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Im Bereich der Biosensorik nehmen Sensoren auf der Grundlage lebender Zellen eine besondere Rolle ein: Mit ihrer Hilfe ist es möglich ohne großen technischen Aufwand die Bioverfügbarkeit eines spezifischen Analyten zu detektieren. Aufgrund ihrer Robustheit und der Einfachheit der Kultivierung eignet sich die Hefe S. cerevisiae in besonderem Maß zur Generierung von Ganzzellsensoren. Ein weiterer Vorteil des Einsatzes dieses eukaryotischen Mikroorganismus ist die Möglichkeit der Übertragbarkeit der Ergebnisse auf höhere Organismen. Ziel dieser Arbeit war die Herstellung hefebasierter Ganzzellsensoren für die Detektion von Essigsäure. Als Referenzanwendung diente der Biogasprozess, denn dort ist die Essigsäure sowohl ein Zwischenprodukt als auch ein Indikator für Prozessstörungen. Zur Optimierung der Produktion und einer besseren Steuerung von Biogasanlagen ist daher eine kontinuierliche Überwachung der Essigsäurekonzentration im Prozess sinnvoll. Im Rahmen dieser Arbeit konnten mit 5`-YGP1, 5`-TPO2 und 5`-YRO2 drei Essigsäure-spezifische Promotoren identifiziert werden. Durch Kopplung mit einem rot-fluoreszierenden Protein entstanden Reportergenkonstrukte, die in Hefezellen verbracht wurden. Entsprechende Transformanden wurden initital charakterisiert. Das Reportergenkonstrukt 5`-YGP1-tRFP erwies sich aufgrund der Stärke und des Verlaufs des Fluoreszenzsignals für die Generierung eines Ganzzellsensors als besonders geeignet. Die erzeugten rekombinanten Hefen fluoreszierten in Anwesenheit von Essigsäure abhängig von der eingesetzten Konzentration der Säure in einem Bereich von 1,5 bis 35 mM. Beispielsweise konnte bei Zugabe von 30 mM Essigsäure eine bis zu 20-fache Induktion der Fluoreszenzsignale beobachtet werden. Im weiteren Verlauf erfolgten unter anderem Analysen zur Regeneration des entwickelten hefebasierten Sensors. Die Regenerationszeit betrug ca. 8 h. Die erhaltenen Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Möglichkeit einer Mehrfachanwendung besteht. Zur Optimierung des Sensors wurde der Einsatz von Stämmen, bspw. mit der Deletion spezifischer Transporter zum Import von Essigsäure bzw. dem Export von Acetationen, untersucht. Hinsichtlich einer erhöhten Signalstärke oder kürzeren Reaktionszeit war jedoch kein Einfluss einer Deletion nachweisbar. Zur Untersuchung der Querempfindlichkeit wurden andere, ebenfalls im Biogasprozess vorkommende, flüchtige Fettsäuren getestet. Dabei konnte die Spezifität des entsprechenden Ganzzellsensors für die Essigsäure gezeigt werden. Testungen von Realproben aus dem Biogasprozess, die vom Projektpartner bereitgestellt worden waren, verliefen vielversprechend. Für den Einsatz von Ganzzellsensoren in der Praxis ist eine lange Standzeit von Vorteil. Aus diesem Grund wurde im weiteren Verlauf der Arbeit dazu übergegangen, Reportergenkonstrukte stabil im Genom der Hefe zu integrieren um die Langzeitstabilität dieser generierten Ganzzellsensoren zu untersuchen. Durch Paarung und Sporulation wurden Sporen erzeugt, aus denen nach der Lagerung über einen Zeitraum von bis zu sechs Monaten vegetative Hefezellen erfolgreich reaktiviert werden konnten. Dabei fluoreszierten die Ganzzellsensoren in Anwesenheit von Essigsäure mit der gleichen Stärke und Konzentrationsabhängigkeit wie zu Beginn der Lagerung. Durch den Einsatz des auf dem Hefe-Pheromonsystem basierenden Verstärkersystems für zelluläre Signale, welches bereits in der Arbeitsgruppe etabliert ist, konnte das nach der Integration abgeschwächte Fluoreszenzsignal erfolgreich 30 bis 40-fach amplifiziert werden.

