Microarray technologies enable scientists to identify co-expressed genes at large scale. However, the gene expression analysis does not show functional relationships between co-expressed genes. There is a demand for effective approaches to analyse gene expression data to enable biological discoveries that can lead to identification of markers or therapeutic targets of many diseases. In cancer research, a number of gene expression screens have been carried out to identify genes differentially expressed in cancerous tissue such as Pancreatic Ductal Adenocarcinoma (PDAC). PDAC carries very poor prognosis, it eludes early detection and is characterised by its aggressiveness and resistance to currently available therapies. To identify molecular markers and suitable targets, there exist a research effort that maps differentially expressed genes to protein interactions to gain an understanding at systems level. Such interaction networks have a complex interconnected structure, whose the understanding of which is not a trivial task. Several formal approaches use simulation to support the investigation of such networks. These approaches suffer from the missing knowledge concerning biological systems. Reasoning in the other hand has the advantage of dealing with incomplete and partial information of the network knowledge. The initial approach adopted was to provide an algorithm that utilises a network-centric approach to pancreatic cancer, by re-constructing networks from known interactions and predicting novel protein interactions from structural templates. This method was applied to a data set of co-expressed PDAC genes. To this end, structural domains for the gene products are identified by using threading which is a 3D structure prediction technique. Next, the Protein Structure Interaction Database (SCOPPI), a database that classifies and annotates domain interactions derived from all known protein structures, is used to find templates of structurally interacting domains. Moreover, a network of related biological pathways for the PDAC data was constructed. In order to reason over molecular networks that are affected by dysregulation of gene expression, BioRevise was implemented. It is a belief revision system where the inhibition behaviour of reactions is modelled using extended logic programming. The system computes a minimal set of enzymes whose malfunction explains the abnormal expression levels of observed metabolites or enzymes. As a result of this research, two complementary approaches for the analysis of pancreatic cancer gene expression data are presented. Using the first approach, the pathways found to be largely affected in pancreatic cancer are signal transduction, actin cytoskeleton regulation, cell growth and cell communication. The analysis indicates that the alteration of the calcium pathway plays an important role in pancreas specific tumorigenesis. Furthermore, the structural prediction method reveals ~ 700 potential protein-protein interactions from the PDAC microarray data, among them, 81 novel interactions such as: serine/threonine kinase CDC2L1 interacting with cyclin-dependent kinase inhibitor CDKN3 and the tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2) interacting with the transmembrane protease serine 4 (TMPRSS4). These resulting genes were further investigated and some were found to be potential therapeutic markers for PDAC. Since TMPRSS4 is involved in metastasis formation, it is hypothesised that the upregulation of TMPRSS4 and the downregulation of its predicted inhibitor TFPI2 plays an important role in this process. The predicted protein-protein network inspired the analysis of the data from two other perspectives. The resulting protein-protein interaction network highlighted the importance of the co-expression of KLK6 and KLK10 as prognostic factors for survival in PDAC as well as the construction of a PDAC specific apoptosis pathway to study different effects of multiple gene silencing in order to reactivate apoptosis in PDAC. Using the second approach, the behaviour of biological interaction networks using computational logic formalism was modelled, reasoning over the networks is enabled and the abnormal behaviour of its components is explained. The usability of the BioRevise system is demonstrated through two examples, a metabolic disorder disease and a deficiency in a pancreatic cancer associated pathway. The system successfully identified the inhibition of the enzyme glucose-6-phosphatase as responsible for the Glycogen storage disease type I, which according to literature is known to be the main reason for this disease. Furthermore, BioRevise was used to model reaction inhibition in the Glycolysis pathway which is known to be affected by Pancreatic cancer.

