Reproduction de : Thèse d'exercice : Pharmacie : Nantes : 2008. / Bibliogr.

Th.--Sci. nat.--Lille 1, 1980. N°: 478.

Thèse (Ph. D.)--Université Laval, 2007. / Bibliogr.: f. 208-212. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Thèse (M.Sc.) -- Université Laval, 1998. / Bibliogr.: f. [66]-80. Publié aussi en version électronique.

Plusieurs pathologies humaines sont associées à l'altération de l'expression ou de la fonction de facteurs de transcription GATA. L'hyperméthylation, l'hypoacétylation ou la surexpression des gènes GALA sont observées dans plusieurs types de cancers. Des mutations ponctuelles des gènes GATA sont aussi à l'origine de graves maladies congénitales. Plus de 60% des tumeurs du sein sont dépendantes des estrogènes et produisent elles-mêmes les hormones nécessaires à leur croissance. Cette production aberrante d'estrogènes est causée par la surexpression de l'enzyme aromatase, codée par le gène CYP19A1. L'utilisation ectopique dans les tumeurs du sein du promoteur PII du gène CYP19A1, normalement spécifique à l'ovaire et régulé par la voie de signalisation AMPc/PKA, est reconnue comme étant responsable de la surexpression de l'enzyme et de la production inappropriée d'estrogènes par les tumeurs. Les facteurs GATA sont impliqués dans la régulation du promoteur PII de CYP19A1 dans les gonades. J'ai démontré que GATA3 et/ou GATA4 sont exprimés dans plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein. En réponse à l'activation de la voie de signalisation AMPc/PKA, GATA3/4 et le récepteur nucléaire LRH1 coopèrent de façon synergique pour moduler l'activité du promoteur PII dans les cellules de cancer du sein MCF-7. Ces résultats fournissent un nouveau mécanisme dépendant de GATA pour expliquer l'expression aberrante de l'enzyme aromatase dans les tumeurs du sein. Les mutations hétérozygotes connues de GATA4 ségrègent avec de graves défauts cardiaques congénitaux. GATA4 est un important régulateur du développement cardiaque mais aussi un marqueur précoce du développement gonadique. Toutefois, aucune des mutations connues de GATA4 n'affecte le développement ou la fonction gonadique des individus porteurs. L'effet des différentes mutations de ce facteur sur la régulation de l'expression de ses cibles gonadiques demeurait par contre inconnu. J'ai étudié cinq mutations différentes du facteur GATA4. J'ai démontré que certaines de ces mutations affectent significativement la fonction de GATA4 dans un contexte de régulation de l'expression de gènes gonadiques. Mes résultats démontrent que malgré l'absence d'un phénotype observable, la plupart des mutations de GATA4 réduisent significativement sa capacité d'activer l'expression de ses gènes cibles sans affecter sa capacité à se lier à l'ADN ou celle de recruter ses co-activateurs transcriptionnels. Dans l'ensemble, les résultats présentés dans ma thèse démontrent comment les facteurs GATA exprimés dans un contexte tumoral contribuent à l'expression aberrante de CYP19A1 dans les cellules cancéreuses du sein selon un mécanisme rappelant celui menant à l'expression gonadique de ce gène et d'autre part comment l'altération de la séquence peptidique du facteur GATA4, telle qu'observée dans de nombreuses malformations cardiaques congénitales, affecte la fonction de ce facteur de transcription dans la régulation de l'expression de ses cibles gonadiques.

GATA4 est un facteur de transcription essentiel pour le développement et la fonction de plusieurs tissus, incluant les gonades. GATA4 est exprimé sous forme de deux transcrits majeurs présentant des premiers exons distincts non codants, soient l’exon 1a et l’exon 1b. J’ai proposé que l’utilisation de différents promoteurs soit un mécanisme important dans la régulation spatiotemporelle de l’expression de GATA4. Des expériences d’hybridation in situ ont révélé que les transcrits Gata4 1a et 1b sont bien présents au niveau des cellules somatiques du testicule et de l’ovaire au cours du développement. Les résultats in vitro nous ont suggéré que le promoteur 1b est régulé positivement par GATA4. Toutefois, les résultats in vivo ont révélé que le promoteur Gata4 1b est assujetti à une autorégulation négative. Les expériences de co-transfection ont démontré que GATA4 régule sa propre expression en réprimant l’activité transcriptionnelle du promoteur Gata4 1b en interagissant avec FOG2.