In der Hefe Yarrowia lipolytica führen Mutationen im GPR1-Gen zu Essigsäuresensitivität. Die Deletion dieses Genes hat demgegenüber keinen Effekt auf den Phänotyp. In dieser Arbeit wurde das Gpr1-Protein näher charakterisiert. Es zeigte sich, dass GPR1-Mutantenstämme wesentlich schneller Acetat akkumulierten als der Wildtyp. Außerdem konnte bestetigt werden, dass Gpr1p ein integrales Membranprotein ist. Mittels Ortspezifischer Analyse wurden verschiedene funktionelle Bereiche untersucht. Das Protein unterliegt zudem einer Phosphorylierung/Dephosphorylierung. Auf der Grundlage der dargelegten Ergebnisse wurde ein Funktionsmodell für Gpr1p erstellt.

Trans-dominante Mutationen im GPR1-Gen der Hefe Yarrowia lipolytica führen zur Sensitivität der Hefezellen gegenüber Essigsäure. Die Deletion dieses Genes hat dem gegenüber keinen Effekt auf den Phänotyp. In dieser Arbeit wurde das Gpr1-Protein aus Y. lipolytica und dessen Orthologe Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp von S. cerevisiae weiter charakterisiert. S. cerevisiae-Transformanden, welche die Mutantenallele GPR1-1 bzw. GPR1-2 exprimierten, zeigten bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glucose eine erhöhte Sensitivität gegenüber Essigsäure. Mittels Ort-spezifischer und zufälliger Mutagenese konnten funktionell wichtige Bereiche in den Proteinen Ycr010cp und Ynr002cp identifiziert werden. Die GPR1-Orthologen in S. cerevisiae werden durch verschiedene C-Quellen und voneinander unabhängig reguliert. Die Expression von YCR010c und YDR384c wird weiterhin durch allgemeinen Stress induziert. Die Deletion von zwei oder allen drei Homologen hatte eine Verringerung der Ammoniumproduktion zur Folge. Aufgrund der geringen Ähnlichkeit der Gpr1p-Orthologen zu Ammoniumtransportern wird davon ausgegangen, daß sie selber keine Ammoniumtransporter darstellen. Es wird angenommen, dass die Gpr1p-orthologen Proteine eine regulatorische Funktion haben bzw. Bestandteil einer bisher nicht bekannten Signaltransduktionskette sind.

Halogenierte Verbindungen treten in der Natur in einer großen Vielzahl auf. Ihre Funktionen können sehr vielfältig sein und reichen von antimikrobiellen Aktivitäten bis hin zu pflanzlichen Wachstumsregulatoren. Vor allem in Pilzen und Bakterien gibt es eine Reihe halogenierter Substanzen. Die Synthesewege und beteiligten Enzyme dieser Verbindungen sind weitestgehend aufgeklärt. Bei einer Klasse von halogenierenden Enzymen handelt es sich um Flavin-abhängige Tryptophan-Halogenasen, welche die Aminosäure Tryptophan regioselektiv und substratspezifisch an bestimmten Positionen des Indolrings halogenieren können. Tryptophan ist eine essenzielle Aminosäure, welche sehr vielfältige Funktionen innerhalb der Zellen besitzt. So wird diese in Polypeptidketten von Enzymen und Proteinen eingebaut und dient als Vorstufe für viele verschiedene Stoffwechselprodukte. Das Pflanzenhormon Indol-3-Essigsäure (IAA) leitet sich z. B. aus ebendieser Aminosäure ab. Pflanzenhormone haben sehr vielfältige Funktionen innerhalb der Pflanzen und spielen z. B. bei der Entwicklung, Differenzierung und Abwehr eine wichtige Rolle. In einigen Pflanzen konnte eine halogenierte Form von IAA, die 4-Chlorindol-3-Essigsäure, nachgewiesen werden. In verschiedenen Versuchen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung eine erhöhte Reaktivität gegenüber der nicht halogenierten Form aufweist. Die Wirkung dieser Substanz wurde in den