Der SET-Bereich befindet sich unter den verschiedenen Proteinsequenzbereichen, die mit epigentischer Regulation hauptsächlich durch die Präsenz von Trihtorax (trxG) und Polycomb (PcG) Gruppen von Chromatinmodifikatoren in Zusammenhang gebracht werden. Nach der Entdeckung des ersten SET-Bereichs vor einigen Jahren, welcher die Histon-Lysin-Methyltransferase (Su(var)39) enthält, wurde den Proteinen mit SET-Bereich sehr viel Aufmerksamkeit geschenkt. Obwohl die Histon-Lysin-Methylierung schon länger als 30 Jahre bekannt ist, war ihre Funktion vor diesem überragenden Ergebnis größten Teils unbekannt. In meiner Arbeit beschreibe ich die kombinatorische und funktionale Charakterisierung von 3 Hefe Proteinkomplexen durch die Anwendung von proteomischer SEAM (Sequential Epitope Tagging and Mass Spectrometry). Zwei dieser Komplex enthalten einen SET-Bereich und die Dritte ist der Rad6 Komplex aus S. pombe (Sp_Rad6C). Der Set1 Komplex (Set1C) beinhaltet 8 Bausteine, methylisiert Lysin 4 in Histon H3 und ist die erste, entdeckte Histone H3 Lysin 4 Methyltransferase. Es beinhaltet ein Ash2 Homolog (Bre2), einen bekannten Baustein von trxG. Kürzlich wurden Rad6 beinhaltende Komplexe gezeigt, die in engem Bezug zu der H3-K4 und H3-K79 Methylation durch ubiquitinierung von Histon H2B und die Etablierung von trans-histonen Signalwegen stehen. Unsere Analysen von Sp-Rad6C führten zu mehreren interessanten Ansichten. Der Set3 Komplex (Set3C) hat keine feststellbare Aktivität einer Methyltransferase, enthält jedoch zwei Histon deacetylasen (HDACs) ? eine klassische HDAC (Hos2) und eine NAD-abhängige HDAC (Hst1). Unsere funktionelle Analyse von Set3C zeigt, dass Set3C bei der Regulierung des meiotischen Genexpressionsprogramms in knospenden Hefen (S. cerevisiae) beteiligt ist. Evolutionbiologisch betrachtet, ist die Spalt-Hefe (S. pombe) sehr weit von S. cerevisiae entfernt und wird meist als ein besserer Modellorganismus fur höhere Eukaryoten angesehen. In einem Versuch, unser Wissen uber andere Organismen zu vergrößern, haben wir ähnliche Untersuchungen in S. pombe unternommen und haben herausgefunden, dass Set1C in beiden Hefen sehr stark konserviert ist. Darüberhinaus waren die Set1-Ash2 Verbindungen konserviert und wir nehmen an, dass auch in höheren Eukaryoten Set1-ahnliche Methyltransferasen Ash2-ahnliche Proteinen angehören. Dies wurde später durch mehrere Studien von anderen Gruppen bestätigt, die an Säugetieren arbeiten. Was Set3C anbelangt, wurden unsere weiteren Analysen nur durch vergleichende Proteomik beschränkt. Wir zeigen, dass der proteomische Kern von Set3C in Spalt-Hefe konserviert wird. Im Gegensatz zu Set3C in S. cerevisiae, beinhaltet diese in S. pombe nur eine HDAC, die zur Hos2 Familie gehört,. Die präsentierte Arbeit hat auch viele Auswirkungen auf die übergreifende Organisation von Proteomen. Wir beschreiben verschiedene Beispiele von gemeinsamen Komponenten zwischen unterschiedlichen Komplexen und prägen den Begriff "proteomischer Hyperlink". Wir waren in der Lage zu zeigen, dass proteomische Kerne sogar für unwesentliche Proteinkomplexe hoch konserviert sind. Die generelle proteomische Schaltung über proteomische Hyperlinks scheint jedoch verworrener und unvorhersehbar zu sein. Wir schlussfolgern, dass die Erschaffung von zuverlässigen, detailierten, proteomischen Abbildungen, welche auf dem Wissen von niederen Organismen fundieren, zur Zeit nicht möglich ist.