Der probiotische Stamm E. coli Nissle 1917 ist ein Fäkalisolat, das in der Medizin traditionell zur Behandlung verschiedener gastrointestinaler Erkrankungen eingesetzt wird. Durch erfolgversprechende klinische Studien zur Remissionserhaltung bei Colitis ulcerosa, bei denen EcN als therapeutische Alternative zur Standardmedikation eingesetzt wird, ist das Interesse an den Wirkmechanismen von Probiotika stark gestiegen. EcN gehört derzeit zu den am besten untersuchten Probiotika. Einige Wirkmechanismen konnten dadurch schon aufgeklärt werden. So sind vermutlich Strukturkomponenten und stammspezifische Syntheseleistungen an der Ausprägung des probiotischen Phänotyps von EcN beteiligt. Schlüssige Konzepte, die über Gene, Genprodukte und molekulare Mechanismen den probiotischen Effekt von EcN erklären, fehlen bislang. Im Rahmen dieser Arbeit wird das Genom von EcN analysiert und auf der Basis der Genomsequenz mit anderen E. coli-Stämmen verglichen. Mit Hilfe einer Promotor-Reporter-Fusionsbibliothek (Promotorbank) werden intestinal in vivo regulierte Gene identifiziert und dadurch neue Ansätze zur Untersuchung der probiotischen Eigenschaften von EcN geschaffen. Die Grundlage für die molekulare Analyse von EcN ist die manuelle Nachannotation seines sequenzierten Genoms. Die EcN-Sequenz wird mit 13 weiteren annotierten E. coli-Sequenzen verglichen. Nach dieser Analyse kodiert EcN derzeit 121 stammspezifische Gene. Die Genomstruktur ist mit den enthaltenen genomischen Inseln und Prophagen dem Genom des uropathogenen E. coli CFT073 sehr ähnlich. Mit wenigen Ausnahmen kodiert EcN alle in E. coli CFT073 vorhandenen Virulenz- und Fitnessfaktoren, so dass auf der Nukleotidebene die nahe Verwandschaft dieser beiden Stämme bestätigt werden kann. Zudem kann gezeigt werden, dass EcN in artifiziellen Systemen wie der Zellkultur oder gnotobiotischen Mäusen ein pathogenes Potenzial hat, obgleich die Kolonisierungsfähigkeit pathogener Bakterien durch Inkubation mit EcN herabgesetzt wird. Eine wichtige Rolle bei der Besiedlung des Intestinaltrakts und der Immunstimulation von Darmepithelzellen spielt auch die globale Regulation der Genaktivität bei EcN durch den alternativen Sigma-Faktor RpoS, der im Gegensatz zu rpoS-Deletionsmutanten zu einer gesteigerten mRNA-Expression des Tight-junction Proteins ZO-1 führt. Des Weiteren führte die Untersuchung von EcN-Deletionsmutanten zu der Schlussfolgerung, dass einige genomische Inseln für Eigenschaften, die das probiotische Verhalten erklären können, eine Rolle spielen. Durch den Einsatz einer Promotorbank von EcN in konventionellen und gnotobiotischen Mäusen werden erstmalig Sequenzen von intestinal in vivo aktiven Promotoren identifiziert. Der Aufbau eines Promotor-Reportergen-Assays mit dem Biolumineszenz erzeugenden luxCDABE-Operon ermöglichte die Untersuchung ausgewählter Promotoren in vitro. Mit einem In Vivo Imaging System (IVIS) kann in weiteren Experimenten die Aktivität dieser Promotoren in lebenden Mäusen untersucht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wird gezeigt, dass EcN kein vollkommen harmloser probiotischer Stamm ist. Weitere Informationen über EcN sind dehalb wichtig für eine optimierte Anwendung als Therapeutikum. Die molekulare Analyse ist somit eine unbedingt notwendige Grundlage für weiterführende Untersuchungen der Eigenschaften von EcN, die für seinen probiotischen Charakter verantwortlich sind. / The probiotic E. coli Nissle 1917 is a fecal isolate which is traditionally used for treatment of various gastrointestinal disorders. In clinical trials where EcN was used as therapeutic alternative for remission maintenance of ulcerative colitis compared to standard medication, promising results led to an increased interest in probiotics. Today, EcN is one of the best studied probiotics. Therefore, several mechanisms of action could be enlightened. Structural components and strain-specific products are responsible for its probiotic effects. But conclusive concepts about genes, gene products and molecular mechanisms that really contribute to the probiotic character of EcN have not been offered so far. In order to create new possibilities to elucidate the probiotic traits of EcN the genome is analysed by taking this as a basis for comparison to other E. coli genomes and identification of intestinal in vivo regulated genes using a promoter-trap-library. The sequenced EcN genome is annotated and compared to 13 other so far annotated E. coli genomes. Concerning these analyses EcN encodes 121 strain-specific genes. The genome structure including the genomic islands