letzten Jahrzehnten gut untersucht, über die an der Synthese beteiligten Enzyme dieses Pflanzenhormons ist jedoch kaum etwas bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Gene von drei bakteriellen Tryptophan-Halogenasen (pyrH, thiH und prnA) in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana exprimiert und die Bildung von chlorierten Substanzen genauer untersucht. Hauptaugenmerk wurde dabei auf mögliche chlorierte Metabolite gelegt, welche sich von der Aminosäure Tryptophan ableiten. Neben der Expression der bakteriellen Halogenasegene wurden diese zusätzlich für die Modellpflanze optimiert und unter der Kontrolle des 2× 35S-Promotors in Arabidopsis thaliana transformiert. Die heterologe Expression von AtpyrH, AtthiH, AtprnA, sowie der optimierten Gene AtpyrHopt, AtthiHopt und AtprnAopt konnte in verschiedenen transgenen Linien in den Pflanzen nachgewiesen werden. Die Expression der Halogenasegene variiert dabei in den untersuchten Linien. Durch die Optimierung konnte keine erhöhte Expression der Gene erzielt werden. Lediglich bei der Expression von AtpyrHopt zeigte sich ein erhöhtes Niveau der Genregulation im Vergleich zu AtpyrH. Der Nachweis, dass die transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen, welche eines der Halogenasegene exprimieren, in der Lage sind die Aminosäure an der entsprechenden Position (5, 6 oder 7) zu halogenieren konnte für alle stabil transformierten Gene erbracht werden. Zusätzlich gelang es, die Halogenase-Enzyme aus transgenen Pflanzen von AtpyrH und AtpyrHopt anzureichern und deren Funktionsfähigkeit in einem Enzym-Test nachzuweisen. Es konnten ebenfalls weitere chlorierte Intermediate detektiert werden, welche u. a. Vorläufermoleküle des Hormons IAA aber auch weiterer Substanzen wie z. B. Camalexin sind. Für Arabidopsis thaliana-Wildtyp konnte die Möglichkeit zur Bildung von Cl-IAA durch die Zugabe von chloriertem Tryptophan gezeigt werden. Die an der Biosynthese beteiligten Enzyme können das chlorierte Substrat verwenden und dem Stoffwechsel zuführen. Die Bildung der chlorierten Verbindungen erfolgte in den transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen ohne eine zusätzliche Expression einer Flavin-Reduktase. Das für die Halogenierungsreaktion notwendige FADH2 kann durch die Pflanzen selbst zur Verfügung gestellt werden. Die unterschiedliche Regulation der Gene führte bei den transgenen Linien nicht zu phänotypischen Unterschieden. Sowohl die Entwicklung der Pflanzen, als auch die Anzahl und Größe der Rosettenblätter entspricht dem Wildtyp und ist durch die Bildung chlorierter Verbindungen nicht beeinflusst. In verschiedenen Tests wurde die erhöhte Bioaktivität sowohl von chloriertem Tryptophan als auch chlorierter IAA in in vitro Experimenten mit verschiedenen Pflanzen bestätigt. Chlorierte IAA hemmte zusätzlich dazu das Wachstum des Bakteriums Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. In phytopathologischen Untersuchungen mit verschiedenen transgenen Pflanzen zeigte sich, dass Linien von AtthiHopt, AtprnA und AtprnAopt mitunter eine verbesserte Resistenz gegen bestimmte Pathogene aufweisen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass die Bildung von chloriertem Tryptophan und chloriertem Indol-3-Acetonitril durch die heterologe Expression von Flavin-abhängigen Tryptophan-Halogenasen in Arabidopsis thaliana sowohl durch die ursprünglichen bakteriellen, als auch die optimierten Gene möglich ist.