Urodele amphibians have the remarkable ability to re-grow lost body parts. This regenerative response after injury in urodeles involves dedifferentiation of fully differentiated cells into proliferative cells. One well-studied example of this is the dedifferentiation of multinucleated muscle cells into mononucleate cells resembling their precursors, the myoblasts. To form these mononucleate cells the differentiated myotubes in vivo must re-enter and complete the cell cycle; they again proliferate and produce progeny. A key question is what factors induce the myotubes to re-enter the cell cycle and proliferate. Early events of cell cycle re-entry can be studied in the A1 cell line, a myogenic cell line isolated from the Notophthalmus viridescens hindlimb, which traverses cell cycle until G2 in response to serum. In particular, it was found that thrombin cleavage induces a factor in serum of all animals tested so far to promote S phase re-entry in A1 myotubes. We have used this S phase re-entry of the A1 cell line to purify the serum activity and developed a 5-step purification protocol that enriches the activity almost 2 000 fold over the starting material, or 40 000 fold over serum. To conveniently produce and test potential candidates for their ability to induce S phase re-entry in A1 myotubes, we also developed an overexpression- and purification system for emerging candidates. Candidates were then tested for this activity with or without prior incubation with thrombin. We identified Bmp proteins as the first pure molecules that were found in fractions across the purification of the activity and that could also induce cell cycle re-entry in a dose-dependent manner when recombinantly added to the A1 myotubes. Furthermore, this response could be blocked in a dose-dependent manner by the known bmp-inhibitor noggin. Finally, we showed that inhibition of Bmp signaling in vivo causes defects in axolotl tail regeneration.

The major goal of this study was to develop an experimental proteomics approach for deciphering protein complexes and protein interaction networks in the budding and fission yeasts. Key steps of the employed analytical routine, including the purification of complexes and mass spectrometric identification of their subunits, were investigated in detail. Archiving, storage and handling of polyacylamide gels, visualization of protein bands and their effect on the efficiency of in-gel digestion and mass spectrometric identification of proteins were quantitatively evaluated. It was further demonstrated that a combination of several mass spectrometric techniques based on MALDI and ES ionization provided complementary data and enabled comprehensive characterization of protein digests. The optimized analytical procedures were employed in deciphering protein complexes and protein interaction networks in the budding and fission yeasts. A combination of Tandem Affinity Purification (TAP) and mass spectrometric identification of gel separated protein subunits is generic and robust strategy that provided accurate and reproducible data. The evaluation of TAP success rate, reproducibility and typical protein background presented in this work is based on TAP tagging and immunoprecepitation of 75 genes in S. cerevisiae and 22 in S. pombe. The molecular composition of characterized protein complexes was compared with protein-protein interactions uncovered by other established methods, such as yeast two hybrid screens or proteome-wide purification of protein complexes. We found that repetitive purification of protein complexes using different subunits as baits is crucially important for confident charting of proteomic environments. Accurate dissection of individual protein complexes and identification of their proteomic hyperlinks enabled to consider proteomic environments in the phylogenetic perspective and paved the way to reliable projection of proteomics data obtained in lower eukaryotic model organisms to higher eukaryotes, including humans.

In der Hefe Yarrowia lipolytica führen Mutationen im GPR1-Gen zu Essigsäuresensitivität. Die Deletion dieses Genes hat demgegenüber keinen Effekt auf den Phänotyp. In dieser Arbeit wurde das Gpr1-Protein näher charakterisiert. Es zeigte sich, dass GPR1-Mutantenstämme wesentlich schneller Acetat akkumulierten als der Wildtyp. Außerdem konnte bestetigt werden, dass Gpr1p ein integrales Membranprotein ist. Mittels Ortspezifischer Analyse wurden verschiedene funktionelle Bereiche untersucht. Das Protein unterliegt zudem einer Phosphorylierung/Dephosphorylierung. Auf der Grundlage der dargelegten Ergebnisse wurde ein Funktionsmodell für Gpr1p erstellt.