Les facteurs de transcription GATA tirent leur nom de leur capacité à se lier à la séquence consensus WGATAR sur les promoteurs de leur gènes cibles. Le facteur GATA4, joue un rôle décisif dans le développement de multiples organes comme le cœur, le tractus digestif, et les gonades. Malgré son rôle central au cours du développement, le mécanisme d'action de GATA4 et son mode de régulation dans différents tissus, et plus particulièrement les gonades, reste mal compris. Le principal objectif du travail rapporté dans cette thèse a été de mieux caractériser comment GATA4 acquiert sa spécificité d'action pour réguler ses gènes cibles gonadiques. Un de ces mécanismes est la coopération avec différents partenaires transcriptionnels. Le facteur WT1 a été identifié comme un nouveau partenaire pour GATA4 dans la régulation de l'expression de SRY et de MIS/AMH, deux gènes fondamentaux de la détermination et la différenciation du sexe. Le récepteur nucléaire LRH-1/NR5A2 a lui aussi été identifié comme partenaire de GATA4 dans la régulation du gène HSD3B2 humain codant pour une enzyme cruciale de la stéroïdogenèse. Un mode de régulation alternatif est la modification post-traductionelle du facteur GATA4 lui-même, le processus le plus étudié étant la phosphorylation. Dans les cellules gonadiques, GATA4 est sujet à la phosphorylation par la protéine kinase A. Toutefois, GATA4 est aussi une cible pour la MAP kinase sur une série distincte de résidus serine. Ainsi, la phosphorylation sélective de GATA4 en réponse à différents stimuli et impliquant différentes voies de signalisation apparaît comme un mécanisme clé de la régulation de l'activité de GATA4 dans les cellules gonadiques. Enfin, l'interruption des interactions entre GATA4 et ses partenaires transcriptionnels est liée à des maladies chez l'homme. En effet, une mutation du gène GATA4 humain (hG296S) empêche son interaction avec TBX5, ce qui est à l'origine de défauts cardiaques congénitaux. Contrairement au cœur, la mutation ne semble pas avoir d'effet sur la capacité de GATA4 à coopérer avec ses partenaires transcriptionels gonadiques. Ainsi, bien que préjudiciable à la fonction cardiaque, cette mutation n'est pas supposée à provoquer des effets sur la reproduction chez l'homme. / The GATA family of transcription factors is named for the consensus nucleotide sequence (WGATAR) that they bind in the promoter region of target genes. One member of this family, GATA4, plays a prominent role in the development of multiple ventrally-located organs such as the heart, digestive tract, and gonads. Despite this pivotal developmental role, the mechanism of action of GATA4 and its regulation in different tissues, especially the gonads, remains poorly understood. The main objective of the work presented in this thesis was to better understand how GATA4 acquires its specificity of action to regulate gonadal target genes. One mechanism is through cooperative interactions with different transcriptional partners. WT1 was identified as a novel partner for GATA4 in the regulation of sex-determining region Y (SRY) and Mullerian inhibiting substance (MIS/AMH), two critical genes involved in the mammalian sex determination and differentiation pathway. The nuclear receptor LRH-1/NR5A2 was also identified as a new transcriptional partner for GATA4 in the regulation of the human 3(3- hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene (HSD3B2) involved in steroidogenesis. An alternate mechanism for regulating GATA4 activity is via post-translational modifications of the factor itself. The most studied has been the role of phosphorylation. In gonadal cells, GATA4 is a target for phosphorylation by protein kinase A (PKA). GATA4, however, was also found to be a target for MAP kinasemediated phosphorylation on a distinct set of serine residues. Thus, selective phosphorylation of GATA4 in response to different stimuli and involving different signaling pathways appears to be a key mechanism for regulating GATA4 activity within gonadal cells. Finally, disruption of cooperative interactions between GATA4 and its transcriptional partners has also been linked to human disease. Indeed, a human GATA4 mutation (hG296S) has been reported to abrogate its interaction with TBX5, resulting in congenital heart defects. Unlike the heart, the mutation was found to have no effect on the ability of GATA4 to cooperate with its major gonadal transcriptional partners. Thus, although detrimental to heart function, the hG296S mutation would not be expected to cause human reproductive defects.

