contrario, GRASP55 n’est pas essentiel à l’hématopoïèse en conditions basales ou de stress. Toutefois, la délétion de GRASP-55 dans les cellules leucémiques diminue le progression de la pathologie in vivo. Ces résultats montrent un rôle non redondant de GRASP55 dans la spermatogenèse et la prolifération de cellules leucémiques et ouvrent des pistes possibles pour un ciblage thérapeutique de GRASP55 en hématologie. / The junctional adhesion molecules JAM-B and JAM-C form a receptor / ligand pair involved in regulation of many biological mechanisms including inflammation, hematopoiesis and spermatogenesis. In the bone marrow, the interaction between JAM-C and JAM-B, expressed by hematopoietic stem cells (HSC) and stromal cells respectively, is involved in HSC retention and quiescence. Similarly, in the testis, JAM-C participates in the polarization of differentiated spermatids by interacting with JAM-B expressed by Sertoli cells. GRASP55 (Golgi ReAssembly and Stacking Protein of 55 kDa), identified in our laboratory as a new intracellular interactor of JAM, is a Golgi apparatus protein involved in Golgi architecture and dynamics as well as unconventional secretion.The aim of my thesis was to study the role of GRASP55 in vivo by genetic and pharmacological approaches. We demonstrate that GRASP55 expression by round spermatid allows polarized localization of JAM-C and the correct course of the spermatogenesis. In contrast, GRASP55 is not essential for hematopoiesis in basal or stress conditions. However, deletion of GRASP-55 in leukemic cells decreases the progression of the pathology in vivo. These results show a non-redundant role of GRASP55 in the spermatogenesis and proliferation of leukemic cells and allow us to consider GRASP55 as a potential target in hematology.

La plupart des études sur l’influence de la température sur la production des spermatozoïdes portent en grande partie sur les vertébrés. Néanmoins, les invertébrés constituent la majorité de la biodiversité terrestre animale, sont également plus sensibles à ces variations de température. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont porté sur la compréhension des capacités de reproduction, et sur l’influence d’une augmentation de température sur les fonctions mâles chez Nasonia vitripennis, un hyménoptère parasitoïde. Ce travail de thèse m’a permis de confirmer que chez cette espèce, la spermatogenèse était synchronisée et de décrire pour la première fois, un système de stockage intermédiaire des spermatozoïdes entre les testicules et les vésicules séminales. De plus, j’ai pu mettre en évidence que la spermatogénèse était sensible à une augmentation de température pendant le développement, altérant le sexe ratio de la descendance par des modifications d’allocations des sexes par les femelles. Ces résultats apportent de nouvelles connaissances sur la fertilité mâle chez cette espèce et démontrent la sensibilité de la spermatogenèse à la température. / Many studies on the impact of the temperature on spermatogenesis have largely focused on vertebrates. Nevertheless, invertebrates constitute the vast majority of terrestrial biodiversity, and are especially vulnerable to variations of temperatures. The studies realized during my thesis are focused on understanding male reproductive capacities and effects of heat stress on male fertility in a parasitic wasp Nasonia vitripennis. This work allowed to confirm that spermatogenesis was synchronized, and to describe for the first time a system of spermatozoa regulation between testis and seminal vesicles. Moreover, I was able to demonstrate that spermatogenesis was sensible to temperature variation during male development, and the offspring sex ratio was altered by modifications of sex allocation. These findings open the way to the description of male fertility in this species, and show the sensitivity of spermatogenesis to temperature variation.