Die niedrige Inzidenz chronisch-entzündlicher Darmerkrankungen (CED) in ostasiatischen Ländern im Vergleich zu Westeuropa und den USA könnte auf unterschiedliche Lebensstile und Ernährungsgewohnheiten zurückzuführen sein. Asiaten nehmen mit der Nahrung viel höhere Mengen an Isoflavonen zu sich als Europäer und US-Amerikaner. Diese sind in der Lage, wie natürliche Östrogene an Östrogenrezeptoren (ER) zu binden. Für das Östrogen 17β-Östradiol (E2) sowie selektive Liganden des ERβ sind antiinflammatorische Wirkungen im Darm bereits nachgewiesen worden. Diese Arbeit untersuchte in Modellsystemen für CED die antiinflammatorischen Eigenschaften von Isoflavonen, speziell von Genistein, und stellte einen Vergleich mit synthetischen ER-selektiven Liganden sowie E2 her, um die Involvierung der beiden ER-Subtypen zu evaluieren. In tierexperimentellen Studien wurde der Einfluss der Testsubstanzen auf Ausprägung und Verlauf einer Kolitis in zwei Nagermodellen (HLA-B27 transgene Ratte und TNBS-induzierte Kolitis) analysiert. Ein Ernährungsexperiment, in dem eine Gruppe der Tiere bereits in utero sowie postnatal über Muttermilch und Futter hohen Phytoöstrogenspiegeln ausgesetzt war, zeigte wider Erwarten keine antiinflammatorischen Effekte auf die akute Ausprägung der induzierten Kolitis. Stattdessen waren die untersuchten Parameter bei dieser Ernährungsform gegenüber prä- und postnatal normal ernährten Tieren verstärkt. Dagegen bewirkte oral verabreichtes Genistein in der chronischen Phase der TNBS-induzierten Kolitis eine Unterdrückung der Entzündungsparameter im Darm. Die subkutane Verabreichung von Genistein, eines steroidalen ERβ-selektiven Agonisten, oder von E2 führte hingegen zu keiner signifikanten Einflussnahme auf die untersuchten Parameter in der akuten Phase der Inflammation. Zur Charakterisierung der molekularen Grundlagen einer antiinflammatorischen Wirkung von E2, synthetischen ER-selektiven Agonisten und Genistein wurden in vitro Studien mit Kolonkarzinomzelllinien (HT-29 und Caco-2) durchgeführt. Hierzu wurden die Zellen mit Interleukin-1β (IL-1β) stimuliert, was eine Induktion der inflammationsassoziierten Gene Cyclooxygenase-2 und Interleukin-6 auf mRNA Ebene bewirkte. Bis auf Genistein konnten für die getesteten Substanzen keine antiinflammatorischen Effekte auf die mRNA-Expression der induzierten Markergene beobachtet werden. Genistein bewirkte in Caco-2 Zellen eine Hemmung der untersuchten Gene. Weitere Analysen ergaben, dass die beiden Zelllinien ER nur schwach bzw. gar nicht exprimieren. Eine Transfektion von HT-29 Zellen mit ERα führte zu einer deutlichen Hemmung der Expression der Markergene durch E2, während eine Transfektion mit ERβ lediglich einen schwach hemmenden Effekt bewirkte. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass die niedrigen CED-Inzidenzraten in Ostasien wohl nicht allein auf dem dortigen hohen Isoflavonkonsum beruhen, sondern auch anderen Komponenten des Lebensstils zuzuschreiben sind. Dennoch deutet sich an, dass das Genistein, bei oraler Administration, die Regeneration des geschädigten Darmgewebes im chronischen Erkrankungsverlauf unterstützen und damit auch zur Prävention von Kolonkarzinomen beitragen könnte. Bei antiinflammatorischen Effekten von ER-Liganden spielt die Transaktivierung von ER eine entscheidende Rolle. Die Wirkung von Genistein in untransfizierten Caco-2 Zellen legt jedoch auch die Teilnahme weiterer Mechanismen nahe, die noch zu untersuchen sind. Vor diesem Hintergrund erscheinen weiterführende Untersuchungen zum Einsatz von steroidalen ER-Agonisten und Genistein bei CED und den zugrunde liegenden Mechanismen als sinnvoll.

Functional characterization of biochemically-isolated proteins is a central task in the biochemical and genetic description of the biology of cells and tissues. Protein identification by mass spectrometry consists of associating an isolated protein with a specific gene or protein sequence in silico, thus inferring its specific biochemical function based upon previous characterizations of that protein or a similar protein having that sequence identity. By performing this analysis on a large scale in conjunction with biochemical experiments, novel biological knowledge can be developed. The study presented here focuses on mass spectrometry-based proteomics of organisms with unsequenced genomes and corresponding developments in biological sequence database searching with mass spectrometry data. Conventional methods to identify proteins by mass spectrometry analysis have employed proteolytic digestion, fragmentation of resultant peptides, and the correlation of acquired tandem mass spectra with database sequences, relying upon exact matching algorithms; i.e. the analyzed peptide had to previously exist in a database in silico to be identified. One existing sequence-similarity protein identification method was applied (MS BLAST, Shevchenko 2001) and one alternative novel method was developed (MultiTag), for searching protein and EST databases, to enable the recognition of proteins that are generally unrecognizable by conventional softwares but share significant sequence similarity with database entries (~60-90%). These techniques and available database sequences enabled the characterization of the Xenopus laevis microtubule-associated proteome and the Dunaliella salina soluble salt-induced proteome, both organisms with unsequenced genomes and minimal database sequence resources. These sequence-similarity methods extended protein identification capabilities by more than two-fold compared to conventional methods, making existing methods virtually superfluous. The proteomics of Dunaliella salina demonstrated the utility of MS BLAST as an indispensable method for characterization of proteins in organisms with unsequenced genomes, and produced insight into Dunaliella?s inherent resilience to high salinity. The Xenopus study was the first proteomics project to simultaneously use all three central methods of representation for peptide tandem mass spectra for protein identification: sequence tags, amino acids sequences, and mass lists; and it is the largest proteomics study in Xenopus laevis yet completed, which indicated a potential relationship between the mitotic spindle of dividing cells and the protein synthesis machinery. At the beginning of these experiments, the identification of proteins was conceptualized as using ?conventional? versus ?sequence-similarity? techniques, but through the course of experiments, a conceptual shift in understanding occurred along with the techniques developed and employed to encompass variations in mass spectrometry instrumentation, alternative mass spectrum representation forms, and the complexities of database resources, producing a more systematic description and utilization of available resources for the characterization of proteomes by mass spectrometry and advanced informatic approaches. The experiments demonstrated that proteomics technologies are only as powerful in the field of biology as the biochemical experiments are precise and meaningful.