Les analgésiques tel que le paracétamol, ou acétaminophène (ACE), et les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) comme l’aspirine et l’ibuprofène, sont largement utilisés dans le monde pour soulager douleur, fièvre ou inflammation. Ces médicaments, vendus sans ordonnance et souvent pris en automédication, sont de plus en plus utilisés par les femmes enceintes depuis les années 1990, notamment aux États-Unis et en Europe. De nombreuses études de cohorte ont mis en avant l’association entre la prise de ces molécules par les femmes durant le premier et deuxième trimestre de grossesse, et l’apparition de malformations congénitales des organes reproducteurs des garçons nouveau-nés, comme la cryptorchidie ou l’hypospadias. Ces analgésiques inhibent l’activité enzymatique des cyclooxygénases (Cox), qui catalysent l’étape clef de la voie de biosynthèse des prostaglandines (PGs), dont la prostaglandine D2 (PGD2), impliquée dans la détermination sexuelle des lignées somatique et germinale de la gonade mâle chez la souris. Afin d’étudier si la gonade embryonnaire peut constituer une cible de ces molécules, l’objectif principal de cette thèse a été d’analyser l’impact de l’exposition in utero à l’ACE, l’aspirine et l’ibuprofène seuls ou en combinaison, pendant la période de détermination sexuelle (de 10,5 à 13,5 jours post coitum (jpc) chez la souris). Des doses « thérapeutiques » similaires à celles utilisées chez l’Homme ont été administrées par voie orale. Mon travail a permis de démontrer que l’exposition in utero à la combinaison des deux drogues ACE et ibuprofène induisait, dans le testicule embryonnaire, une accélération de la différenciation de la lignée germinale du testicule embryonnaire, précurseurs des gamètes à l’âge adulte, par le biais d’une reprogrammation épigénétique avancée, ainsi qu’une augmentation du stockage du glycogène dans les cordons testiculaires, via l’activation de l’expression des gènes de la matrice extracellulaire. De plus, ce projet a permis d’identifier pour la première fois le profil d’expression des prostaglandines dans le testicule embryonnaire de souris. Dans un deuxième temps, l’impact de l’exposition in utero à ces drogues sur la stéroïdogenèse a été étudié, en parallèle avec l’étude sur le rôle de la PGD2 dans les cellules stéroïdogènes (cellules de Leydig) dans le testicule fœtal de souris à 17,5 jpc. Ces résultats pourraient conduire à modifier l’utilisation de ces médicaments chez la femme, au cours des deux premiers trimestres de grossesse. / Mild analgesics such as paracetamol, or acetaminophen (ACE), and nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) such as aspirin and ibuprofen, are widely used worldwide for relieving pain, fever or inflammation. These over-the-counter drugs are often taken as self-medication, and are increasingly used by pregnant women since the 1990s, particularly in the United States and Europe. Many cohort studies have highlighted the association between intake of these molecules by women during the first and second trimester of pregnancy, and the occurrence of birth defects of the reproductive organs of newborn boys, such as cryptorchidism or hypospadias. These analgesics inhibit the enzymatic activity of cyclooxygenases (Cox), which catalyze key step in the biosynthetic pathway of prostaglandins (PGs), whose prostaglandin D2 (PGD2), involved in the male sex determination of both somatic and germinal lineages in mice. To investigate whether the embryonic gonad can be a target of these molecules, the main objective of this thesis was to analyze the impact of in utero exposure to ACE, aspirin and ibuprofen alone or in combination, during the period of sex determination (10.5 to 13.5 days post coitum (dpc) in mice). "Therapeutic" doses similar to those used in humans were orally administered. My work has shown that in utero exposure to the combination of both ACE and ibuprofen drugs induced acceleration of the differentiation of the embryonic testis germline, the precursors of gametes in adulthood, through an advanced epigenetic reprogramming, and an increase of glycogen storage in the testicular cords, via activation of extracellular matrix gene expression. In addition, this project has identified for the first time the profile of prostaglandins expression in mouse embryonic testis. Secondly, the impact of in utero exposure to these drugs on steroidogenesis was evaluated, in parallel with the study on the role of PGD2 in steroidogenic cells (Leydig cells) in mouse fetal 17.5 dpc testis. These results could lead to change the use of these drugs in women, during the first two trimesters of pregnancy.