and prophages is highly homolog to the uropathogenic E. coli CFT073. EcN encodes most of the virulence and fitness factors that are present in E. coli CFT073. Therefore, the close relationship of these two strains is confirmed at nucleotide level. Furthermore, it is shown that in artificial systems like cell culture assays and gnotobiotic mice EcN reveals a pathogenic potential although EcN is able to decrease colonization efficiency of pathogenic bacteria. The alternative sigma factor RpoS that is responsible for global regulation and activity of several genes seems to play an important role during colonization of EcN in the intestine and its immunostimulatory effects on intestinal epithelial cells. Investigation of EcN-deletion mutants lacking genomic islands and prophages lead to the conclusion that some genomic islands may play a role for specific probiotic traits. This is the first time where a promoter-trap-library was used in conventional and gnotobiotic mice for collection of intestinal in vivo active promoters. Constructing and establishing a promoter-reporter gene assay with the bioluminescent luxCDABE operon made the investigation of selected promoters in vitro possible as well as establishing a bioluminescence assay using an In Vivo Imaging System (IVIS) for investigation of promoter activity in living mice. In this research project was shown that EcN is not a completely harmless probiotic. The genome structure and regulatory mechanisms of gene expression are the strain’s molecular traits that lead to probiotic activity and immunostimulatory effects. Therefore, the molecular analyses presented here, together with the complete genome sequence, are a basis for further investigations of mechanisms that are responsible for the probiotic effects of EcN.

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden mittels molekular-zytogenetischer Methoden die chromosomalen Aberrationen in c-myc aktivierten ARFnull- und INK4a/ARFnull-Mauslymphomen untersucht. Die zytogenetischen Ergebnisse wurden mit dem Therapieverlauf der Mäuse nach Cyclophosphamid-Behandlung verglichen. In den ARFnull-Lymphomen erkannten wir den Gewinn des Chromosoms 14 als einen Marker für gute und den Gewinn des Chromosoms 6 als Marker für schlechte Behandlungserfolge. Auf den Chromosomen 6 und 14 der Maus liegen demnach bisher unbekannte Gene, welche für die Wahl der Behandlungsmethode ARF-defizienter Tumore von entscheidender Bedeutung sind. Der zweite Teil der Arbeit befaßt sich mit Common Fragile Sites (CFS), die als "hot spots" für chromosomale Brüche und Umbauten in Tumorgenese und Karyotypevolution diskutiert werden. CFSs treten als seltene Lücken im Chromatin oder als partiell deletierte bzw. rearrangierte Chromosomen auf. Ihre Zahl wird durch Zugabe von Replikations-hemmenden Chemikalen, wie Aphidicolin (APC), erheblich gesteigert. Wir untersuchten die CFS-Expression in Lymphozytenkulturen der Mausstämme BALB/c und C57BL/6. Die APC-induzierten CFS-Häufigkeiten der Chromosomenbanden wiesen im Vergleich zwischen beiden Mausstämmen eine signifikante Korrelation und damit eine starke Konservierung auf. Ebenfalls wurde zwischen Maus / Mensch-syntenischen Bereichen eine Konservierung der CFS-Häufigkeiten detektiert. Die Tendenz zur CFS-Bildung ist also ein spezifisches Merkmal jedes chromosomalen Abschnitts, das evolutionär konserviert ist. Weiterhin wurden einzelne CFSs mit molekular-zytogenetischen Methoden genauer kartiert. Auf diese Weise beschrieben wir erstmals eines der zehn häufigsten CFSs menschlicher Lymphozyten, FRA7K, und erweiterten somit die Anzahl molekular charakterisierter humaner CFSs auf insgesamt 13. Für fünf dieser CFSs analysierten wir mittels FISH-Analyse die homologen Bereiche im Mausgenom hinsichtlich ihrer CFS-Expression. Die beobachteten Läsionen traten jeweils in exakt den entsprechenden Sequenzen auf. Vereint man diese fünf Beispiele (FRA2G/Fra2D, FRA7G/Fra6A3.1, FRA7H/Fra6B1, FRA7K/Fra12C1 und FRA9E/Fra4C2) mit bekannten Homologen aus der Literatur, so wurde für insgesamt acht CFSs eine Konservierung zwischen Mensch und Maus auf molekularer Ebene gefunden. Trotz zahlreicher Untersuchungen ist der zelluläre Mechanismus, der die Ausbildung von CFSs an spezifischen Stellen des Genoms bewirkt, bis heute weitgehend unklar. Bekannt ist, daß CFSs durch Replikationsinhibition induziert werden und in Metaphase-Zellen sichtbar werden, welche DNA-Replikations-Checkpoints unterlaufen haben.Sämtliche jüngeren Studien beschrieben Inseln erhöhter DNA-Helix-Flexibilität (Schwankungen im Biegungswinkel des Moleküls) in