Trans-dominante Mutationen im GPR1-Gen der Hefe Yarrowia lipolytica führen zur Sensitivität der Hefezellen gegenüber Essigsäure. Die Deletion dieses Genes hat dem gegenüber keinen Effekt auf den Phänotyp. In dieser Arbeit wurde das Gpr1-Protein aus Y. lipolytica und dessen Orthologe Ycr010cp, Ydr384cp und Ynr002cp von S. cerevisiae weiter charakterisiert. S. cerevisiae-Transformanden, welche die Mutantenallele GPR1-1 bzw. GPR1-2 exprimierten, zeigten bei gleichzeitiger Anwesenheit von Glucose eine erhöhte Sensitivität gegenüber Essigsäure. Mittels Ort-spezifischer und zufälliger Mutagenese konnten funktionell wichtige Bereiche in den Proteinen Ycr010cp und Ynr002cp identifiziert werden. Die GPR1-Orthologen in S. cerevisiae werden durch verschiedene C-Quellen und voneinander unabhängig reguliert. Die Expression von YCR010c und YDR384c wird weiterhin durch allgemeinen Stress induziert. Die Deletion von zwei oder allen drei Homologen hatte eine Verringerung der Ammoniumproduktion zur Folge. Aufgrund der geringen Ähnlichkeit der Gpr1p-Orthologen zu Ammoniumtransportern wird davon ausgegangen, daß sie selber keine Ammoniumtransporter darstellen. Es wird angenommen, dass die Gpr1p-orthologen Proteine eine regulatorische Funktion haben bzw. Bestandteil einer bisher nicht bekannten Signaltransduktionskette sind.

In der Hefe Yarrowia lipolytica führen Mutationen im GPR1-Gen zu Essigsäuresensitivität. Die Deletion dieses Genes hat demgegenüber keinen Effekt auf den Phänotyp. In dieser Arbeit wurde das Gpr1-Protein näher charakterisiert. Es zeigte sich, dass GPR1-Mutantenstämme wesentlich schneller Acetat akkumulierten als der Wildtyp. Außerdem konnte bestetigt werden, dass Gpr1p ein integrales Membranprotein ist. Mittels Ortspezifischer Analyse wurden verschiedene funktionelle Bereiche untersucht. Das Protein unterliegt zudem einer Phosphorylierung/Dephosphorylierung. Auf der Grundlage der dargelegten Ergebnisse wurde ein Funktionsmodell für Gpr1p erstellt.

Aqueous solutions of sodium acetate, NaCH₃CO₂, and acetic acid, CH₃COOH, were studied using Raman and infrared spectroscopy. The spectra were recorded over a large concentration range, in the terahertz region and up to 4000 cmˉ¹. In the isotropic Raman spectrum in R-format, a polarized band at 189 cmˉ¹ was assigned to the υ₁Na–O stretch of the hydrated Na⁺-ion and a shoulder at 245 cmˉ¹ to the restricted translation band, υsO–H⋯O* of the hydrated acetate ion, CH₃CO₂ˉ(aq). The CH₃CO₂ˉ(aq) and the hydrated acetic acid, CH₃COOH(aq), possess pseudo Cs symmetry. Geometrical parameters for the species in the gas phase and for CH₃CO₂ˉ(aq) and CH₃COOH(aq) are reported. Characteristic bands for CH₃CO2ˉ(aq) and CH₃COOH(aq) were assigned under the guidance of the DFT vibrational frequency calculations and discussed in detail. In aqueous NaCH₃CO₂ solutions, at high concentrations, no contact ion pairs could be detected, but instead solvent separated ion pairs were found. In LiCH₃CO₂(aq), however, contact ion pairs are formed which is indicated by the appearance of a shoulder at 939 cmˉ¹ and the shift of the symmetric stretching mode of the –CO₂ˉ group to higher wavenumbers.