FOXL2 constitue un gène majeur de la différenciation et de la fonction ovarienne. Chez l’Homme, l’haploinsuffisance de ce gène induit des malformations palpébrales qui peuvent être associées ou non à une insuffisance ovarienne prématurée (BPES de type I ou II). Dans certains cas, des anomalies de l’expression de FOXL2 sont liées à des délétions de régions situées très en amont du gène, témoignant de la présence d’activateurs distaux. L’existence de cette régulation à longue distance a aussi été mise en évidence dans l’espèce caprine par notre équipe. La mutation naturelle PIS (Polled Intersex Syndrome) induit à l’état homozygote l’absence d’expression du gène FOXL2 dans les gonades XX, conduisant au développement de testicules à la place d’ovaires. Ainsi, au cours de mon doctorat j’ai été amenée à travailler sur deux aspects différents : (i) l’analyse des cibles/voies activées par FOXL2 dans la gonade, et (ii) l’étude de la régulation à distance de l’expression de FOXL2.En ce qui concerne le premier point, l’analyse du rôle d’un gène candidat, Dmxl2, chez la souris a nécessité la mise en place d’une invalidation conditionnelle de ce gène (Knock-out ou KO) dans les gonades (le KO total étant létal à la naissance). Chez les mâles, une diminution de 60% de la production de spermatozoïdes a été observée à la puberté pendant la première vague de spermatogénèse.En ce qui concerne le second point, l’étude d’une région régulatrice potentielle de l’expression de FOXL2 a permis de définir des éléments très conservés présentant un profil épigénétique caractéristique de régions de type « enhancers ». J’ai ensuite établi un modèle in vitro « d’édition de l’épigénome » du locus FOXL2, en utilisant la technologie CRISPR/dCas9-p300 pour modifier la marque épigénétique H3K27ac et activer l’expression de ce gène. A long terme, ces travaux pourraient aboutir à la création de « médicaments épigénétiques » pour soutenir l’expression de FOXL2 et rétablir la fertilité des patientes atteintes d’une mutation de ce gène. / FOXL2 is a major gene for ovarian differentiation and functions. In humans, FOXL2 haploinsufficiency induces eyelid malformations with or without premature ovarian failure (BPES type I or II). In some cases, abnormalities of FOXL2 expression are related to deletions of regions located far upstream of this gene, indicating the presence of distal activators. The existence of this long-range regulation has also been demonstrated in the goat species by our laboratory. The natural mutation PIS (Polled Intersex Syndrome) when homozygous induces the silencing of FOXL2 expression in XX gonads, leading to the development of testes instead of ovaries. Thus, during my PhD, I worked on two different aspects: (i) the analysis of FOXL2-activated targets/pathways in the gonad, and (ii) the study of the long-range regulation of FOXL2 expression.Regarding the first point, gene function analysis of the candidate gene Dmx12 required the establishment of a conditional knock-out in the mouse gonad (Dmxl2 total KO is lethal at birth). In males, a 60% decrease in sperm production was observed at puberty during the first wave of spermatogenesis.Regarding the second point, the study of a putative regulatory region of FOXL2 expression allowed to define highly conserved elements harbouring typical enhancer epigenetic profile. Then, I established an in vitro model of FOXL2 locus “epigenome editing”, using the CRISPR/dCas9-p300 technology to modify the epigenetic mark H3K27ac. In the long term, this work may lead to the development of "epigenetic drugs" to support the expression of FOXL2 and restore the fertility of patients with a mutation of this gene.

La metformine est utilisée chez les patients et patientes atteints du diabète de type II. Elle est également administrée lors d’une infertilité liée à une insulino-résistance ou à un désordre métabolique. Mon projet de recherche a été d’analyser les effets de cet antidiabétique sur la fonction gonadique administré au stade foetal ou à la puberté. Nous avons montré par une approche in vivo sur deux modèles animaux: 1) qu'une administration orale de metformine à des poulets pré-pubères entraine un retard de puberté. Il se caractérise par une réduction du poids testiculaire, du diamètre des tubes séminifères et par une baisse de la testostérone sérique. 2) qu’une exposition des foetus mâles à de la metformine, chez la souris, conduit une fois adulte a une diminution de la taille des portées de 30%. Ce dysfonctionnement est associé à des marques épigénétiques sur l’ADN et des anomalies morphologiques de la tête des spermatozoïdes. Des techniques à haut débit (protéomique et métabolomique) réalisées sur des cultures de cellules de Sertoli immatures traitées ou non à la metformine ont permis de démontrer : 1) que le traitement mène à un métabolisme cellulaire de type Warburglike. 2) que des protéines présentent des différences d’abondance entre les deux conditions et qu’elles sont impliquées dans l’organisation du cytosquelette, de l’adhésion cellulaire, de la compaction de l’ADN, de la régulation de la réponse cellulaire à l’hypoxie et de l’immunité. Les résultats obtenus suggèrent que les grandes fonctions de sécrétion, de support et de protection des cellules de Sertoli sont modifiées par cet antidiabétique et qu’une exposition in utero à la metformine pourrait agir sur la fertilité et sur le métabolisme. / Metformin is used to treat patients with type II diabetes, it could be also administered to improve infertility associated to insulin-resistance or metabolic disorder. My research project was to analyse the consequence of a metformin exposure on gonad function from fetal to adult period. We showed by an in vivo approach on two animal models: 1) that oral administration of metformin to young chickens delay the puberty. It is characterized by a reduction in the testis weight, diameter of seminiferous tubule and decrease in testosterone level. 2) that mice, exposed in utero with metformin leads at adulte age to a lower fertility. This dysfunction is associated with morphological abnormalities of the sperm head and epigenetic marks on DNA. The second approach used proteomic and metabolomic strategy on cultured Sertoli cells treated or not with metformin. We demonstrated : 1) that the treatment leads to Warburg-like cellular metabolism. 2) that proteins present differences of abundances are involved in cytoskeleton organization, cell adhesion, DNA compaction, reponsiveness to hypoxia and immunity. The results suggest that the main function of secretion, support and protection of germ cell by Sertoli cells are modified by this antidiabetic, and that in utero exposure to metformin could act on the fertility and metabolism.