den Bereichen von CFSs. Wir berechneten die DNA-Helix-Flexibilität entlang der Sequenz für alle molekular kartierten humanen und Maus-CFSs sowie für stabile Kontrollregionen. Anders als in der Literatur beschrieben, fanden wir für Mensch und Maus, daß sich CFSs und Kontroll-DNAAbschnitte in ihrer Dichte an Inseln mit erhöhter DNA-Helix-Flexibilität nicht unterschieden. Nahezu alle Regionen der häufigen molekular charakterisierten CFSs umfassen große Gene, deren Exons mehr als 650 kb genomische Sequenz überspannen. Im Gegensatz dazu traten große Gene in den stabilen Kontrollregionen deutlich seltener auf. Öffentlich zugängliche RNA-Expressionsdaten dieser Gene zeigten, daß CFSs bevorzugt in Bereichen mit transkriptionell aktiven, großen Genen entstehen. Darauf und auf dem Wissen aus der Literatur begründen wir die Hypothese, daß eine Blockierung der DNAReplikationsgabel, vor allem in Bereichen großer transkriptionell aktiver Gene - eventuell begründet durch deren offenere Chromatinstruktur - und das anschließende Unterlaufen von Zellzyklus-Checkpoints an der Bildung von CFSs und damit in einem Anstieg von Doppelstrangbrüchen beteiligt sind.

Functional characterization of biochemically-isolated proteins is a central task in the biochemical and genetic description of the biology of cells and tissues. Protein identification by mass spectrometry consists of associating an isolated protein with a specific gene or protein sequence in silico, thus inferring its specific biochemical function based upon previous characterizations of that protein or a similar protein having that sequence identity. By performing this analysis on a large scale in conjunction with biochemical experiments, novel biological knowledge can be developed. The study presented here focuses on mass spectrometry-based proteomics of organisms with unsequenced genomes and corresponding developments in biological sequence database searching with mass spectrometry data. Conventional methods to identify proteins by mass spectrometry analysis have employed proteolytic digestion, fragmentation of resultant peptides, and the correlation of acquired tandem mass spectra with database sequences, relying upon exact matching algorithms; i.e. the analyzed peptide had to previously exist in a database in silico to be identified. One existing sequence-similarity protein identification method was applied (MS BLAST, Shevchenko 2001) and one alternative novel method was developed (MultiTag), for searching protein and EST databases, to enable the recognition of proteins that are generally unrecognizable by conventional softwares but share significant sequence similarity with database entries (~60-90%). These techniques and available database sequences enabled the characterization of the Xenopus laevis microtubule-associated proteome and the Dunaliella salina soluble salt-induced proteome, both organisms with unsequenced genomes and minimal database sequence resources. These sequence-similarity methods extended protein identification capabilities by more than two-fold compared to conventional methods, making existing methods virtually superfluous. The proteomics of Dunaliella salina demonstrated the utility of MS BLAST as an indispensable method for characterization of proteins in organisms with unsequenced genomes, and produced insight into Dunaliella?s inherent resilience to high salinity. The Xenopus study was the first proteomics project to simultaneously use all three central methods of representation for peptide tandem mass spectra for protein identification: sequence tags, amino acids sequences, and mass lists; and it is the largest proteomics study in Xenopus laevis yet completed, which indicated a potential relationship between the mitotic spindle of dividing cells and the protein synthesis machinery. At the beginning of these experiments, the identification of proteins was conceptualized as using ?conventional? versus ?sequence-similarity? techniques, but through the course of experiments, a conceptual shift in understanding occurred along with the techniques developed and employed to encompass variations in mass spectrometry instrumentation, alternative mass spectrum representation forms, and the complexities of database resources, producing a more systematic description and utilization of available resources for the characterization of proteomes by mass spectrometry and advanced informatic approaches. The experiments demonstrated that proteomics technologies are only as powerful in the field of biology as the biochemical experiments are precise and meaningful.